• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    固定化細(xì)胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯工藝研究

    2017-11-01 07:43:17陳孝鵬王亞軍
    關(guān)鍵詞:戊二醛硅藻土亞胺

    陳孝鵬,沈 煒,王亞軍

    浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室,浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310032

    固定化細(xì)胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯工藝研究

    陳孝鵬,沈 煒,王亞軍

    浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室,浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310032

    采用硅藻土作載體,聚乙烯亞胺和戊二醛作交聯(lián)劑來固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表達(dá)菌株,以此來催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2],考察了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞的催化性能,進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。結(jié)果表明:在固定化細(xì)胞用量100 g/L、葡萄糖與底物質(zhì)量濃度比為1:1、轉(zhuǎn)化溫度30℃、pH 7.0、流速12 mL/min、100 g/L的(5R)-1轉(zhuǎn)化完全的條件下,填充床式反應(yīng)器可以連續(xù)反應(yīng)五個批次,轉(zhuǎn)化570 g/L的(5R)-1,較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%,較游離細(xì)胞間歇催化操作提高了185%。

    6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 羰基還原酶 固定化

    阿托伐他汀鈣是一種對膽固醇合成中關(guān)鍵性限速酶 HMG-CoA還原酶具有強烈的競爭性抑制作用的藥物,能有效地降低膽固醇的含量,降低心血管疾病的風(fēng)險[1]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]是阿托伐他汀鈣合成的重要手性砌塊[2]。相較于化學(xué)合成法的苛刻反應(yīng)條件,生物法合成手性藥物具有明顯的優(yōu)勢,其立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、對生產(chǎn)設(shè)備的要求低,大大降低了生產(chǎn)成本[3,4]。

    羰基還原酶是一類能夠不對稱催化前手性酮還原為光學(xué)醇的酶[5]。肖黎等[6]構(gòu)建了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,開發(fā)了雙酶共表達(dá)菌株全細(xì)胞催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成(3R,5R)-2的工藝(圖 1),游離E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr全細(xì)胞最高可以催化200 g/L (5R)-1完全轉(zhuǎn)化,產(chǎn)物差向異構(gòu)體過量(d.e.p)值大于99.5%。但游離細(xì)胞催化工藝的酶和輔酶只能使用一次,存在轉(zhuǎn)化液容易乳化、下游分離難度大等缺陷[7,8]。

    圖1 共表達(dá)菌株催化合成(3R,5R)-2Fig.1 Schematic illustration of (5R)-1 bioreduction to (3R,5R)-2 synthesis catalyzed by E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr

    針對游離細(xì)胞催化工藝的缺陷,本研究選擇硅藻土作為載體,采用交聯(lián)劑聚乙烯亞胺和戊二醛固定E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞,考察了固定化細(xì)胞的催化性能,進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建[6]、保藏;(5R)-1(質(zhì)量含量約68%)由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈;(3R,5R)-2購自Toronto Research Chemicals Inc.(多倫多,加拿大);卡那霉素購自TaKaRa公司;50%聚乙烯亞胺購自上海晶純生化科技股份有限公司;25%戊二醛購自天津阿法埃莎化學(xué)有限公司;硅藻土購自溫州化學(xué)材料廠;其它試劑均為市售分析純。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    種子液培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基中挑取一接種環(huán)的菌落接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,搖瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)8~10 h。

    罐上發(fā)酵培養(yǎng):種子37 ℃下培養(yǎng)8~10 h后,按3.0% (v/v)的接種量接種于裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,37 ℃、500 r/min、通氣量4 L/min、溶氧40%的條件下培養(yǎng)2 h左右,加入終濃度為15 g/L乳糖,28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。將發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min,棄上清液,菌體用生理鹽水洗滌兩次后-20 ℃保藏。

    1.2.2 硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞制備

    稱取約10 g濕菌體(細(xì)胞干重2.0 g),重新懸浮于100 mL、pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中;加入0. 6 g硅藻土,攪拌0.5 h后加入4 mL 10%聚乙烯亞胺溶液(預(yù)先用稀鹽酸調(diào)至pH7.0),交聯(lián)1 h;再加入1 mL的50%戊二醛溶液,交聯(lián)1 h后抽濾,用緩沖液洗滌三次后4 ℃保藏。

    1.2.3 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯轉(zhuǎn)化

    取10 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,加入到100 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液中,葡萄糖與底物以質(zhì)量比1:1添加,加入5 g (5R)-1,在30 ℃的水浴中反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束,取樣用無水乙醇稀釋,高效液相色譜檢測產(chǎn)物。

    1.2.4 填充床連續(xù)轉(zhuǎn)化

    稱取40 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,填充至填充床反應(yīng)器中。反應(yīng)器底端有泡沫濾芯,防止固定化細(xì)胞在底部泄露(圖 2)。填充柱內(nèi)部封閉,400 mL反應(yīng)液(由360 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液構(gòu)成,含有40 g葡萄糖和40 g (5R)-1)通過蠕動泵從上端泵入,流經(jīng)固定化細(xì)胞反應(yīng)后,從底部流出,回到儲藏反應(yīng)液的燒杯中,通過燒杯中攪拌子的攪動使反應(yīng)液混合均勻,然后再通過蠕動泵泵回到反應(yīng)器。填充柱外部有一層夾套,通入30 ℃溫水保持反應(yīng)器溫度在30 ℃左右。

    圖2 固定化細(xì)胞填充床反應(yīng)器Fig.2 Packed bed bioreactor with the immobilized E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr 1-immobilized cells, 2-pump1, 3-mixture, 4-water, 5-pump2

    1.3 分析方法

    (5R)-1、(3R,5R)-2采用島津HPLC LC-20AD高效液相色譜儀檢測。色譜柱為J&K CHEMICA?C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm),流動相由體積比1:3 (v/v)的乙腈水溶液組成,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,檢測波長設(shè)置為210 nm,柱溫40 ℃。產(chǎn)物(3R,5R)-2的d.e.p值按式(1)計算。

    式中,c(3R,5R)-2表示產(chǎn)物(3R,5R)-2的濃度,mol/L;c(3S,5R)-2表示差向異構(gòu)體(3S,5R)-2的濃度,mol/L。

    定義30 ℃、pH 7.0條件下每分鐘催化生成1 μmol (3R,5R)-2所需要的酶量為1 U,則固定化細(xì)胞剩余酶活r為反應(yīng)結(jié)束后固定化細(xì)胞酶活(A,U/g)與初始固定化細(xì)胞酶活(A0,U/g)的比值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 反應(yīng)體系pH對反應(yīng)的影響

    反應(yīng)pH對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖3。當(dāng)pH為6.5~7.5時,轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上;在pH7.0下反應(yīng)3 h后,固定化細(xì)胞剩余酶活最高,酶活損失不大。其它pH條件下固定化細(xì)胞的剩余酶活較低,過酸過堿條件都不利于酶發(fā)揮催化活性。在考察pH范圍內(nèi)其d.e.p都在99.5%以上,表明pH值不改變固定化細(xì)胞羰基還原酶的立體選擇性。因此,確定pH7.0為固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH。

    圖3 體系pH值對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of solution pH on (5R)-1 asymmetric reduction

    圖4 溫度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on (5R)-1 asymmetric reduction

    2.2 反應(yīng)體系溫度對反應(yīng)的影響

    反應(yīng)溫度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖4。在25~28 ℃和35 ℃下反應(yīng)3 h,(5R)-1不能完全轉(zhuǎn)化;30~32 ℃下反應(yīng)3 h (5R)-1能完全轉(zhuǎn)化完。較低溫度下,固定化細(xì)胞的反應(yīng)速度較慢;當(dāng)溫度高于30℃時固定化細(xì)胞酶活損失較大。在考察溫度范圍內(nèi)產(chǎn)物d.e.p都在99.5%以上,表明溫度不影響羰基還原酶的立體選擇性。因此,確定30 ℃為固定化細(xì)胞的反應(yīng)溫度。

    2.3 反應(yīng)體系葡萄糖濃度對反應(yīng)的影響

    葡萄糖與底物的質(zhì)量比對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖 5。當(dāng)葡萄糖濃度與底物質(zhì)量比≤1:2 (w/w)時,(5R)-1轉(zhuǎn)化率較低,葡萄糖的氧化成為了限速步驟。當(dāng)葡萄糖與底物質(zhì)量比≥1:1時,(5R)-1能夠完全反應(yīng),高濃度的葡萄糖對固定化細(xì)胞活性沒有明顯抑制作用,(3R,5R)-2的d.e.p值保持在99.5%以上。從經(jīng)濟(jì)的角度來考慮,確定1:1為硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞的最適葡萄糖與底物質(zhì)量比。

    圖5 葡萄糖濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on (5R)-1 asymmetric reduction

    圖6 底物濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction

    2.4 反應(yīng)體系底物濃度對反應(yīng)的影響

    底物濃度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖6。當(dāng)(5R)-1濃度為25~50 g/L時,反應(yīng)3 h后(5R)-1能完全轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?5 g/L后,反應(yīng)3 h (3R,5R)-2累積濃度接近,但固定化細(xì)胞的剩余酶活隨著(5R)-1濃度的增大而快速下降。這是因為底物或雜質(zhì)對固定化細(xì)胞造成一定的破壞,導(dǎo)致酶蛋白的流失。因此,確定50 g/L為固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

    2.5 反應(yīng)體系固定化細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響

    固定化細(xì)胞濃度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖7。隨著固定化細(xì)胞濃度的增加,相同時間內(nèi)(5R)-1轉(zhuǎn)化率相應(yīng)的提高。此外,細(xì)胞濃度的增加可以減緩高濃度底物對固定化細(xì)胞的破壞,減緩酶活損失。但過高的細(xì)胞濃度會增加操作難度和提高細(xì)胞培養(yǎng)成本,100 g/L的細(xì)胞濃度后,細(xì)胞用量的增加,(5R)-1轉(zhuǎn)化率增加不明顯,但成本大大增加。綜合考慮,確定100 g/L為硅藻土固定化細(xì)胞的最適細(xì)胞濃度。

    圖7 固定化細(xì)胞濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of immobilized cell loading size on(5R)-1 asymmetric reduction

    2.6 固定化細(xì)胞使用批次研究

    固定化細(xì)胞的反應(yīng)批次是評價其性能的一個重要指標(biāo)。考察了最優(yōu)條件下固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中的反應(yīng)批次,轉(zhuǎn)化體系組成為90 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液(100 mM),5 g (5R)-1,5 g葡萄糖,10 g固定化細(xì)胞,反應(yīng)完全后抽濾回收固定化細(xì)胞并用緩沖液沖洗兩次,用于下一批次的反應(yīng),結(jié)果示于圖8。結(jié)果表明,固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中可以反應(yīng)五個批次,50 g/L的(5R)-1能夠完全轉(zhuǎn)化,但第6個批次難以轉(zhuǎn)化完全,在加入少量NADPH后反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。從反應(yīng)進(jìn)程曲線中可以看出每一批反應(yīng)完后固定化細(xì)胞酶活下降很快,反應(yīng)時間大大延長。經(jīng)驗證,底物中的雜質(zhì)對細(xì)胞具有較大的破壞作用,雜質(zhì)的存在使得細(xì)胞裂解,導(dǎo)致蛋白的流失,影響了反應(yīng)批次。

    圖8 攪拌釜中(3R,5R)-2分批補料轉(zhuǎn)化Fig.8 Fed-batch conversion of (3R,5R)-2 by immobilized cells in the stirred tank bioreactor

    圖9 填充床反應(yīng)器中流速對反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of flow rate on (5R)-1 asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

    2.7 填充床反應(yīng)器中物料流速對反應(yīng)的影響

    填充床反應(yīng)器中物料流速對產(chǎn)物濃度的影響示于圖9。當(dāng)流速為6~12 mL/min時,初始反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率都隨著物料的流速增大而增加。當(dāng)流速繼續(xù)增大至18 mL/min后,反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出隨物料流速下降的趨勢,這與高流速下底物(5R)-1的停留時間下降有關(guān)[9]。因此,確定12 mL/min為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適物料流速。

    2.8 填充床反應(yīng)器中底物濃度對反應(yīng)的影響

    填充床反應(yīng)器中底物濃度對反應(yīng)的影響示于圖10。由于(5R)-1溶解度不高,固定化細(xì)胞初始反應(yīng)速率相差不大,隨著(5R)-1的消耗,反應(yīng)速率降低,直到反應(yīng)結(jié)束。但當(dāng)(5R)-1濃度過高,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,產(chǎn)物濃度的升高抑制了反應(yīng)正向進(jìn)行,出現(xiàn)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象,(5R)-1濃度超過100 g/L后產(chǎn)物抑制現(xiàn)象較明顯。因此,確定100 g/L為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

    圖10 底物濃度對填充床反應(yīng)器中不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.10 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

    2.9 填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞使用批次研究

    填充床反應(yīng)器不僅可以進(jìn)行底物循環(huán)連續(xù)式反應(yīng),又可以及時的將產(chǎn)物分離出去,避免的產(chǎn)物的積累對細(xì)胞的影響。另外,填充床使得固定化細(xì)胞與反應(yīng)液分離開來,避免了攪拌對固定化細(xì)胞的破壞作用,大大增加了固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性,降低了生產(chǎn)成本[10]。考察了在最適條件下,固定化細(xì)胞在填充床反應(yīng)器中的反應(yīng)批次。轉(zhuǎn)化體系組成為:360 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液(100 mM),加入40 g (5R)-1和40 g葡萄糖,反應(yīng)器中填充40 g固定化細(xì)胞,通過蠕動泵將反應(yīng)液以12 mL/min的流速泵入到反應(yīng)器中,在30 ℃下反應(yīng),定時取樣檢測是否轉(zhuǎn)化完全,反應(yīng)完全后用100 mL緩沖液沖洗兩次,用于下一批次的反應(yīng)。

    填充床反應(yīng)器中硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞使用批次示于圖11。第1個批次100 g/L的(5R)-1在4.5 h左右能轉(zhuǎn)化完全,反應(yīng)速度較攪拌式反應(yīng)器更快,且在轉(zhuǎn)化五個批次后第六個批次還能轉(zhuǎn)化70%,最終轉(zhuǎn)化 570 g/L的(5R)-1,較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%。

    圖11 填充床反應(yīng)器中不同使用批次的細(xì)胞活性Fig.11 Continuous conversion of (5R)-1 to (3R,5R)-2 by immobilized cells in the packed bed bioreactor

    3 結(jié) 論

    研究了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器中的催化性能,建立了(3R,5R)-2催化合成工藝。填充床反應(yīng)器的生產(chǎn)率最高,其最佳催化工藝為:反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)pH7.0,葡萄糖與底物的質(zhì)量比為1:1,(5R)-1濃度100 g/L,固定化細(xì)胞濃度100 g/L,流速12 mL/min。在最優(yōu)條件下,570 g/L的(5R)-1在72 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化,較游離細(xì)胞催化工藝[6]提高了 185%。構(gòu)建的固定床生物反應(yīng)器連續(xù)生物催化合成(3R,5R)-2技術(shù),為(3R,5R)-2規(guī)模化生產(chǎn)提供新的選擇。

    [1]Keun-Sik H, Sung L J. Statins in acute ischemic stroke: A systematic review [J]. J Stroke, 2015, 17(3):282-301.

    [2]Wolberg M, Filho M V, Bode S, et al. Chemoenzymatic synthesis of the chiral side-chain of statins: application of an alcohol dehydrogenase catalysed ketone reduction on a large scale [J]. Bioprocess and Biosystems Eng, 2008, 31(3):183-191.

    [3]Xu Q, Tao W Y, Huang H, et al. Highly efficient synthesis of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by a novel carbonyl reductase fromYarrowia lipolytica, and using mannitol or sorbitol as cosubstrate [J]. Biochem Eng J, 2016, 106:61-67.

    [4]He X J, Chen S Y, Wu J P, et al. Highly efficient enzymatic synthesis oftert-butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoate with a mutant alcohol dehydrogenase ofLactobacillus kefir[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(21):8963-8975.

    [5]Deng J, Yao Z, Chen K, et al. Towards the computational design and engineering of enzyme enantioselectivity: A case study by a carbonyl reductase fromGluconobacter oxydans[J]. J Biotechnol, 2016, 217(20):31-40.

    [6]肖 黎, 王亞軍, 曹 政, et al. 生物催化法合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 [J]. 生物加工過程, 2013, 11(1):29-34.Xiao L, Wang Y J, Cao Z, et al. Development of biocatalytic process fort-butyl 6-cyano-(3R,5R) –dihydroxylhexanoate [J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2013, 11(1):29-34.

    [7]Carlsson N, Gustafsson H, Th?rn C, et al. Enzymes immobilized in mesoporous silica: a physical-chemical perspective [J]. Adv Colloid Interface Sci, 2014, 205(12):339.

    [8]Aissaoui N, Landoulsi J, Bergaoui L, et al. Catalytic activity and thermostability of enzymes immobilized on silanized surface: Influence of the crosslinking agent [J]. Enzyme Microb Technol, 2013, 52(6-7):336.

    [9]Albertini A V P, Reis A L S, Teles F R R, et al. The new flow system approach in packed bed reactor applicable for immobilized enzyme[J]. J Mol Catal B: Enzym, 2012, 79:1-7.

    [10]Jiang Y, Sun W, Wang Y, et al. Protein-based inverse opals: A novel support for enzyme immobilization [J]. Enzyme Microb Technol,2016, 96:42.

    Biocatalytic Process oft-Butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxylhexanoate by Immobilized Cells

    Chen Xiaopeng, Shen Wei, Wang Yajun
    Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

    Chiral diolt-butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate synthetic process was established by using the celite-polyethyleneimine (PEI)-glutaraldehyde (GA) immobilizedE.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells in present work. The optimized batch bioconversion conditions for the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crwere as follows: 30℃, pH 7.0, 100 g/L immobilized cell loading size, 50 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate, mass ratio of glucose tot-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate at 1:1 (w/w). Results demonstrated that the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells can be reused for five intermittent batches. Further,its catalytic conditions were studied in the stirred tank bioreactor and packed bed reactor. Under the optimized biocatalytic conditions, 570 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate was completely converted by the celite-PEI-GA immobilized cells in 72 h in the packed-bed bioreactor, which was improved 185% and 107.3% in comparison with those of the free cells and the celite-PEI-GA immobilized cells in the stirred tank bioreactor, respectively.

    t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate; carbonyl reductase; immobilization

    Q814.2; 0643.3

    A

    1001—7631 ( 2017 ) 03—0236—07

    10.11730/j.issn.1001-7631.2017.03.0236.07

    2017-04-19;

    2017-05-17。

    陳孝鵬(1992—),男,碩士研究生;王亞軍(1975—),男,教授,通訊聯(lián)系人。E-mail:wangyj@zjut.edu.cn。

    國家自然科學(xué)基金(21476209)。

    猜你喜歡
    戊二醛硅藻土亞胺
    高效液相色譜法測定豬心臟瓣膜假體中戊二醛殘留量
    在城市污水處理廠A2O 系統(tǒng)中硅藻土對除磷的影響
    冀西北陽坡硅藻土礦地質(zhì)特征及應(yīng)用前景
    三聚磷酸二氫鋁/載硫硅藻土催化合成阿司匹林
    環(huán)氧樹脂/有機硅改性雙馬來酞亞胺的性能研究
    中國塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:55
    硅藻土對保溫砂漿性能的影響*
    亞胺培南西司他丁鈉在危重癥感染降階梯治療中的效果觀察
    基于β-二亞胺配體的鋁氧硼六元環(huán)化合物和其中間體的合成、表征及其反應(yīng)性研究
    不對稱二亞胺席夫堿的合成、表征和抗菌活性
    戊二醛對護(hù)士的職業(yè)危害及防護(hù)對策
    99久久精品一区二区三区| 麻豆成人av视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产日韩欧美视频二区| 春色校园在线视频观看| 最近手机中文字幕大全| 最后的刺客免费高清国语| 久久精品久久精品一区二区三区| 精品久久久精品久久久| 国产成人aa在线观看| 日本av手机在线免费观看| 国产精品免费大片| 日韩三级伦理在线观看| 成人国产av品久久久| 另类亚洲欧美激情| 美女中出高潮动态图| 欧美变态另类bdsm刘玥| a级一级毛片免费在线观看| 青春草视频在线免费观看| 久久久久久久久久成人| 国产黄片美女视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| .国产精品久久| 日产精品乱码卡一卡2卡三| av免费在线看不卡| 欧美精品国产亚洲| 亚洲情色 制服丝袜| 美女内射精品一级片tv| 麻豆成人午夜福利视频| 日日啪夜夜爽| 一个人看视频在线观看www免费| 22中文网久久字幕| 亚洲av男天堂| 亚洲精品国产色婷婷电影| 久久午夜福利片| 一本大道久久a久久精品| 男人爽女人下面视频在线观看| 下体分泌物呈黄色| 青春草国产在线视频| 国产69精品久久久久777片| 欧美日韩亚洲高清精品| 自线自在国产av| 观看免费一级毛片| 精品一区二区三卡| 久久毛片免费看一区二区三区| 黄色一级大片看看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产极品粉嫩免费观看在线 | 一区二区三区乱码不卡18| 99久久人妻综合| 亚洲中文av在线| 精品久久久久久久久亚洲| 观看美女的网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲av国产av综合av卡| 九草在线视频观看| 一区二区三区免费毛片| 久久精品夜色国产| 亚洲精品一区蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 中文字幕人妻丝袜制服| 永久免费av网站大全| 国产 一区精品| 最新中文字幕久久久久| 欧美性感艳星| 人妻少妇偷人精品九色| 免费看日本二区| a级片在线免费高清观看视频| 国产av精品麻豆| av福利片在线| 成人特级av手机在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久精品免费免费高清| 国产探花极品一区二区| 人妻 亚洲 视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 我的老师免费观看完整版| 国产真实伦视频高清在线观看| 色哟哟·www| 国模一区二区三区四区视频| 青春草国产在线视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 最新的欧美精品一区二区| av免费在线看不卡| 久久久久久久精品精品| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 91精品一卡2卡3卡4卡| 大陆偷拍与自拍| 在线观看av片永久免费下载| 日韩精品有码人妻一区| 精品午夜福利在线看| 久久ye,这里只有精品| 性色avwww在线观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| av在线老鸭窝| 日韩视频在线欧美| 日本黄色日本黄色录像| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇丰满av| 搡老乐熟女国产| 亚洲av免费高清在线观看| 婷婷色综合www| 久久精品国产亚洲网站| 国产黄片美女视频| 黑人猛操日本美女一级片| 日韩一区二区三区影片| 人人妻人人看人人澡| 国产成人精品无人区| 青春草视频在线免费观看| 成人美女网站在线观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产黄片视频在线免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 美女大奶头黄色视频| 男女边吃奶边做爰视频| 黄色毛片三级朝国网站 | 不卡视频在线观看欧美| 一级,二级,三级黄色视频| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲精品色激情综合| 国产综合精华液| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久久国产电影| 男女无遮挡免费网站观看| 看十八女毛片水多多多| 精品久久国产蜜桃| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久免费观看电影| 视频中文字幕在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 在线天堂最新版资源| 有码 亚洲区| 久久精品国产亚洲网站| 高清午夜精品一区二区三区| 国产精品免费大片| 丝瓜视频免费看黄片| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 纯流量卡能插随身wifi吗| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品久久久久久久性| 国产在线免费精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 99热网站在线观看| 性色av一级| 国产黄片美女视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 永久免费av网站大全| 综合色丁香网| 国产淫语在线视频| 免费播放大片免费观看视频在线观看| a 毛片基地| 一个人看视频在线观看www免费| 日日撸夜夜添| 国产69精品久久久久777片| 老司机影院毛片| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 免费观看a级毛片全部| 亚洲自偷自拍三级| 热re99久久国产66热| 99久国产av精品国产电影| 国产爽快片一区二区三区| 在线播放无遮挡| 天天操日日干夜夜撸| 国产熟女午夜一区二区三区 | 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品国产自在天天线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 在线播放无遮挡| 亚洲国产av新网站| 三级国产精品片| 国产男女超爽视频在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 91成人精品电影| 午夜日本视频在线| 亚洲av免费高清在线观看| 高清视频免费观看一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日本欧美国产在线视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 午夜福利视频精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 97超视频在线观看视频| 18禁动态无遮挡网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费观看性生交大片5| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 成人国产av品久久久| 老熟女久久久| 中文欧美无线码| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲中文av在线| 多毛熟女@视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲国产最新在线播放| 免费看光身美女| 大码成人一级视频| 国产深夜福利视频在线观看| 一区在线观看完整版| 国产精品熟女久久久久浪| 国产成人freesex在线| 国产男人的电影天堂91| 免费黄网站久久成人精品| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲欧美日韩东京热| 国产男女内射视频| 少妇精品久久久久久久| 成人国产麻豆网| 97精品久久久久久久久久精品| .国产精品久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 久久久欧美国产精品| 99热网站在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 内地一区二区视频在线| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 热re99久久国产66热| 国产69精品久久久久777片| 人妻 亚洲 视频| 国产黄色免费在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 热re99久久精品国产66热6| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| av一本久久久久| 99热6这里只有精品| 国产精品国产av在线观看| a级毛片在线看网站| 国产视频首页在线观看| 亚洲精品第二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 久久99精品国语久久久| 我要看日韩黄色一级片| 欧美成人精品欧美一级黄| h日本视频在线播放| 在线观看人妻少妇| 国产精品人妻久久久久久| av专区在线播放| 亚洲av欧美aⅴ国产| 日韩制服骚丝袜av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 伦理电影大哥的女人| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久99热这里只频精品6学生| 男女啪啪激烈高潮av片| 看非洲黑人一级黄片| 天美传媒精品一区二区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲中文av在线| 国产熟女午夜一区二区三区 | 中国国产av一级| 免费观看无遮挡的男女| 日韩一区二区三区影片| 黄色配什么色好看| 亚洲欧洲国产日韩| 国产精品三级大全| 国产在视频线精品| 丝袜喷水一区| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 一级二级三级毛片免费看| 国模一区二区三区四区视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| h日本视频在线播放| 一级片'在线观看视频| 我要看黄色一级片免费的| 欧美变态另类bdsm刘玥| 黑丝袜美女国产一区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久国产亚洲av麻豆专区| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久av网站| 亚洲精品自拍成人| 午夜免费鲁丝| 亚洲av在线观看美女高潮| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久午夜福利片| 国产精品蜜桃在线观看| 免费av不卡在线播放| 另类精品久久| 亚洲在久久综合| 中文欧美无线码| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩一区二区三区影片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 插逼视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 日日啪夜夜爽| 国产男女超爽视频在线观看| 观看av在线不卡| 黄色毛片三级朝国网站 | 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 另类精品久久| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久久久久精品精品| 国产一区有黄有色的免费视频| 在线天堂最新版资源| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费黄频网站在线观看国产| 在线观看av片永久免费下载| 欧美性感艳星| 超碰97精品在线观看| 女人久久www免费人成看片| 婷婷色麻豆天堂久久| 国精品久久久久久国模美| 丝瓜视频免费看黄片| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产伦精品一区二区三区视频9| 视频中文字幕在线观看| 又爽又黄a免费视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 男女国产视频网站| 99热全是精品| 亚洲成人av在线免费| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99久国产av精品国产电影| 免费黄频网站在线观看国产| 男女边摸边吃奶| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产69精品久久久久777片| 99re6热这里在线精品视频| 七月丁香在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 中文字幕久久专区| 少妇被粗大猛烈的视频| 一区二区三区免费毛片| 久久精品久久久久久久性| 精品少妇黑人巨大在线播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品乱久久久久久| 人妻人人澡人人爽人人| 高清毛片免费看| 日本免费在线观看一区| 高清av免费在线| av黄色大香蕉| 一区在线观看完整版| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| av在线app专区| 边亲边吃奶的免费视频| 一级二级三级毛片免费看| 在线观看人妻少妇| 亚洲一区二区三区欧美精品| 中文字幕av电影在线播放| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 97精品久久久久久久久久精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲国产精品成人久久小说| 边亲边吃奶的免费视频| 久久人人爽人人片av| 久久久午夜欧美精品| a级毛色黄片| 在线观看免费日韩欧美大片 | 在线精品无人区一区二区三| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲经典国产精华液单| 最近手机中文字幕大全| 中文天堂在线官网| 日韩一区二区三区影片| 69精品国产乱码久久久| 乱人伦中国视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 新久久久久国产一级毛片| 色吧在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久久国产欧美日韩av| 观看av在线不卡| 精品国产国语对白av| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品亚洲成a人片在线观看| 日本与韩国留学比较| 高清欧美精品videossex| 尾随美女入室| 国产亚洲欧美精品永久| 中文字幕免费在线视频6| 日韩一本色道免费dvd| 精品久久久精品久久久| 国产一区二区三区综合在线观看 | 插逼视频在线观看| 久久久久精品性色| 在线观看免费日韩欧美大片 | 九草在线视频观看| 性色avwww在线观看| 欧美xxⅹ黑人| av女优亚洲男人天堂| 精品人妻偷拍中文字幕| 99热这里只有是精品在线观看| 国产精品无大码| 久久久久久久国产电影| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线观看三级黄色| 97超碰精品成人国产| 免费大片18禁| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲欧美清纯卡通| 日韩一本色道免费dvd| 久久精品久久久久久久性| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产亚洲91精品色在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 午夜免费鲁丝| 亚洲成人av在线免费| 在现免费观看毛片| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲精品456在线播放app| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产亚洲最大av| 国产精品国产av在线观看| 青青草视频在线视频观看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产亚洲精品久久久com| 久久热精品热| 欧美3d第一页| 亚洲怡红院男人天堂| 免费少妇av软件| 久久久精品94久久精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美国产精品一级二级三级 | 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜福利网站1000一区二区三区| 在线观看www视频免费| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国国产精品蜜臀av免费| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲成人一二三区av| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费黄频网站在线观看国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女cb高潮喷水在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 免费看日本二区| 亚洲av男天堂| 国产精品国产av在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 在线 av 中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲内射少妇av| 国产伦在线观看视频一区| 午夜福利视频精品| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 欧美xxⅹ黑人| 热re99久久精品国产66热6| 日韩制服骚丝袜av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 99热6这里只有精品| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| av天堂中文字幕网| 狂野欧美激情性bbbbbb| 日韩不卡一区二区三区视频在线| h视频一区二区三区| 天堂8中文在线网| 久久女婷五月综合色啪小说| 人妻少妇偷人精品九色| 婷婷色综合大香蕉| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产视频首页在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 国产亚洲5aaaaa淫片| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲av福利一区| a级片在线免费高清观看视频| 午夜福利视频精品| 成人毛片a级毛片在线播放| 另类精品久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久韩国三级中文字幕| 伊人亚洲综合成人网| 中文字幕制服av| 在线观看三级黄色| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品熟女久久久久浪| 日本av免费视频播放| 精品亚洲成国产av| 9色porny在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产中年淑女户外野战色| 99久久精品热视频| 国产在线男女| 一区二区三区免费毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 伊人久久国产一区二区| 中国国产av一级| 99视频精品全部免费 在线| 在线免费观看不下载黄p国产| 又大又黄又爽视频免费| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日日啪夜夜撸| 久久久国产欧美日韩av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 麻豆乱淫一区二区| 日韩大片免费观看网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美bdsm另类| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产免费一级a男人的天堂| 一级av片app| xxx大片免费视频| 成年人免费黄色播放视频 | 精品国产露脸久久av麻豆| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 成人国产av品久久久| 亚洲电影在线观看av| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 日韩大片免费观看网站| 99re6热这里在线精品视频| 日韩亚洲欧美综合| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 亚洲精品乱久久久久久| 伊人久久精品亚洲午夜| a 毛片基地| 亚洲怡红院男人天堂| 97超碰精品成人国产| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品无大码| 男人添女人高潮全过程视频| 午夜福利视频精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲电影在线观看av| 嘟嘟电影网在线观看| 高清av免费在线| 亚洲经典国产精华液单| 日韩一区二区三区影片| 亚洲自偷自拍三级| 少妇高潮的动态图| 国产成人aa在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美人与善性xxx| av女优亚洲男人天堂| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 熟女av电影| 99久久精品国产国产毛片| av福利片在线| 国产又色又爽无遮挡免| 婷婷色综合www| 最黄视频免费看| 人妻 亚洲 视频| 一区二区三区乱码不卡18| 一区在线观看完整版| 日韩欧美一区视频在线观看 | 午夜日本视频在线| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男人舔奶头视频| 亚洲不卡免费看| 国产男女内射视频| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 男的添女的下面高潮视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 街头女战士在线观看网站| 欧美成人午夜免费资源| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 久久 成人 亚洲| 在线天堂最新版资源| 水蜜桃什么品种好| 欧美日韩精品成人综合77777| 乱码一卡2卡4卡精品| a级毛片免费高清观看在线播放| 精品人妻熟女毛片av久久网站|