• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    固定化細(xì)胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯工藝研究

    2017-11-01 07:43:17陳孝鵬王亞軍
    關(guān)鍵詞:戊二醛硅藻土亞胺

    陳孝鵬,沈 煒,王亞軍

    浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室,浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310032

    固定化細(xì)胞催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯工藝研究

    陳孝鵬,沈 煒,王亞軍

    浙江省生物有機合成技術(shù)研究重點實驗室,浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,浙江 杭州 310032

    采用硅藻土作載體,聚乙烯亞胺和戊二醛作交聯(lián)劑來固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr共表達(dá)菌株,以此來催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成 6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2],考察了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞的催化性能,進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。結(jié)果表明:在固定化細(xì)胞用量100 g/L、葡萄糖與底物質(zhì)量濃度比為1:1、轉(zhuǎn)化溫度30℃、pH 7.0、流速12 mL/min、100 g/L的(5R)-1轉(zhuǎn)化完全的條件下,填充床式反應(yīng)器可以連續(xù)反應(yīng)五個批次,轉(zhuǎn)化570 g/L的(5R)-1,較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%,較游離細(xì)胞間歇催化操作提高了185%。

    6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 羰基還原酶 固定化

    阿托伐他汀鈣是一種對膽固醇合成中關(guān)鍵性限速酶 HMG-CoA還原酶具有強烈的競爭性抑制作用的藥物,能有效地降低膽固醇的含量,降低心血管疾病的風(fēng)險[1]。6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯[(3R,5R)-2]是阿托伐他汀鈣合成的重要手性砌塊[2]。相較于化學(xué)合成法的苛刻反應(yīng)條件,生物法合成手性藥物具有明顯的優(yōu)勢,其立體選擇性高、反應(yīng)條件溫和、對生產(chǎn)設(shè)備的要求低,大大降低了生產(chǎn)成本[3,4]。

    羰基還原酶是一類能夠不對稱催化前手性酮還原為光學(xué)醇的酶[5]。肖黎等[6]構(gòu)建了羰基還原酶和葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)菌株E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,開發(fā)了雙酶共表達(dá)菌株全細(xì)胞催化 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯[(5R)-1]合成(3R,5R)-2的工藝(圖 1),游離E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr全細(xì)胞最高可以催化200 g/L (5R)-1完全轉(zhuǎn)化,產(chǎn)物差向異構(gòu)體過量(d.e.p)值大于99.5%。但游離細(xì)胞催化工藝的酶和輔酶只能使用一次,存在轉(zhuǎn)化液容易乳化、下游分離難度大等缺陷[7,8]。

    圖1 共表達(dá)菌株催化合成(3R,5R)-2Fig.1 Schematic illustration of (5R)-1 bioreduction to (3R,5R)-2 synthesis catalyzed by E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr

    針對游離細(xì)胞催化工藝的缺陷,本研究選擇硅藻土作為載體,采用交聯(lián)劑聚乙烯亞胺和戊二醛固定E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞,考察了固定化細(xì)胞的催化性能,進(jìn)一步優(yōu)化了固定化細(xì)胞催化合成(3R,5R)-2工藝。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    E. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建[6]、保藏;(5R)-1(質(zhì)量含量約68%)由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈;(3R,5R)-2購自Toronto Research Chemicals Inc.(多倫多,加拿大);卡那霉素購自TaKaRa公司;50%聚乙烯亞胺購自上海晶純生化科技股份有限公司;25%戊二醛購自天津阿法埃莎化學(xué)有限公司;硅藻土購自溫州化學(xué)材料廠;其它試劑均為市售分析純。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    種子液培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基中挑取一接種環(huán)的菌落接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL搖瓶中,搖瓶置于旋轉(zhuǎn)式搖床在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)8~10 h。

    罐上發(fā)酵培養(yǎng):種子37 ℃下培養(yǎng)8~10 h后,按3.0% (v/v)的接種量接種于裝有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,37 ℃、500 r/min、通氣量4 L/min、溶氧40%的條件下培養(yǎng)2 h左右,加入終濃度為15 g/L乳糖,28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h。將發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min,棄上清液,菌體用生理鹽水洗滌兩次后-20 ℃保藏。

    1.2.2 硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化細(xì)胞制備

    稱取約10 g濕菌體(細(xì)胞干重2.0 g),重新懸浮于100 mL、pH7.0的K2HPO4-KH2PO4緩沖液中;加入0. 6 g硅藻土,攪拌0.5 h后加入4 mL 10%聚乙烯亞胺溶液(預(yù)先用稀鹽酸調(diào)至pH7.0),交聯(lián)1 h;再加入1 mL的50%戊二醛溶液,交聯(lián)1 h后抽濾,用緩沖液洗滌三次后4 ℃保藏。

    1.2.3 6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯轉(zhuǎn)化

    取10 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,加入到100 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液中,葡萄糖與底物以質(zhì)量比1:1添加,加入5 g (5R)-1,在30 ℃的水浴中反應(yīng)。待反應(yīng)結(jié)束,取樣用無水乙醇稀釋,高效液相色譜檢測產(chǎn)物。

    1.2.4 填充床連續(xù)轉(zhuǎn)化

    稱取40 g硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr,填充至填充床反應(yīng)器中。反應(yīng)器底端有泡沫濾芯,防止固定化細(xì)胞在底部泄露(圖 2)。填充柱內(nèi)部封閉,400 mL反應(yīng)液(由360 mL K2HPO4-KH2PO4緩沖液構(gòu)成,含有40 g葡萄糖和40 g (5R)-1)通過蠕動泵從上端泵入,流經(jīng)固定化細(xì)胞反應(yīng)后,從底部流出,回到儲藏反應(yīng)液的燒杯中,通過燒杯中攪拌子的攪動使反應(yīng)液混合均勻,然后再通過蠕動泵泵回到反應(yīng)器。填充柱外部有一層夾套,通入30 ℃溫水保持反應(yīng)器溫度在30 ℃左右。

    圖2 固定化細(xì)胞填充床反應(yīng)器Fig.2 Packed bed bioreactor with the immobilized E. coli BL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr 1-immobilized cells, 2-pump1, 3-mixture, 4-water, 5-pump2

    1.3 分析方法

    (5R)-1、(3R,5R)-2采用島津HPLC LC-20AD高效液相色譜儀檢測。色譜柱為J&K CHEMICA?C18(250 mm × 4.6 mm,5 μm),流動相由體積比1:3 (v/v)的乙腈水溶液組成,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,檢測波長設(shè)置為210 nm,柱溫40 ℃。產(chǎn)物(3R,5R)-2的d.e.p值按式(1)計算。

    式中,c(3R,5R)-2表示產(chǎn)物(3R,5R)-2的濃度,mol/L;c(3S,5R)-2表示差向異構(gòu)體(3S,5R)-2的濃度,mol/L。

    定義30 ℃、pH 7.0條件下每分鐘催化生成1 μmol (3R,5R)-2所需要的酶量為1 U,則固定化細(xì)胞剩余酶活r為反應(yīng)結(jié)束后固定化細(xì)胞酶活(A,U/g)與初始固定化細(xì)胞酶活(A0,U/g)的比值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 反應(yīng)體系pH對反應(yīng)的影響

    反應(yīng)pH對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖3。當(dāng)pH為6.5~7.5時,轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上;在pH7.0下反應(yīng)3 h后,固定化細(xì)胞剩余酶活最高,酶活損失不大。其它pH條件下固定化細(xì)胞的剩余酶活較低,過酸過堿條件都不利于酶發(fā)揮催化活性。在考察pH范圍內(nèi)其d.e.p都在99.5%以上,表明pH值不改變固定化細(xì)胞羰基還原酶的立體選擇性。因此,確定pH7.0為固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH。

    圖3 體系pH值對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of solution pH on (5R)-1 asymmetric reduction

    圖4 溫度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of temperature on (5R)-1 asymmetric reduction

    2.2 反應(yīng)體系溫度對反應(yīng)的影響

    反應(yīng)溫度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖4。在25~28 ℃和35 ℃下反應(yīng)3 h,(5R)-1不能完全轉(zhuǎn)化;30~32 ℃下反應(yīng)3 h (5R)-1能完全轉(zhuǎn)化完。較低溫度下,固定化細(xì)胞的反應(yīng)速度較慢;當(dāng)溫度高于30℃時固定化細(xì)胞酶活損失較大。在考察溫度范圍內(nèi)產(chǎn)物d.e.p都在99.5%以上,表明溫度不影響羰基還原酶的立體選擇性。因此,確定30 ℃為固定化細(xì)胞的反應(yīng)溫度。

    2.3 反應(yīng)體系葡萄糖濃度對反應(yīng)的影響

    葡萄糖與底物的質(zhì)量比對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖 5。當(dāng)葡萄糖濃度與底物質(zhì)量比≤1:2 (w/w)時,(5R)-1轉(zhuǎn)化率較低,葡萄糖的氧化成為了限速步驟。當(dāng)葡萄糖與底物質(zhì)量比≥1:1時,(5R)-1能夠完全反應(yīng),高濃度的葡萄糖對固定化細(xì)胞活性沒有明顯抑制作用,(3R,5R)-2的d.e.p值保持在99.5%以上。從經(jīng)濟(jì)的角度來考慮,確定1:1為硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞的最適葡萄糖與底物質(zhì)量比。

    圖5 葡萄糖濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on (5R)-1 asymmetric reduction

    圖6 底物濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction

    2.4 反應(yīng)體系底物濃度對反應(yīng)的影響

    底物濃度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖6。當(dāng)(5R)-1濃度為25~50 g/L時,反應(yīng)3 h后(5R)-1能完全轉(zhuǎn)化。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?5 g/L后,反應(yīng)3 h (3R,5R)-2累積濃度接近,但固定化細(xì)胞的剩余酶活隨著(5R)-1濃度的增大而快速下降。這是因為底物或雜質(zhì)對固定化細(xì)胞造成一定的破壞,導(dǎo)致酶蛋白的流失。因此,確定50 g/L為固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

    2.5 反應(yīng)體系固定化細(xì)胞濃度對反應(yīng)的影響

    固定化細(xì)胞濃度對硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞催化(5R)-1不對稱還原反應(yīng)的影響示于圖7。隨著固定化細(xì)胞濃度的增加,相同時間內(nèi)(5R)-1轉(zhuǎn)化率相應(yīng)的提高。此外,細(xì)胞濃度的增加可以減緩高濃度底物對固定化細(xì)胞的破壞,減緩酶活損失。但過高的細(xì)胞濃度會增加操作難度和提高細(xì)胞培養(yǎng)成本,100 g/L的細(xì)胞濃度后,細(xì)胞用量的增加,(5R)-1轉(zhuǎn)化率增加不明顯,但成本大大增加。綜合考慮,確定100 g/L為硅藻土固定化細(xì)胞的最適細(xì)胞濃度。

    圖7 固定化細(xì)胞濃度對不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.7 Effect of immobilized cell loading size on(5R)-1 asymmetric reduction

    2.6 固定化細(xì)胞使用批次研究

    固定化細(xì)胞的反應(yīng)批次是評價其性能的一個重要指標(biāo)。考察了最優(yōu)條件下固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中的反應(yīng)批次,轉(zhuǎn)化體系組成為90 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液(100 mM),5 g (5R)-1,5 g葡萄糖,10 g固定化細(xì)胞,反應(yīng)完全后抽濾回收固定化細(xì)胞并用緩沖液沖洗兩次,用于下一批次的反應(yīng),結(jié)果示于圖8。結(jié)果表明,固定化細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器中可以反應(yīng)五個批次,50 g/L的(5R)-1能夠完全轉(zhuǎn)化,但第6個批次難以轉(zhuǎn)化完全,在加入少量NADPH后反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。從反應(yīng)進(jìn)程曲線中可以看出每一批反應(yīng)完后固定化細(xì)胞酶活下降很快,反應(yīng)時間大大延長。經(jīng)驗證,底物中的雜質(zhì)對細(xì)胞具有較大的破壞作用,雜質(zhì)的存在使得細(xì)胞裂解,導(dǎo)致蛋白的流失,影響了反應(yīng)批次。

    圖8 攪拌釜中(3R,5R)-2分批補料轉(zhuǎn)化Fig.8 Fed-batch conversion of (3R,5R)-2 by immobilized cells in the stirred tank bioreactor

    圖9 填充床反應(yīng)器中流速對反應(yīng)的影響Fig.9 Effect of flow rate on (5R)-1 asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

    2.7 填充床反應(yīng)器中物料流速對反應(yīng)的影響

    填充床反應(yīng)器中物料流速對產(chǎn)物濃度的影響示于圖9。當(dāng)流速為6~12 mL/min時,初始反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率都隨著物料的流速增大而增加。當(dāng)流速繼續(xù)增大至18 mL/min后,反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出隨物料流速下降的趨勢,這與高流速下底物(5R)-1的停留時間下降有關(guān)[9]。因此,確定12 mL/min為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適物料流速。

    2.8 填充床反應(yīng)器中底物濃度對反應(yīng)的影響

    填充床反應(yīng)器中底物濃度對反應(yīng)的影響示于圖10。由于(5R)-1溶解度不高,固定化細(xì)胞初始反應(yīng)速率相差不大,隨著(5R)-1的消耗,反應(yīng)速率降低,直到反應(yīng)結(jié)束。但當(dāng)(5R)-1濃度過高,隨著反應(yīng)的進(jìn)行,產(chǎn)物濃度的升高抑制了反應(yīng)正向進(jìn)行,出現(xiàn)產(chǎn)物抑制現(xiàn)象,(5R)-1濃度超過100 g/L后產(chǎn)物抑制現(xiàn)象較明顯。因此,確定100 g/L為填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞的最適底物濃度。

    圖10 底物濃度對填充床反應(yīng)器中不對稱還原反應(yīng)的影響Fig.10 Effect of (5R)-1 concentration on its asymmetric reduction in the packed bed bioreactor

    2.9 填充床反應(yīng)器中固定化細(xì)胞使用批次研究

    填充床反應(yīng)器不僅可以進(jìn)行底物循環(huán)連續(xù)式反應(yīng),又可以及時的將產(chǎn)物分離出去,避免的產(chǎn)物的積累對細(xì)胞的影響。另外,填充床使得固定化細(xì)胞與反應(yīng)液分離開來,避免了攪拌對固定化細(xì)胞的破壞作用,大大增加了固定化細(xì)胞的操作穩(wěn)定性,降低了生產(chǎn)成本[10]。考察了在最適條件下,固定化細(xì)胞在填充床反應(yīng)器中的反應(yīng)批次。轉(zhuǎn)化體系組成為:360 mL pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液(100 mM),加入40 g (5R)-1和40 g葡萄糖,反應(yīng)器中填充40 g固定化細(xì)胞,通過蠕動泵將反應(yīng)液以12 mL/min的流速泵入到反應(yīng)器中,在30 ℃下反應(yīng),定時取樣檢測是否轉(zhuǎn)化完全,反應(yīng)完全后用100 mL緩沖液沖洗兩次,用于下一批次的反應(yīng)。

    填充床反應(yīng)器中硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞使用批次示于圖11。第1個批次100 g/L的(5R)-1在4.5 h左右能轉(zhuǎn)化完全,反應(yīng)速度較攪拌式反應(yīng)器更快,且在轉(zhuǎn)化五個批次后第六個批次還能轉(zhuǎn)化70%,最終轉(zhuǎn)化 570 g/L的(5R)-1,較攪拌式反應(yīng)器提高了107.3%。

    圖11 填充床反應(yīng)器中不同使用批次的細(xì)胞活性Fig.11 Continuous conversion of (5R)-1 to (3R,5R)-2 by immobilized cells in the packed bed bioreactor

    3 結(jié) 論

    研究了硅藻土-聚乙烯亞胺-戊二醛固定化E.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-cr細(xì)胞在攪拌式反應(yīng)器和填充床反應(yīng)器中的催化性能,建立了(3R,5R)-2催化合成工藝。填充床反應(yīng)器的生產(chǎn)率最高,其最佳催化工藝為:反應(yīng)溫度30 ℃,反應(yīng)pH7.0,葡萄糖與底物的質(zhì)量比為1:1,(5R)-1濃度100 g/L,固定化細(xì)胞濃度100 g/L,流速12 mL/min。在最優(yōu)條件下,570 g/L的(5R)-1在72 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化,較游離細(xì)胞催化工藝[6]提高了 185%。構(gòu)建的固定床生物反應(yīng)器連續(xù)生物催化合成(3R,5R)-2技術(shù),為(3R,5R)-2規(guī)模化生產(chǎn)提供新的選擇。

    [1]Keun-Sik H, Sung L J. Statins in acute ischemic stroke: A systematic review [J]. J Stroke, 2015, 17(3):282-301.

    [2]Wolberg M, Filho M V, Bode S, et al. Chemoenzymatic synthesis of the chiral side-chain of statins: application of an alcohol dehydrogenase catalysed ketone reduction on a large scale [J]. Bioprocess and Biosystems Eng, 2008, 31(3):183-191.

    [3]Xu Q, Tao W Y, Huang H, et al. Highly efficient synthesis of ethyl (S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by a novel carbonyl reductase fromYarrowia lipolytica, and using mannitol or sorbitol as cosubstrate [J]. Biochem Eng J, 2016, 106:61-67.

    [4]He X J, Chen S Y, Wu J P, et al. Highly efficient enzymatic synthesis oftert-butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxohexanoate with a mutant alcohol dehydrogenase ofLactobacillus kefir[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 99(21):8963-8975.

    [5]Deng J, Yao Z, Chen K, et al. Towards the computational design and engineering of enzyme enantioselectivity: A case study by a carbonyl reductase fromGluconobacter oxydans[J]. J Biotechnol, 2016, 217(20):31-40.

    [6]肖 黎, 王亞軍, 曹 政, et al. 生物催化法合成6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯 [J]. 生物加工過程, 2013, 11(1):29-34.Xiao L, Wang Y J, Cao Z, et al. Development of biocatalytic process fort-butyl 6-cyano-(3R,5R) –dihydroxylhexanoate [J]. Chinese Journal of Bioprocess Engineering, 2013, 11(1):29-34.

    [7]Carlsson N, Gustafsson H, Th?rn C, et al. Enzymes immobilized in mesoporous silica: a physical-chemical perspective [J]. Adv Colloid Interface Sci, 2014, 205(12):339.

    [8]Aissaoui N, Landoulsi J, Bergaoui L, et al. Catalytic activity and thermostability of enzymes immobilized on silanized surface: Influence of the crosslinking agent [J]. Enzyme Microb Technol, 2013, 52(6-7):336.

    [9]Albertini A V P, Reis A L S, Teles F R R, et al. The new flow system approach in packed bed reactor applicable for immobilized enzyme[J]. J Mol Catal B: Enzym, 2012, 79:1-7.

    [10]Jiang Y, Sun W, Wang Y, et al. Protein-based inverse opals: A novel support for enzyme immobilization [J]. Enzyme Microb Technol,2016, 96:42.

    Biocatalytic Process oft-Butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxylhexanoate by Immobilized Cells

    Chen Xiaopeng, Shen Wei, Wang Yajun
    Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China

    Chiral diolt-butyl 6-cyano-(3R,5R)-dihydroxyhexanoate synthetic process was established by using the celite-polyethyleneimine (PEI)-glutaraldehyde (GA) immobilizedE.coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells in present work. The optimized batch bioconversion conditions for the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crwere as follows: 30℃, pH 7.0, 100 g/L immobilized cell loading size, 50 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate, mass ratio of glucose tot-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate at 1:1 (w/w). Results demonstrated that the celite-PEI-GA immobilizedE. coliBL21(DE3)/pCDFDuet-gdh-crcells can be reused for five intermittent batches. Further,its catalytic conditions were studied in the stirred tank bioreactor and packed bed reactor. Under the optimized biocatalytic conditions, 570 g/Lt-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate was completely converted by the celite-PEI-GA immobilized cells in 72 h in the packed-bed bioreactor, which was improved 185% and 107.3% in comparison with those of the free cells and the celite-PEI-GA immobilized cells in the stirred tank bioreactor, respectively.

    t-butyl 6-cyano-(5R)-hydroxyl-3-oxolhexanoate; carbonyl reductase; immobilization

    Q814.2; 0643.3

    A

    1001—7631 ( 2017 ) 03—0236—07

    10.11730/j.issn.1001-7631.2017.03.0236.07

    2017-04-19;

    2017-05-17。

    陳孝鵬(1992—),男,碩士研究生;王亞軍(1975—),男,教授,通訊聯(lián)系人。E-mail:wangyj@zjut.edu.cn。

    國家自然科學(xué)基金(21476209)。

    猜你喜歡
    戊二醛硅藻土亞胺
    高效液相色譜法測定豬心臟瓣膜假體中戊二醛殘留量
    在城市污水處理廠A2O 系統(tǒng)中硅藻土對除磷的影響
    冀西北陽坡硅藻土礦地質(zhì)特征及應(yīng)用前景
    三聚磷酸二氫鋁/載硫硅藻土催化合成阿司匹林
    環(huán)氧樹脂/有機硅改性雙馬來酞亞胺的性能研究
    中國塑料(2015年6期)2015-11-13 03:02:55
    硅藻土對保溫砂漿性能的影響*
    亞胺培南西司他丁鈉在危重癥感染降階梯治療中的效果觀察
    基于β-二亞胺配體的鋁氧硼六元環(huán)化合物和其中間體的合成、表征及其反應(yīng)性研究
    不對稱二亞胺席夫堿的合成、表征和抗菌活性
    戊二醛對護(hù)士的職業(yè)危害及防護(hù)對策
    亚洲不卡免费看| 国产精品野战在线观看| av天堂中文字幕网| 精品久久久久久久久亚洲| 激情 狠狠 欧美| 午夜精品在线福利| 国产免费又黄又爽又色| 我的老师免费观看完整版| 亚洲av成人精品一二三区| 免费观看性生交大片5| 免费观看的影片在线观看| 亚洲成人久久爱视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产淫片久久久久久久久| 乱系列少妇在线播放| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲精品一区蜜桃| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩欧美在线乱码| 国产精品人妻久久久久久| 久久久久久久久久成人| 免费av不卡在线播放| .国产精品久久| 国产av码专区亚洲av| 欧美三级亚洲精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 波多野结衣高清无吗| 又粗又爽又猛毛片免费看| 五月伊人婷婷丁香| 91久久精品国产一区二区成人| 人妻系列 视频| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲伊人久久精品综合 | 国产人妻一区二区三区在| 亚洲在线观看片| 日本黄色视频三级网站网址| 国产av不卡久久| 国产精华一区二区三区| 久久久精品大字幕| 日韩一本色道免费dvd| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 免费观看精品视频网站| 男女啪啪激烈高潮av片| 免费大片18禁| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日本与韩国留学比较| 久久精品综合一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产三级中文精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 丝袜美腿在线中文| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 99热这里只有是精品50| 少妇熟女aⅴ在线视频| 波多野结衣高清无吗| 高清av免费在线| 性色avwww在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 成年版毛片免费区| 美女大奶头视频| 九色成人免费人妻av| 久久韩国三级中文字幕| 久久99热6这里只有精品| 成人美女网站在线观看视频| 欧美+日韩+精品| 亚洲中文字幕日韩| 成人国产麻豆网| 长腿黑丝高跟| 亚洲国产最新在线播放| 欧美丝袜亚洲另类| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品不卡视频一区二区| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 久久综合国产亚洲精品| 亚洲高清免费不卡视频| 美女内射精品一级片tv| 国产精品久久视频播放| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产色爽女视频免费观看| 免费观看在线日韩| 最近视频中文字幕2019在线8| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久这里只有精品中国| 一本一本综合久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产三级在线视频| 亚洲五月天丁香| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品熟女少妇av免费看| 嫩草影院精品99| 国产亚洲一区二区精品| 亚洲最大成人中文| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产精品野战在线观看| 三级经典国产精品| 国产三级中文精品| 欧美激情在线99| 高清毛片免费看| 最近中文字幕2019免费版| 日韩大片免费观看网站 | av福利片在线观看| 久久精品影院6| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩成人伦理影院| 久久亚洲精品不卡| 精品一区二区三区视频在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日韩人妻高清精品专区| 视频中文字幕在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 22中文网久久字幕| 男女视频在线观看网站免费| 国产淫语在线视频| eeuss影院久久| 六月丁香七月| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 久久这里有精品视频免费| 2022亚洲国产成人精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 人人妻人人看人人澡| 少妇人妻一区二区三区视频| 午夜免费激情av| 国产成人a区在线观看| 一区二区三区高清视频在线| 免费观看性生交大片5| 亚洲av不卡在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 极品教师在线视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲欧美清纯卡通| 在线播放国产精品三级| 一个人看视频在线观看www免费| 精品国产露脸久久av麻豆 | 久久精品91蜜桃| 麻豆国产97在线/欧美| 桃色一区二区三区在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 2022亚洲国产成人精品| 久久久成人免费电影| 中文字幕熟女人妻在线| 日本欧美国产在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 男人舔女人下体高潮全视频| 精品欧美国产一区二区三| 看黄色毛片网站| 亚洲精品成人久久久久久| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日本黄色片子视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 男女啪啪激烈高潮av片| 一区二区三区免费毛片| 欧美潮喷喷水| 美女大奶头视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产 一区精品| 午夜福利在线观看吧| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 欧美色视频一区免费| 色5月婷婷丁香| 日韩制服骚丝袜av| 久久99热6这里只有精品| 一级黄色大片毛片| 嫩草影院精品99| 别揉我奶头 嗯啊视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 国产极品精品免费视频能看的| 村上凉子中文字幕在线| 国产私拍福利视频在线观看| 色综合站精品国产| 国国产精品蜜臀av免费| 麻豆乱淫一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 中文在线观看免费www的网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久久久久国产a免费观看| 国产美女午夜福利| 亚洲av成人精品一区久久| 美女被艹到高潮喷水动态| 麻豆久久精品国产亚洲av| 精品久久久久久电影网 | 伦理电影大哥的女人| 亚洲成人精品中文字幕电影| 偷拍熟女少妇极品色| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产毛片a区久久久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 丝袜美腿在线中文| 男女那种视频在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产精品一及| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产视频内射| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲欧美精品专区久久| 国国产精品蜜臀av免费| 国产成人aa在线观看| 国产淫语在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩三级伦理在线观看| 午夜精品在线福利| 国产精品电影一区二区三区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 国产真实乱freesex| 免费观看精品视频网站| 日本免费在线观看一区| 久久99热这里只有精品18| 久久午夜福利片| 国产在线一区二区三区精 | 国产成人免费观看mmmm| 男插女下体视频免费在线播放| 又爽又黄a免费视频| 女人久久www免费人成看片 | 国产精品蜜桃在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产在视频线精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 黄色日韩在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o | 国产美女午夜福利| 高清日韩中文字幕在线| 国产91av在线免费观看| 国产av在哪里看| 亚洲综合精品二区| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品影院6| 精品久久久久久成人av| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99热全是精品| 午夜福利高清视频| 欧美成人a在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 在线免费观看的www视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 纵有疾风起免费观看全集完整版 | 在线免费十八禁| 亚洲经典国产精华液单| 岛国在线免费视频观看| 午夜视频国产福利| 男人舔女人下体高潮全视频| 干丝袜人妻中文字幕| 日本黄大片高清| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 成人欧美大片| 亚州av有码| 亚洲人成网站在线播| 亚洲av中文av极速乱| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 特级一级黄色大片| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲av日韩在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| 午夜老司机福利剧场| 亚洲国产精品国产精品| 大香蕉久久网| www.色视频.com| 97热精品久久久久久| 中文在线观看免费www的网站| 大话2 男鬼变身卡| 国产成人精品婷婷| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 只有这里有精品99| 最近的中文字幕免费完整| 在线观看66精品国产| 日本免费a在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲怡红院男人天堂| 国产精品国产三级国产专区5o | 秋霞在线观看毛片| 中文字幕av成人在线电影| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美人与善性xxx| 精品久久国产蜜桃| 老女人水多毛片| 日本午夜av视频| 国产中年淑女户外野战色| 成年女人看的毛片在线观看| 性色avwww在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 精品久久久久久久久久久久久| 五月伊人婷婷丁香| 如何舔出高潮| 亚洲国产精品sss在线观看| 热99re8久久精品国产| 我的老师免费观看完整版| 国产在视频线精品| 国产av码专区亚洲av| 成人午夜高清在线视频| 岛国毛片在线播放| 免费观看人在逋| 免费观看精品视频网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 久久久久性生活片| 岛国毛片在线播放| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 99热6这里只有精品| 黄色一级大片看看| 亚洲自偷自拍三级| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本色播在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产三级在线视频| 亚洲一区高清亚洲精品| av播播在线观看一区| 国产成人aa在线观看| 三级国产精品欧美在线观看| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 夫妻性生交免费视频一级片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 色综合色国产| 免费搜索国产男女视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 在现免费观看毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久国内精品自在自线图片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 午夜福利网站1000一区二区三区| 在现免费观看毛片| 一区二区三区高清视频在线| 国产美女午夜福利| 神马国产精品三级电影在线观看| 三级毛片av免费| 免费av不卡在线播放| 国产精品一及| 热99re8久久精品国产| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲四区av| 久久精品91蜜桃| 午夜免费激情av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av卡一久久| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 一个人看的www免费观看视频| 国产高清有码在线观看视频| 伦理电影大哥的女人| 国产免费视频播放在线视频 | 日韩精品有码人妻一区| 免费黄网站久久成人精品| 欧美日韩在线观看h| 啦啦啦啦在线视频资源| 91av网一区二区| 极品教师在线视频| 久久这里只有精品中国| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲在线观看片| 国产成人精品婷婷| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产亚洲精品av在线| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲在久久综合| 嫩草影院新地址| 国产成人freesex在线| 日日干狠狠操夜夜爽| 黄色一级大片看看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本黄色视频三级网站网址| av女优亚洲男人天堂| 国产爱豆传媒在线观看| 久久人人爽人人片av| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产69精品久久久久777片| 亚洲欧美精品专区久久| 中文字幕制服av| 男女下面进入的视频免费午夜| 内地一区二区视频在线| 美女黄网站色视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 男女边吃奶边做爰视频| 中文资源天堂在线| 最近中文字幕高清免费大全6| 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产高清国产精品国产三级 | 日日啪夜夜撸| 婷婷色av中文字幕| 久久久久精品久久久久真实原创| 成年免费大片在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 午夜福利在线观看吧| 亚洲性久久影院| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲一区高清亚洲精品| 午夜福利高清视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 黄色一级大片看看| 免费观看人在逋| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级毛片久久久久久久久女| www.av在线官网国产| 亚洲国产精品成人综合色| 色综合色国产| 久久久久九九精品影院| 麻豆久久精品国产亚洲av| 午夜爱爱视频在线播放| 只有这里有精品99| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 天堂√8在线中文| 国产精品野战在线观看| 免费看美女性在线毛片视频| 国内精品一区二区在线观看| 好男人视频免费观看在线| 在线天堂最新版资源| 国产老妇伦熟女老妇高清| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久热久热在线精品观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲在线观看片| 97在线视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日本免费a在线| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品三级大全| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本wwww免费看| 嘟嘟电影网在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 1024手机看黄色片| 精品国产露脸久久av麻豆 | 成人特级av手机在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲国产精品专区欧美| 成人二区视频| 国产极品天堂在线| 国产人妻一区二区三区在| 免费观看精品视频网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一边亲一边摸免费视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| eeuss影院久久| 日韩欧美国产在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 黄片wwwwww| 一级av片app| 国产一区二区三区av在线| 99热6这里只有精品| 午夜福利高清视频| 国产片特级美女逼逼视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 精品不卡国产一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 久久久久久久久中文| 国产精品三级大全| 天天一区二区日本电影三级| 禁无遮挡网站| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产成人福利小说| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久国内精品自在自线图片| 免费看a级黄色片| 国产91av在线免费观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 中国美白少妇内射xxxbb| 嫩草影院入口| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲精品456在线播放app| av免费在线看不卡| 日韩欧美在线乱码| 美女内射精品一级片tv| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美高清性xxxxhd video| 久久精品影院6| 久久久久久久久久成人| 日韩欧美精品免费久久| 日日啪夜夜撸| a级毛色黄片| 村上凉子中文字幕在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲欧美精品专区久久| 精品无人区乱码1区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美精品一区二区大全| 成人性生交大片免费视频hd| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 嫩草影院新地址| 亚洲电影在线观看av| 国产乱来视频区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人一区二区视频在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 天堂中文最新版在线下载 | 天美传媒精品一区二区| av.在线天堂| 99热这里只有是精品在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲av福利一区| av在线亚洲专区| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品国产三级专区第一集| 欧美成人午夜免费资源| 久久久精品94久久精品| av天堂中文字幕网| 少妇熟女欧美另类| 美女国产视频在线观看| 成人欧美大片| 国产视频首页在线观看| 国产亚洲精品av在线| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 嫩草影院入口| 婷婷色麻豆天堂久久 | 亚洲国产欧美人成| h日本视频在线播放| 亚洲成人久久爱视频| 成人国产麻豆网| 麻豆一二三区av精品| 91精品伊人久久大香线蕉| ponron亚洲| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久午夜电影| .国产精品久久| 精品人妻熟女av久视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品野战在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产美女午夜福利| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| www.色视频.com| 久久人妻av系列| 亚洲18禁久久av| 久久这里有精品视频免费| 舔av片在线| 久久精品国产亚洲av涩爱| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品国产高清国产av| 久久午夜福利片| 国产精品一区二区性色av| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 美女高潮的动态| 婷婷色综合大香蕉| 国产av一区在线观看免费| 高清日韩中文字幕在线| 成人综合一区亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 国产成人freesex在线| 久久午夜福利片| 免费观看在线日韩| 国产老妇伦熟女老妇高清| 久久久亚洲精品成人影院| 日本黄色片子视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 麻豆国产97在线/欧美| .国产精品久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产亚洲91精品色在线| 九草在线视频观看| 在线免费观看不下载黄p国产| av免费在线看不卡| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 老司机影院成人| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲国产精品成人久久小说| 日韩av在线免费看完整版不卡| 99久国产av精品| 久久久久久久久大av| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 熟女电影av网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 久久久久久大精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 丰满少妇做爰视频| 91久久精品电影网| 秋霞在线观看毛片| 日本午夜av视频| 又爽又黄a免费视频| 久久久久久久久久黄片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 青青草视频在线视频观看| 中文天堂在线官网| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美+日韩+精品| 插阴视频在线观看视频| 在线观看av片永久免费下载|