Micro-122慢病毒抑制星狀細(xì)胞-T6上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變

程變巧，朱 琪*，王麗惠，洪發(fā)項(xiàng)，林偉國(guó)

（廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院肝膽內(nèi)科，福建 福州 350007）

·論 著·

Micro-122慢病毒抑制星狀細(xì)胞-T6上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變

程變巧，朱 琪*，王麗惠，洪發(fā)項(xiàng)，林偉國(guó)

（廈門大學(xué)附屬福州市第二醫(yī)院肝膽內(nèi)科，福建 福州 350007）

目的初步探討Micro -122對(duì)肝星狀細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響。方法把Mirc0-122/GV369慢病毒載體轉(zhuǎn)染TGF-β1刺激的肝星狀細(xì)胞系T6后，熒光顯微鏡和QRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，QRT-PCR和免疫印跡分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后E-Cadherin以及a-SMA的RNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果轉(zhuǎn)染Mirc0-122/GV369慢病毒載體的肝星狀細(xì)胞系T6內(nèi)顯示明顯的綠色熒光，Mirc0-122顯示了上調(diào)表達(dá)。E-cadherin在mRNA和蛋白水平都顯示上調(diào)表達(dá)，相反a-SMA顯示了下調(diào)表達(dá)，與對(duì)照組相比，P＜0.05。結(jié)論Mirco-122在肝星狀細(xì)胞的表達(dá)上調(diào)可抑制肝星狀細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變，有望作為肝纖維化的靶向抑制指標(biāo)。

Micro-122；肝星狀細(xì)胞；肝纖維化；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變

肝纖維是各種肝病發(fā)展的必經(jīng)階段，然而目前關(guān)于肝纖維化的干預(yù)手段還沒有明顯的作用。尋找肝纖維化的預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療評(píng)估指標(biāo)可望改善肝纖維化的發(fā)展，提高檢測(cè)水平。

最近研究認(rèn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變參與肝纖維化過程，在這一過程中可出現(xiàn)代表上皮成分的E-cadherin表達(dá)下調(diào)，代表間質(zhì)成分的a-SMA等表達(dá)上調(diào)[1-2]。抑制肝星狀細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變可有望阻止肝纖維化的發(fā)展[3-4]。MicroRNA（Micro）是一類內(nèi)生的、在進(jìn)化上高度保守的長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，是肝臟特異性miRNA，參與肝細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[5]。目前有研究認(rèn)為Micro可能抑制肝星狀細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變從而抑制肝纖維化的發(fā)展。因此本課題擬研究MicroRNA-122作用于活化的肝星狀細(xì)胞后對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變的影響，以此初步探討MicroRNA-122是否可作為肝纖維化的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

MicroRNA-122慢病毒載體（15993-1）由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，載體元件順序?yàn)閁bi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin，滴度為4×108TU/ml，克隆位點(diǎn)為AgeI/ NheI，合成的microRNA-122基因序列（5'-3'），胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京Vazyme公司）；熒光定量試劑盒（美國(guó)Genecopoeia公司）；引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成并測(cè)序；單克隆兔抗人α-SMA（ab5694 abcam）、單克隆鼠抗人E-cadherin（ab76055 abcam）；HRP標(biāo)記羊抗小鼠或抗兔IgG、FITC標(biāo)志的羊抗兔IgG（EMAR公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀及凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠HSC-T6株由福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院施紅教授惠贈(zèng)，用含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h更換1次培養(yǎng)液，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶的70%～80%時(shí)傳代1次。

1.3 試驗(yàn)方法

qRT-PCR法檢測(cè)MicroRNA-122、E-cadherin mRNA和α-SMA表達(dá)量 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理方法同細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，培養(yǎng)24 h后，Trizol試劑提取兩組細(xì)胞的總RNA，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性，計(jì)算OD260 nm/OD280 nm比值檢驗(yàn)RNA純度在1.8～2.2間再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按95℃ 5 min預(yù)變性，95℃ 10 min，60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。采用引物序列為：E-cadherin上游：5'-GCTCGCTGAACTCCTCTGA-3'，下游：5'-TCGCCGCCACCATACATA；miR-122序列為5'-GCTGTGGAGTGTGACAATGGTG-3'；U6（F）為5'-CGCTTCGGCAGCACATATACT-3'，U6（R）為5'-GAATTTGCGTGTCATCCTTGC-3'，α-SMA 上游引物：5'-CCACTGCTGCTTCCTCTTC-3'，下游引物：5'-CGCCGACTCCATTCCAAT-3'.GAPDH上游：5'-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'，下游：5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC；采用RQ=2-ΔΔCt來計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法檢測(cè)E-cadherin和a-SMA蛋白表達(dá)

以每孔30×104個(gè)細(xì)胞接種于六孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)12h后換液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中作用72 h，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加適量裂解液（RIPA:PMSF=100:1），冰上裂解30 min，轉(zhuǎn)移至EP管，4℃、12000 rpm離心15 min后取上清；用50 μg/泳道的蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉60 min，加入兔抗人E-cadherin和a-SMA（1:1000）、GAPDH（1:2000），4℃搖床孵育過夜，用TBST洗膜10 min×3次，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠或抗兔IgG（1:2000）于室溫孵育1 h，再次用TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光并顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光和PCR技術(shù)觀察mic-122慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率以及表達(dá)情況

熒光相差顯微鏡觀察到miR-122轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都出現(xiàn)明亮的熒光，部分肝星狀細(xì)胞的胞核的熒光亮度強(qiáng)于胞質(zhì)（圖1A，1B），兩圖重疊后觀察轉(zhuǎn)染效率約80%，說明microRNA-122慢病毒載體在肝星狀細(xì)胞-T6細(xì)胞系中成功轉(zhuǎn)染。QRT-PCR結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染組microRNA-122 mRNA表達(dá)量（4.92±0.09）明顯高于陰性載體轉(zhuǎn)染組（1.21±0.08）和空白對(duì)照組（1±0.11），組間比較，F(xiàn)=7.127（圖2）。

圖1 HSC-T6在ENI.S.條件下的miR122轉(zhuǎn)染結(jié)果，MOI=10 A圖：轉(zhuǎn)染miR-122慢病毒載體前肝星狀細(xì)胞；B圖：轉(zhuǎn)染miR-122慢病毒載體后肝星狀細(xì)胞免疫熒光染色

圖2 QRT-PCR檢測(cè)microRNA-122 在轉(zhuǎn)染microRNA-122慢病毒載體的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)

2.2 Mic-122慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后可顯著上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，而下調(diào)a-SMA的表達(dá)

為了研究micro-122對(duì)激活的肝星狀細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變是否有抑制作用，我們首先從基因水平對(duì)代表上皮成分的E-Cadherin和代表間質(zhì)成分的a-SMA進(jìn)行觀察分析，結(jié)果顯示，在Mic-122慢病毒載體轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞組，E-Cadherin表達(dá)（2.73±0.16 ）與空質(zhì)粒組（1.17±0.12）和空白對(duì)照組（1±0.20）相比，表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，而a-SMA在轉(zhuǎn)染組表達(dá)（0.21±0.13）與空質(zhì)粒組（0.92±0.12）和空白對(duì)照組（1±0.20）相比，表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)。F值分別為16.208和7.145，組間比較，P＜0.05。這初步說明，micro-122在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)可以抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變。

圖3 Qt-PCR檢測(cè)microRNA-122慢病毒轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后E-cadherin和a-SMA的表達(dá)情況。A圖： E-cadherin在慢病毒轉(zhuǎn)染后表達(dá)。B圖：a-SMA在慢病毒轉(zhuǎn)染后表達(dá)

2.3 免疫印跡觀察

發(fā)現(xiàn)microRNA-122慢病毒轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后可上調(diào)E-Cadherin，下調(diào)a-SMA蛋白的表達(dá)。從蛋白角度進(jìn)一步說明了Micro-122上調(diào)表達(dá)可以抑制肝星狀細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變。

a-SMA在正常肝星狀細(xì)胞組的相對(duì)表達(dá)量為0.96±0.12，在陰性載體組的相對(duì)表達(dá)量為0.88±0.14，而miR-122轉(zhuǎn)染組蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.21±0.07，組間比較，F(xiàn)=7.145，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05）。而E-cadherin在正常肝星狀細(xì)胞組的相對(duì)表達(dá)量為0.36±0.11，在陰性載體組的相對(duì)表達(dá)量為0.41±0.13，而在轉(zhuǎn)染組蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.87±0.07，組間比較，F(xiàn)=10.145，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（P＜0.05）

圖4 免疫印跡觀察E-cadherin蛋白和a-SMA在轉(zhuǎn)染microRNA-122慢病毒載體的肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。圖A：a-SMA在不同處理肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。圖B：E-cadherin在不同處理肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)。

3 討 論

肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化、肝硬化發(fā)展的主要原因，選擇有效的阻斷肝纖維化發(fā)展，也就是說抑制肝星狀細(xì)胞的活化和增殖是阻斷肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵。上皮間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化一直認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞特有的特點(diǎn)。最近相序在腎纖維化、肺纖維化以及腹膜纖維組織中均顯示有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特點(diǎn)[3-4]。畢婉蓉[6]通過CCL4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中觀察到代表上皮成分的E-鈣粘附素的表達(dá)下調(diào)，代表間質(zhì)成分的α-SMA表達(dá)上調(diào)，直接說明肝纖維化中也存在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

我們課題組前期試驗(yàn)用TGF-β1刺激肝星狀細(xì)胞的活化，發(fā)現(xiàn)在激活的肝星狀細(xì)胞中代表上皮成分的E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)-actin熒光聚集形成粗大的應(yīng)力纖維絲，沿細(xì)胞長(zhǎng)軸成束狀樣分布，而代表間質(zhì)成分的a -SMA以及vimentin、N-Cadherin等明顯上調(diào)。這也進(jìn)一步說明了肝星狀細(xì)胞可以發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變。EMT是一個(gè)動(dòng)態(tài)的可逆過程，以EMT為靶標(biāo)的抗纖維化治療，有望成為肝纖維化臨床治療的一個(gè)新策略。

Micro是一類內(nèi)生的、在進(jìn)化上高度保守的長(zhǎng)約20～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，是肝臟特異性miRNA，參與肝細(xì)胞生長(zhǎng)代謝和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[4-5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA在肝纖維化進(jìn)程中差異表達(dá)。如現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的miR-199a，miR-199a*，miR-200a和miR-200b在CCl4所致肝纖維化動(dòng)物肝組織與人的肝纖維化組織中均差異性表達(dá)，并且與肝纖維化分級(jí)顯著相關(guān)[7-8]。miR-122是最早發(fā)現(xiàn)的組織特異性表達(dá)的microRNA之一，它在肝臟中特異性表達(dá)，約占了所有肝臟表達(dá)的microRNAs的70%[9-10]。

本課題通過構(gòu)建Micro-122慢病毒載體并成功轉(zhuǎn)染活化的肝星狀細(xì)胞，觀察Micro-122對(duì)肝星狀細(xì)胞上皮間質(zhì)調(diào)控的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論從基因水平和蛋白水平，均發(fā)現(xiàn)E-cadherin在慢病毒載體轉(zhuǎn)染組的表達(dá)明顯高于在空質(zhì)粒組和空白對(duì)照組的表達(dá)。而a-SMA的表達(dá)呈下調(diào)表達(dá)，這說明micro-122可以抑制肝星狀細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變。

通過上述實(shí)驗(yàn)，我們只是初步探討了micro-122對(duì)肝星狀細(xì)胞上皮間質(zhì)的調(diào)控作用。Micro-122如何調(diào)控肝星狀的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變還需要深入的研究。因?yàn)楦涡菭罴?xì)胞激活后的調(diào)控不會(huì)是單一的調(diào)控，往往是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)相互作用，相互制約，因此進(jìn)一步完善micro-122在肝纖維化中的調(diào)控作用有望成為阻斷肝纖維化發(fā)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

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Inhibition of epithelial mesenchymal transition of hepatic stellate cells T-6 by micro-122 lentiviral vector

CHENG Bian-qiao, ZHU Qi, WANG Li-hui, HONG Fa-xiang, LIN Wei-guo
(The Second Hospital of Fuzhou Affiliated Xiamen University,Fujian Fuzhou 350007,China)

ObjectivePreliminary discussing the influence of micro-122 on the epithelial mesenchymal transition of hepatic stellate cells T-6.MethodsWe transfect Micro-122/GV369 lentiviral vector into hepatic stellate cells line T6 stimulated by TGF - beta 1,fluorescent microscope was used to transfection sfficiency, QRT-PCR was used to detect expression of Micro-122 mRNA、E-cadherin mRNA and a-SMA mRNA .The protein expression bouth E-cadherin and a-SMA were tested by Western blot.ResultsThere was obviously showing green fluorescence in Micro-122/T6 GV369 lenti viral vector, the nucleotide expressions of Micro-122、E-Cadherin in hepatic stellate cells transfected Micro-122/T6 GV369 lentiviral vector were higher than in control groups.But the expression of a-SMA was obvious down-regulation companying with two control groups,P＜0.05. The result of Western blot was showed up-regulation of E-Cadherin but down-regulation of a-SMA in hepatic stellate cells transfected Micro-122/T6 GV369 lentiviral vector .there was statistical significanceP＜0.05.ConclusionThe up-regulation expression of Micro-122 in hepatic stellate cells could inhibit its epithelial mesenchymal transition,which was a therapeutic target of hepatic fibrosis.

Micro-122; hepatic stellate cells; Hepatic fibrosis; Epithelial mesenchymal transition

R575.2

A

ISSN.2095-8242.2017.38.7327.03

福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（NO.：2014-S-137-1，2014-S-137-5）；福建省科技廳引導(dǎo)性項(xiàng)目（NO.：2015D002）

朱琪

本文編輯：吳玲麗