海洋地衣芽孢桿菌的絮凝活性研究及機理探討

楊 波，司曉光，郝建安，張愛君，姜天翔，杜 瑾，王 靜

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

海洋地衣芽孢桿菌的絮凝活性研究及機理探討

楊 波，司曉光，郝建安，張愛君，姜天翔，杜 瑾，王 靜*

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

以海洋地衣芽孢桿菌DHS-40為絮凝劑產(chǎn)生菌，通過定性測試鑒定所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分，采用程控混凝實驗六聯(lián)攪拌儀和重力沉降法評價其絮凝穩(wěn)定性，通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡表征微生物絮凝劑和絮凝顆粒的微觀形貌，并初步探討了微生物絮凝劑的絮凝機理。結(jié)果表明，海洋地衣芽孢桿菌DHS-40所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分為多糖和蛋白質(zhì)的混合物；當(dāng)微生物絮凝劑投加量為0.05 g·L-1、環(huán)境pH值為4.0～8.0、環(huán)境溫度為0～50 ℃時，絮凝活性達80%以上；絮凝活性基本不受環(huán)境pH值的影響，但在堿性較強(pH>8.0)時絮凝活性迅速下降，在pH值為10.0時完全喪失；微生物絮凝劑呈鏈狀結(jié)構(gòu)，且有深淺不等的溝回；絮凝顆粒呈層疊結(jié)構(gòu)。微生物絮凝劑依靠電荷吸附和橋聯(lián)作用帶動水中的渾濁物共同沉降，從而達到凈化水體的目的。

海洋地衣芽孢桿菌；微生物絮凝劑；絮凝活性；絮凝機理；橋聯(lián)作用；電荷吸附

微生物絮凝劑(microbial flocculants，MBF)是利用生物技術(shù)培養(yǎng)絮凝微生物時產(chǎn)生的能使水體中懸浮的固體顆粒、膠體粒子及菌體細胞等凝集、沉淀的天然有機高分子聚合物[1-3]，其絮凝活性成分主要是多糖、蛋白質(zhì)、糖蛋白、粘多糖、纖維素以及少量的脂類和核酸等微生物次生代謝產(chǎn)物，分子量約為幾十萬以上[4-5]。微生物絮凝劑安全、無毒、易降解、無二次污染、便于固液分離[6]，廣泛應(yīng)用于水處理、食品加工、化工、生物制藥等領(lǐng)域。隨著各類先進技術(shù)手段的廣泛應(yīng)用，微生物絮凝劑的絮凝活性被廣泛研究、活性成分逐步被探知、絮凝微生物的培養(yǎng)條件不斷被優(yōu)化。絮凝微生物種類繁多、分布廣泛、易于分離篩選，只在特定的生長階段產(chǎn)生絮凝活性物質(zhì)。微生物絮凝劑的絮凝特性各異，絮凝能力主要由微生物的分泌能力和絮凝活性特異產(chǎn)物的性質(zhì)決定，絮凝效果除受自身發(fā)酵條件影響外，也與絮凝劑對水體顆粒物的吸附作用有關(guān)[7]。

目前，有關(guān)微生物絮凝劑及絮凝顆粒微觀形貌的報道還不多，且缺乏直觀的檢測手段證明微生物絮凝劑具有較強的吸附和沉降能力。因此，作者以具有強絮凝特性的海洋地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DHS-40為研究對象，對其絮凝活性成分進行鑒定，評價其絮凝穩(wěn)定性，通過掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡分別對微生物絮凝劑和絮凝顆粒的微觀形貌進行表征，并初步探討了絮凝機理，擬為微生物絮凝劑的進一步研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株與培養(yǎng)基

海洋地衣芽孢桿菌DHS-40，來源于天津塘沽海河入?？谖勰鄻悠罚蓢液Ｑ缶痔旖蚝Ｋc綜合利用研究所海水凈化與水再利用技術(shù)研究室保存。

LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂粉1.5%～2.0%，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，121 ℃高溫蒸汽滅菌20 min。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆油0.49%，豆粕水解液5.0 g·L-1，磷酸二氫鉀0.2 g·L-1，氯化鈣溶液(7.5 g·L-1)26 μL·L-1，硫酸錳溶液(2.0 g·L-1)260 μL·L-1，硫酸亞鐵溶液(2.0 g·L-1)100 μL·L-1。

1.2 微生物絮凝劑的制備

取-80 ℃保存的DHS-40菌株，于LB固體培養(yǎng)基上劃線活化培養(yǎng)，30 ℃?zhèn)鞔罨?次。挑取單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)72 h。將培養(yǎng)物繼續(xù)接種至優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液5 000 r·min-1離心5 min，去除菌體細胞。上清液加入硫酸銨(分析純)形成飽和溶液，冰浴靜置3 h以上。于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。取沉淀，溶于水后噴霧干燥，即得微生物絮凝劑粉末。

1.3 絮凝活性的測定

取高嶺土(化學(xué)純)4.0 g加至盛有1 000 mL蒸餾水的燒杯中，置于六聯(lián)攪拌儀上進行絮凝實驗。絮凝實驗分為3個階段：(1)快速混合階段：轉(zhuǎn)速200 r·min-1，持續(xù)2 min，使高嶺土在水中充分混勻，停止攪拌前添加0.05 g·L-1微生物絮凝劑；(2)反應(yīng)階段：轉(zhuǎn)速30 r·min-1，持續(xù)20 min，使微生物絮凝劑在低轉(zhuǎn)速水體中充分發(fā)揮作用；(3)靜置階段：攪拌停止后，使絮凝顆粒靜置沉降15 min，吸取頂部上清液，測定剩余濁度。

1.4 絮凝活性有效成分的鑒定

將微生物絮凝劑粉末配制成10 g·L-1的活性溶液，分別進行糖類呈色反應(yīng)(Molish反應(yīng)、蒽酮反應(yīng)、Seliwanoff反應(yīng)、Benedict反應(yīng))、蛋白質(zhì)類呈色反應(yīng)(雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng))和脂類呈色反應(yīng)(蘇丹Ⅲ染色實驗)，鑒定微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分。

1.5 絮凝穩(wěn)定性評價

在微生物絮凝劑投加量為0.05 g·L-1的情況下，采用單因素實驗，分別考察環(huán)境pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和環(huán)境溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃)對微生物絮凝劑的絮凝活性的影響。

1.6 微生物絮凝劑和絮凝顆粒的微觀形貌表征

將微生物絮凝劑粉末粘貼在樣品臺上，經(jīng)噴金處理后，于掃描電子顯微鏡下觀察其微觀形貌。

將高嶺土懸浮液和絮凝顆粒分別涂布于樣品臺上，采用原子力顯微鏡輕敲模式(tapping mode)觀察絮凝前后高嶺土及絮凝顆粒的微觀形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分

分別對微生物絮凝劑進行糖類呈色反應(yīng)、蛋白質(zhì)類呈色反應(yīng)、脂類呈色反應(yīng)，以鑒定其絮凝活性有效成分，結(jié)果見表1。

由表1可知，微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分為多糖和蛋白質(zhì)的混合物，且不含脂類成分。

2.2 微生物絮凝劑的絮凝穩(wěn)定性評價

不同微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分不同，其絮凝穩(wěn)定性也不同。海洋地衣芽孢桿菌DHS-40所產(chǎn)的微生物絮凝劑主要活性成分為多糖和蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)受環(huán)境pH值和環(huán)境溫度的影響較大，因此，下面分別考察環(huán)境pH值和環(huán)境溫度對絮凝活性的影響，以評價DHS-40所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝穩(wěn)定性。

表1絮凝活性有效成分鑒定結(jié)果

Tab.1Identificationresultsofflocculationactivecomponents

反應(yīng)結(jié)果糖類呈色反應(yīng)Molish反應(yīng)+蒽酮反應(yīng)+Seliwanoff反應(yīng)+Benedict反應(yīng)-蛋白質(zhì)類呈色反應(yīng)雙縮脲反應(yīng)(+)茚三酮反應(yīng)+脂類呈色反應(yīng)蘇丹Ⅲ染色實驗-

注：“+”表示陽性，“(+)”表示弱陽性，“-”表示陰性。

2.2.1 環(huán)境pH值對絮凝活性的影響(圖1)

圖1 環(huán)境pH值對絮凝活性的影響Fig.1 The effect of environmental pHvalue on flocculation activity

從圖1可以看出，在環(huán)境pH值為4.0～8.0時，微生物絮凝劑的絮凝活性幾乎不受酸堿度的影響，絮凝活性均保持在90%以上；當(dāng)環(huán)境pH值大于8.0時，絮凝活性迅速下降；環(huán)境pH值為10.0時，喪失全部活性。這是因為，酸性條件下，帶有正電荷的陽離子有利于絮凝劑與懸浮顆粒間的吸附與架橋，促進絮凝反應(yīng)，加速礬花的生成和沉降；而當(dāng)環(huán)境pH值升高時，引入大量帶有負電荷的陰離子，導(dǎo)致懸浮顆粒間的排斥力增強，阻礙絮凝顆粒的吸附沉降，導(dǎo)致絮凝效率大幅下降，濁度迅速升高。因此推斷，帶有正電荷的陽離子可以促進絮凝反應(yīng)的進行，帶有負電荷的陰離子會導(dǎo)致絮凝活性有效成分蛋白質(zhì)的變性失活以及絮凝顆粒間排斥力的增強，從而降低絮凝活性。

2.2.2 環(huán)境溫度對絮凝活性的影響(圖2)

從圖2可以看出，絮凝活性基本不受環(huán)境溫度的影響。當(dāng)環(huán)境溫度為0 ℃時，由于反應(yīng)體系為冰水混合物，導(dǎo)致絮凝反應(yīng)的礬花形成和沉降受到一定影響，絮凝活性略有下降，約為80%；而當(dāng)環(huán)境溫度超過0 ℃后，絮凝活性均在90%以上。

圖2 環(huán)境溫度對絮凝活性的影響Fig.2 The effect of environmental temperatureon flocculation activity

綜上，微生物絮凝劑的絮凝穩(wěn)定性很好，絮凝能力強，其絮凝活性基本不受環(huán)境溫度的影響，并且在酸性、中性及弱堿性條件下都十分穩(wěn)定，因此其儲存與應(yīng)用都十分便捷。

2.3 微生物絮凝劑的微觀形貌(圖3)

a～d的放大倍數(shù)分別為：500、1000、2000、4000

從圖3可以看出，微生物絮凝劑主要呈鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈狀結(jié)構(gòu)上有深淺不等的溝回。推斷其主要依靠鏈狀結(jié)構(gòu)上的離子進行電荷吸附發(fā)揮絮凝沉降作用，從而帶動水中的渾濁物共同沉降，達到凈化水體的目的。

2.4 絮凝顆粒的微觀形貌

高嶺土懸浮液在添加微生物絮凝劑前后的微觀形貌如圖4所示。

圖4 高嶺土懸浮液添加微生物絮凝劑前(a)后 (b)的原子力顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 AFM images of kaolin suspension before(a) and after(b) adding microbial flocculant

從圖4可以看出，高嶺土懸浮顆粒十分松散，分子形貌呈扁平狀，基本無交疊；添加微生物絮凝劑后，絮凝顆粒的比表面積明顯增大，呈多層次交疊連接的復(fù)雜立體結(jié)構(gòu)。此外，由于高嶺土懸浮顆粒十分微小，激烈的布朗運動能夠阻止其本身重力作用導(dǎo)致的沉降，從而引起水體的渾濁；加入微生物絮凝劑后，由于絮凝劑較強的吸附能力，高嶺土懸浮顆粒通過電荷吸附以絮凝劑為核心包裹在其表面，再通過電荷吸附、架橋連接等相互作用形成結(jié)構(gòu)緊密而龐大的穩(wěn)定膠體，進而從水體中分離沉淀。

2.5 絮凝機理探討

絮凝是十分復(fù)雜的過程，傳統(tǒng)絮凝劑的作用機理主要有吸附橋聯(lián)作用、電性中和作用、卷掃作用、基團反應(yīng)、沉析物網(wǎng)捕作用等[8-12]。目前普遍認為，無機絮凝劑以電性中和作用為主，陽離子有機高分子絮凝劑以吸附橋聯(lián)及電性中和作用為主，陰離子有機高分子絮凝劑以吸附橋聯(lián)作用為主[13]。微生物絮凝劑的作用機理則更為復(fù)雜，主要原因是微生物絮凝劑是微生物在特定生長階段分泌的生物高分子活性產(chǎn)物，不同微生物的性質(zhì)和生長環(huán)境不盡相同，且微生物絮凝劑的成分復(fù)雜多樣，提純步驟較為繁瑣。因此，研究者提出了多種特定環(huán)境下的絮凝機理，主要有莢膜學(xué)說、菌體外纖維素纖絲學(xué)說、電性中和學(xué)說、疏水學(xué)說和胞外聚合物架橋?qū)W說等[3]。

傳統(tǒng)的水處理理論將天然水體中的各類膠體顆粒簡化成均勻?qū)ΨQ的球狀。但實際情況是，水體中的各類膠體顆粒具有不同的大小、性狀及厚度，且其表面電荷分布不均，勢必會對膠體的絮凝特性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致絮凝機理更加復(fù)雜。因此，單一的絮凝機理不能解釋所有的微生物絮凝現(xiàn)象。本實驗從海洋地衣芽孢桿菌DHS-40中分離提取到的微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分是多糖和蛋白質(zhì)混合物，具有良好的穩(wěn)定性和適用性?？梢酝ㄟ^橋聯(lián)、電荷吸附等作用形成復(fù)雜而穩(wěn)定的立體絮網(wǎng)結(jié)構(gòu)，明顯改變水體中渾濁物的微觀形貌，使得離散的懸浮顆?；ハ嗾掣?，進而膠體脫穩(wěn)，生成絮體沉淀從反應(yīng)體系中分離，達到凈化水體的目的。

3 結(jié)論

海洋地衣芽孢桿菌DHS-40所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝活性有效成分為多糖和蛋白質(zhì)的混合物。在投加量為0.05 g·L-1、環(huán)境pH值為4.0～8.0、環(huán)境溫度為0～50 ℃時，微生物絮凝劑的絮凝活性可達80%以上，當(dāng)水體環(huán)境堿性增強(pH值>8.0)時絮凝活性迅速下降直至消失。微生物絮凝劑呈鏈狀結(jié)構(gòu)，且有深淺不等的溝回，絮凝顆粒呈層疊結(jié)構(gòu)。微生物絮凝劑依靠電荷吸附和橋聯(lián)作用帶動水體中的渾濁物共同沉降，達到凈化水體的目的。

[1] SUN J,ZHANG X H,MIAO X J,et a1.Preparation and characteristics of bioflocculants from excess biological sludge[J].Bioresource Technology,2012,126:362-366.

[2] YOU Y,REN N Q,WANG A J,et a1.Use of waste fermenting liquor to produce bioflocculants with isolated strains[J].International Journal of Hydrogen Energy,2008,33(13):3295-3301.

[3] SALEHIZADEH H,SHOJAOSADATI S A.Extracellular biopolymeric flocculants:recent trends and biotechnological importance[J].Biotechnology Advances,2001,19(5):371-385.

[4] 康建雄,白云山.水處理絮凝劑的開發(fā)與應(yīng)用[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(城市科學(xué)版),2004，21(2):23-25.

[5] 周曉鐵,韓昭,孫世群,等.微生物絮凝劑的應(yīng)用研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015，43(32):107-108,114.

[6] 郝建安,楊波,姜天翔,等.常壓室溫等離子體誘變選育微生物絮凝劑高產(chǎn)菌株[J].生物技術(shù)通訊,2015,26(6):805-808.

[7] 常玉廣,馬放,施雪華,等.原子力顯微鏡觀測絮凝劑與高嶺土懸浮液的微觀吸附形貌[J].中國造紙學(xué)報,2007,22(4):71-75.

[8] LEVY N，BAR-OR Y,MAGDASSI S.Flocculation of bentonite particles by a cyanobacterial bioflocculant[J].Colloids and Surfaces,1990,48:337-349.

[9] 鄧述波,余剛,蔣展鵬,等.微生物絮凝劑MBFA9的絮凝機理研究[J].水處理技術(shù),2001,27(1):22-25.

[10] 孔令軍.生物絮凝劑的研究與應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué)與管理,2011,36(2):71-74.

[11] 李桂嬌,尹華,彭輝.生物絮凝劑的研究與開發(fā)[J].工業(yè)水處理,2002,22(3):9-12.

[12] 馬放,段姝悅,孔祥震,等.微生物絮凝劑的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢[J].中國給水排水,2012,28(2):14-17.

[13] 羅平.RL-2生物絮凝劑的研制及絮凝機理研究[D].重慶:重慶大學(xué),2005.

FlocculationActivityandMechanismofMarineBacilluslicheniformis

YANG Bo,SI Xiao-guang,HAO Jian-an,ZHANG Ai-jun,JIANG Tian-xiang,DU Jin,WANG Jing*

(InstituteofSeawaterDesalinationandMultipurposeUtilization,SOA,Tianjin300192,China)

Using marineBacilluslicheniformisDHS-40 as a flocculant-producing strain,we determined the active components of microbial flocculant by a qualitative experiment,evaluated flocculation stability by a six-combined agitator for program-controlled coagulation test and a gravity sedimentation method,characterized microscopic morphologies of microbial flocculant and flocculant particles by scanning electron microscope and atomic force microscope,and discussed flocculation mechanism.Results indicated that the active components of microbial flocculant of marineBacilluslicheniformiswere mixture of polysaccharides and proteins.The flocculation activity was above 80% when microbial flocculant dosage was 0.05 g·L-1,environmental pH value was 4.0～8.0,and environmental temperature was 0～50 ℃.Environmental pH value hardly affect the flocculation activity,however,the flocculation activity decreased rapidly under the alkaline environment(pH>8.0),and lost all when pH value was 10.0.The morphology of microbial flocculant possessed a chain structure with different depths and channels.The morphology of flocculant particles presented a stacked structure.Depended on charge adsorption and bridging action,microbial flocculant was settled together with the turbidity of water,thus achieved the goal of purifying water body.

Bacilluslicheniformis;microbial flocculant;flocculation activity;flocculation mechanism;bridging action;charge adsorption

TQ314.253 X703

A

1672-5425(2017)10-0040-04

海洋公益性行業(yè)科研專項項目(201405017-04)，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(K-JBYWF-2016-G10)，中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(K-JBYWF-2017-T08)

2017-05-19

楊波(1982-)，女，河北人，工程師，研究方向：海洋微生物技術(shù)，E-mail：yangbo82@21cn.com；通訊作者：王靜，教授級高級工程師，E-mail：Wang_nana@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.009

楊波，司曉光，郝建安，等.海洋地衣芽孢桿菌的絮凝活性研究及機理探討[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(10)：40-43.