哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1的克隆及表達(dá)分析

張 婷，潘 儼，孟新濤，鄭素慧，徐 斌

(新疆農(nóng)業(yè)科院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091)

哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1的克隆及表達(dá)分析

張 婷，潘 儼，孟新濤，鄭素慧，徐 斌

(新疆農(nóng)業(yè)科院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091)

目的研究CBF在哈密瓜果實(shí)采后抗冷過程中的調(diào)控功能，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1進(jìn)行克隆與表達(dá)分析，為進(jìn)一步研究哈密瓜果實(shí)低溫貯藏過程中的冷害發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。方法以新密3號(hào)采后離體果實(shí)為試材，根據(jù)已報(bào)道的甜瓜CBF1預(yù)測(cè)序列(XM_008440940),與基因組甜瓜組(https://melonomics.net)進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定基因編碼區(qū)起始和終止位置，針對(duì)CBF1編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，通過對(duì)果實(shí)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得CBF1全長(zhǎng)序列，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同溫度條件下的表達(dá)特性。結(jié)果克隆獲得哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CBF1，命名為CmCBF1，該基因序列為639 bp(GenBank登錄號(hào)為KT737742)，編碼212個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為23.89 kDa，等電點(diǎn)為5.23；同源性分析表明，哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1與草莓FaCBF1親緣關(guān)系較近，達(dá)到85%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1在1、3及5℃低溫誘導(dǎo)條件下特異性表達(dá)，在20℃室溫條件下幾乎不表達(dá)。結(jié)論轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1的表達(dá)與哈密瓜果實(shí)采后冷害發(fā)生負(fù)相關(guān)(r=-0.663)。

哈密瓜；CmCBF1；克??；表達(dá)

0 引 言

【研究意義】哈密瓜(CucumismeloL.)對(duì)低溫環(huán)境敏感，不適宜的低溫貯藏環(huán)境易引起生理代謝失調(diào)而造成細(xì)胞傷害，即所謂的冷害(chilling injury)。冷害的發(fā)生嚴(yán)重影響了哈密瓜果實(shí)商品性、抗病性和耐藏性[1,2]。研究分析哈密瓜果實(shí)的采后冷害發(fā)生機(jī)理具有十分重要的意義。隨著低溫逆境信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控路徑模型的提出，一批重要的逆境轉(zhuǎn)錄因子被相繼克隆和鑒定，為采用基因工程手段進(jìn)行植物抗寒育種及有關(guān)生理的研究提供了新的啟示，克隆并鑒定調(diào)控抗冷功能基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子成為研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】CBF(C-repeatbinding factor) 基因是一類植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，是植物抗冷途徑的樞紐，主要調(diào)控下游大量抗冷基因的表達(dá)，對(duì)增強(qiáng)植物的抗冷能力極為重要[4]，CBF的作用已在擬南芥[5,6]、黃瓜[7]、番茄[8]、甜櫻桃[9]、葡萄[10]及柑橘[11]等植物上證實(shí)。目前，有關(guān)CBF轉(zhuǎn)錄因子在植物抗冷作用的研究，大多以植物的種子、莖、葉片等器官為研究對(duì)象，以采后離體果實(shí)作為研究對(duì)象的報(bào)道甚少。近幾年，陸續(xù)從番茄[12]、桃子[13]、獼猴桃[14]及芒果[15]等果實(shí)上分離并克隆得到轉(zhuǎn)錄因子CBF，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CBF1與果實(shí)采后冷害發(fā)生關(guān)系密切。【本研究切入點(diǎn)】有關(guān)哈密瓜果實(shí)CBF的克隆與表達(dá)特性尚未見報(bào)道。研究CBF在哈密瓜果實(shí)采后抗冷過程中的調(diào)控功能，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1進(jìn)行克隆與表達(dá)分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究以新密3號(hào)采后離體果實(shí)為研究對(duì)象，分離并克隆哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CBF，分析其在不同溫度處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性，為哈密瓜果實(shí)采后冷害研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)，也為研究CBF在哈密瓜果實(shí)采后抗冷過程中的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用新密3號(hào)哈密瓜為試材，采收時(shí)果實(shí)可溶性固形物含量為11%～13%，于2014年7月21日采自新疆石河子地區(qū)121團(tuán)，采后12 h內(nèi)運(yùn)回新疆農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所冷庫(kù)。挑選大小均勻、色澤一致、網(wǎng)紋完整、無(wú)病蟲害、無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí)，分別置于械制冷庫(kù)及室溫中進(jìn)行貯藏，冷庫(kù)溫度分別設(shè)置為1、3及5℃，相對(duì)濕度為80%～85%；室溫溫度為20℃。試驗(yàn)分為2組：

第1組：1、3、5及20℃分別選取27個(gè)果實(shí)，各溫度每次取3個(gè)果實(shí)，3次重復(fù)，分別于各處理0、1、2、4、6、8、12、24和48 h，取赤道部位的果皮和果肉組織，切成小塊混勻后放入液氮中冷凍，并于-80 ℃超低溫冰箱保存，用于短時(shí)CmCBF1相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。

第2組：1、3及5℃分別選取64個(gè)果實(shí)，各溫度每次取8個(gè)果實(shí)，其中5個(gè)果實(shí)用于貯藏0、7、14、21、28、35、42及49 d冷害指數(shù)的統(tǒng)計(jì)；另3個(gè)果實(shí)用于同一時(shí)間果皮及果肉組織的取樣(用于長(zhǎng)時(shí)CmCBF1相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定)，每組試驗(yàn)各3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 冷害指數(shù)

冷害等級(jí)的劃分參考畢陽(yáng)等的方法[16]，冷害程度分為5級(jí)：0級(jí)，無(wú)冷害發(fā)生；1級(jí)，冷害發(fā)生面積≤10% ；2級(jí)，冷害發(fā)生面積11%～25%；3級(jí)，冷害發(fā)生面積25%～50%；4級(jí)，冷害發(fā)生面積≥50%。冷害指數(shù)(CII)=∑(冷害果實(shí)數(shù)×冷害級(jí)數(shù))/(總果實(shí)數(shù)×最高冷害級(jí)數(shù))

1.2.2 RNA的提取及cDNA 第一鏈的合成

采用TrizoL法提取哈密瓜果實(shí)中總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)純度(OD260/OD230比值為1.70以上符合要求)，并用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整度，將質(zhì)量完好的RNA置于-80 ℃冰箱保存。取3 μL質(zhì)量完整的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨機(jī)引物和oligo dT各取1 μL與總RNA孵育，置于65 ℃下5 min，取出立即置于冰上2 min，加入8 μL 5 ×First-stand buffer，2 μL dNTPsMixture(10mM each)，2 μL RNase Inhibiter，2 μL AMV Reverse Transcriptas，用dd H2O補(bǔ)至30 μL，合成40 μL體系的cDNA。42 ℃ 保溫60 min，75 ℃保溫15 min置于冰上冷卻，得到cDNA溶液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴(kuò)增及克隆測(cè)序

根據(jù)已報(bào)道的哈密瓜CBF1預(yù)測(cè)序列(XM_008440940)，與哈密瓜基因組數(shù)據(jù)(https://melonomics.net)進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定基因編碼區(qū)起始和終止位置，針對(duì)CBF1基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物：上游5'-ATGGATTCTTTTTCAAATTTTTATGAAG-3'，下游5' -TTAATAGCTCCATAAGGACACGTCAG-3'。引物送交上海生工合成。以合成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增采用如下體系：Primer Star DNA Polymerse(2.5 U/μL)0.5 μL，5×PS buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各0.5 μL，cDNA模板4 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性98℃ 4 min；變性98℃ 10 s；退火60℃，15 s；延伸72℃ 3 min 35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，按凝膠回收試劑盒(杭州博日)說明書回收目的片段。純化產(chǎn)物取50與100 ng pEASY-T1 simple T載體(全式金)16℃過夜連接，采取熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。次日挑取單克隆，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將檢測(cè)呈陽(yáng)性的單克隆搖菌提取質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4CmCBF1序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線進(jìn)行比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，找出與該基因同源性較高的其他物種的氨基酸序列；系統(tǒng)進(jìn)化樹由 MEGA6.1 構(gòu)建，采用鄰接法(Neighbor Joining Method)作圖，重復(fù)計(jì)算次數(shù)設(shè)為1 000；利用NCBI( http: / /blast.ncbi.nlm.nih.gov)中的ORF-finder 軟件找出哈密瓜CmCBF1的開放讀碼框，然后利用Expasy工具( http://au.expasy.org /tools/)中提供的Prot-Param 軟件和ProtScale軟件分別進(jìn)行氨基酸殘基數(shù)目、組成、蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和親/疏水性的預(yù)測(cè)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)CmCBF1基因的檢測(cè)與分析

采用CTAB[17]法分別提取1、3、5及20℃(室溫)條件下短時(shí)貯藏(0、1、2、4、6、8、12、24及48 h)及長(zhǎng)時(shí)貯藏過程中(0、7、14、21、28、35、42及49 d)哈密瓜果皮及果肉組織中的總RNA，取2 μL總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后取2 μL cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。根據(jù)已獲得的CmCBF1的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物：上游5’-CGTCGCCCCATTTTCTCCGATG-3’，下游5’- GCCATCATCCCATTTTCCGTCCT -3’。選取哈密瓜EF1a作為其內(nèi)參基因：上游5’-AAATACTCCAAGGCAAGGTACGAT-3’，下游5’-TCATGTTGTCACCCTCGAAACC AG-3’。實(shí)驗(yàn)在Realtime PCR儀(Light Cycler 480，Roche)上進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，反應(yīng)采用25 μL體系，包括2 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，12.5 μL SYBR GREENⅠMaster Mix (Toyobo，Osaka，Japan)，9.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增的具體程序?yàn)椋?5℃ 15 min，95℃ 10 s，58℃ 20 s，72℃退火20 s，55個(gè)循環(huán)。為了確認(rèn)產(chǎn)物的質(zhì)量和引物的特異性，對(duì)溶解曲線進(jìn)行分析。分別將常溫處理0 d的哈密瓜果皮和果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量設(shè)為1，按照2-ΔΔCT法[18]計(jì)算出CmCBF1的相對(duì)表達(dá)量，其它各時(shí)間點(diǎn)樣品的基因表達(dá)量與其進(jìn)行比較，即獲得相對(duì)表達(dá)值，上述樣品中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SigmaPlot12.0作圖，SPSS17.0軟件ANOVA方法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，相關(guān)性分析使用Person雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1克隆及序列

以哈密瓜果實(shí)cDNA第一鏈為模板，用引物CBF1-F/CBF1-R擴(kuò)增出了639 bp左右的目的片段。測(cè)序結(jié)果顯示該片段與哈密瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中目的基因核酸序列的一致性為100%，表明已成功克隆到哈密瓜CBF1，命名為CmCBF1，GenBank 登錄號(hào)為KT737742。測(cè)序結(jié)果顯示，該基因的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼212個(gè)氨基酸。ProtScale軟件分析結(jié)果顯示，編碼蛋白質(zhì)分子量為23.89 kDa，等電點(diǎn)為5.23。圖1，圖2

對(duì)哈密瓜果實(shí)CmCBF推導(dǎo)的氨基酸序列與其他物種CBF/DREB蛋白進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)CmCBF1包含有一個(gè)高度保守的AP2/EREBPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CmCBF1在該結(jié)構(gòu)域的上游和下游分別有兩段保守序列：KK/RP AGRxKFxETRHP和DSAWR。此外，CmCBF1含有高度保守的第14位的擷氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E)，這是使CBF轉(zhuǎn)錄因子能夠與DRE/CRT順式作用元件結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[19]。序列分析表明，CmCBF1和同其它物種的CBF/DREB蛋白一樣，也具有CBF所有的序列特征。圖3

M: 分子量標(biāo)準(zhǔn), 1: cDNA的PCR結(jié)果

M: The molecular weight standard; 1: PCR products corresponding to cDNA samples

圖1哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1保守片段的PCR擴(kuò)增

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCRproductsofCmCBF1

ATG 為起始密碼子；TAA為終止密碼子；下劃線為為特征序列KK/RP AGRxKFxETRHP和DSSWR

ATG indicate the start codon; TAA indicates the stop codon; Single underline indicate the characteristic sequence KK/RP AGRxKFxETRHP and DSSWR

圖2哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1cDNA的核苷酸序列(上排)及全推導(dǎo)氨基酸序列(下排)

Fig.2 Schematic representation of the nucleotide sequence (upper lines) and its deduced aminoacidsequence(glowerlines)ofCmCBF1cDNA

2.2哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹

將哈密瓜CmCBF1的核酸序列提交至NCBI，與其他物種的CBF1氨基酸序列進(jìn)行在線同源比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果顯示，哈密瓜CmCBF1氨基酸序列與草莓FaCmCBF1(ABV65907.2)的相似性較高，達(dá)到85%，其次為麻風(fēng)樹JcCmCBF1(XP_012090326.1)和番茄LeCmCBF1(AAK57551.1)，相似度分別為52.21%和45.42%，與蘋果MdCmCBF1(AAZ20446.1)、白樺BpCmCBF1(ADZ23479．1)、黃瓜CsCBF1(ABG38530.1)、擬南芥AtCBF1(ABV27083.1)及大麥HvCmCBF1(AF418204_1)等其他物種的CBF1蛋白相似度較低。圖3，圖4

注：黃瓜CsCBF1；擬南芥AtCBF1；草莓FaCmCBF1；白樺BpCmCBF1；番茄LeCmCBF1；蘋果MdCmCBF1；大麥HvCmCBF1；麻風(fēng)樹JcCmCBF1)的多重比對(duì)。方框中為特征序列，劃線部分為AP2/EREBP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，保守的氨基酸殘基用五角星號(hào)表示

Note:Cucumissativus,CsCBF1;Arabidopsisthaliana,AtCBF1;Fragariaananassa,FaCmCBF1;Betulaplatyphylla,BpCmCBF1;Lycopersiconesculentum,LeCmCBF1;Malusdomestica,MdCmCBF1;Hordeumvulgare,HvCmCBF1;JatrophacurcasJcCmCBF1).CBF/DREBsignature sequences were labeled in boxes. Black bold underline represented the conservedAP2/EREBPDNA-binding domain. The fourteenth and nineteenth amino acids ofAP2/EREBPdomain were marked by asterisks

圖3哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1與預(yù)測(cè)的蛋白序列與其他物種CBF/DREB蛋白

Fig.3AmultiplealignmentofpredictedCmCBF1proteinsequencewith8otherreportedCBF/DREBproteins

圖4 哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1與其他8個(gè)物種CBF/DREB蛋白序列同源進(jìn)化樹分析

Fig.4 Analysis of the homologous phylogenetic tree of CmCBF1 protein sequence and 8 other reported CBF/DREB proteins

2.3不同貯藏溫度對(duì)哈密瓜果實(shí)冷害指數(shù)影響

研究表明，不同低溫貯藏條件，新密3號(hào)果實(shí)均發(fā)生冷害，但冷害出現(xiàn)的時(shí)間和發(fā)生程度不同。1和3℃貯藏7 d，移至常溫3 d后，新密3號(hào)果實(shí)出現(xiàn)明顯的冷害癥狀，5℃貯藏14 d移至常溫3 d后出現(xiàn)冷害，主要癥狀表現(xiàn)為：果皮出現(xiàn)褐斑，面積由小變大，至貯藏后期，整個(gè)果皮完全變色，甚至出現(xiàn)腐爛；然而整個(gè)貯期內(nèi)，果肉組織未見明顯的冷害癥狀。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度條件下新密3號(hào)果實(shí)冷害癥狀加重，冷害指數(shù)逐漸增大。整個(gè)低溫貯藏過程中，5℃貯藏條件下，新密3號(hào)果實(shí)冷害指數(shù)顯著低于1和3℃(P<0.05)，而1和3℃條件下，果實(shí)冷害指數(shù)差異不明顯(P>0.05)?？梢姡旅?號(hào)果實(shí)對(duì)低溫較為敏感，5℃及以下溫度貯藏均出現(xiàn)冷害癥狀。圖5

2.4不同溫度脅迫對(duì)哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1短時(shí)相對(duì)表達(dá)量的影響

實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR檢測(cè)分析結(jié)果顯示，不同溫度脅迫條件下，新密3號(hào)果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1短時(shí)相對(duì)表達(dá)量不同。研究表明，20℃常溫放置2 h以后，新密3號(hào)果皮及果肉組織中的CmCBF1幾乎不表達(dá)；1、3和5℃低溫脅迫條件下的哈密瓜果實(shí)，果皮及果肉組織中的CmCBF1相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在6和12 h達(dá)到高峰，且果皮組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量顯著高于果肉(P<0.05)。不同低溫脅迫條件下的新密3號(hào)果皮及果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量不同，5℃脅迫條件下的新密3號(hào)果皮及果肉組織中的CmCBF1相對(duì)表達(dá)量顯著高于1和3℃(P<0.05)?？梢?，新密3號(hào)果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1受低溫誘導(dǎo)特異性表達(dá)。圖6

2.5不同貯藏溫度對(duì)哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1長(zhǎng)時(shí)相對(duì)表達(dá)量的影響

研究表明，不同貯藏溫度條件下，新密3號(hào)果皮及果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在貯藏14和21 d達(dá)到峰值，果皮組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量也顯著高于果肉組織(P<0.05)。隨著貯藏溫度的升高，新密3號(hào)果實(shí)冷害指數(shù)降低，5℃貯藏的新密3號(hào)果皮及果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量顯著高于1和3℃，而1和3 ℃低溫貯藏條件下的新密3號(hào)果皮及果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。新密3號(hào)果實(shí)CmCBF1相對(duì)表達(dá)量與其冷害發(fā)生具有一定的相關(guān)性。圖7

圖5 不同貯藏溫度下哈密瓜果實(shí)冷害指數(shù)變化

Fig.5 Effect of chilling injury index of Hami melon fruit under different temperatures

圖6 不同貯藏溫度脅迫下哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1短時(shí)相對(duì)表達(dá)量變化

圖7 不同貯藏溫度下哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1長(zhǎng)時(shí)相對(duì)表達(dá)量變化

3 討 論

CBF在植物中多以基因家族形式存在，不同物種家族成員的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)差異很大，但它們都含有一個(gè)由60個(gè)左右氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合區(qū)(即AP2/EREBP結(jié)合域)，在不同的植物中非常保守[20]。研究根據(jù)已公布的甜瓜基因組的網(wǎng)站https://melonomics.net，通過其它植物已知的CBF1，預(yù)測(cè)甜瓜CBF1序列(XM_008440940)設(shè)計(jì)引物，克隆得到了哈密瓜CmCBF1(GenBank登錄號(hào)：KT737742)，編碼212個(gè)氨基酸。序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)CmCBF1包含有一個(gè)高度保守的AP2/EREBP DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，表明其具有CBF所有的序列特征，即具有一個(gè)非常保守的AP2/EREB P結(jié)合域，由約58個(gè)氨基酸殘基組成。在CmCBF1蛋白中，第14位的擷氨酸和第19位的谷氨酸的保守存在可能決定其蛋白對(duì)順式作用元件ACCGAC和GCCGAC(CRT元件的核心序列)具有相同的結(jié)合活性[21]。

序列分析結(jié)果表明，CmCBF1結(jié)構(gòu)域的上下游均含有保守序列KK/RPAGRxKFxETRHP和DSAWR，這在草莓FaCmCBF1(ABV65907.2)、麻風(fēng)樹JcCmCBF1(XP_012090326.1)、番茄LeCmCBF1(AAK57551.1)、蘋果MdCmCBF1(AAZ20446.1)、白樺BpCmCBF1(ADZ23479．1)、黃瓜CsCBF1(ABG38530.1)、擬南芥AtCBF1(ABV27083.1)及大麥HvCmCBF1(AF418204_1)等其他物種的CBF1蛋白上均含有這兩段多肽序列(圖3)，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，哈密瓜CmCBF1和草莓FaCBF1同源性較高，推測(cè)其進(jìn)化過程中在功能上較為相似。

研究發(fā)現(xiàn)，新密3號(hào)果實(shí)在1、3及5℃低溫貯藏條件下均有冷害發(fā)生，表明其對(duì)低溫較為敏感，這與陳娟等[22]研究結(jié)果一致。為了研究哈密瓜果實(shí)對(duì)不同溫度誘導(dǎo)過程中的響應(yīng)機(jī)制，開展不同溫度處理對(duì)CmCBF1的表達(dá)模式的研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新密3號(hào)果皮及果肉組織中的CmCBF1在常溫(20℃)幾乎不表達(dá)，而在1、3和5℃低溫脅迫條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，分別在6和12 h達(dá)到高峰，表明哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1可被低溫短時(shí)誘導(dǎo)，這一結(jié)果與擬南芥[5]、番茄[12]及桃子[13]等植物上的報(bào)道一致。

隨著低溫貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，新密3號(hào)果皮及果肉組織中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì)，分別在貯藏14和21 d時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸下降，至貯藏末期，CmCBF1幾乎不表達(dá)，表明CmCBF1對(duì)低溫的響應(yīng)有一定的時(shí)間期限，這與桃子[13]和獼猴桃[14]等果實(shí)上的報(bào)道較為相似。無(wú)論是短時(shí)低溫誘導(dǎo)還是長(zhǎng)時(shí)低溫誘導(dǎo)，冷害指數(shù)較低的5℃貯藏條件下CmCBF1的相對(duì)表達(dá)量顯著高于冷害指數(shù)較高的1和3℃，可以看出，CmCBF1相對(duì)表達(dá)量高的新密3號(hào)果實(shí)，冷害發(fā)生率低。由此推測(cè)，轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1與哈密瓜果實(shí)采后冷害發(fā)生具有一定的相關(guān)性。為了進(jìn)一步證實(shí)這一觀點(diǎn)，對(duì)新密3號(hào)不同貯藏溫度下果皮及果肉中CmCBF1的相對(duì)表達(dá)量與果實(shí)冷害指數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果皮中CmCBF1相對(duì)表達(dá)量與哈密瓜冷害指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.633)。這一結(jié)果亦在番茄[12]、桃子[13]、獼猴桃[14]及芒果[15]等果實(shí)上被證實(shí)。此外，試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，果皮中CmCBF1的表達(dá)比果肉早6 h，且顯著高于果肉(P﹤0.05)，這可能由于哈密瓜果皮及果肉組織的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致其對(duì)溫度感應(yīng)不同所致[23]。

4 結(jié) 論

克隆獲得哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CBF1，命名為CmCBF1，該基因序列為639 bp(GenBank登錄號(hào)為KT737742)，編碼212個(gè)氨基酸；同源性分析結(jié)果表明，哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1與草莓FaCBF1親緣關(guān)系較近，達(dá)到85%。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，哈密瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄因子CmCBF1受低溫誘導(dǎo)特異性表達(dá)，CmCBF1相對(duì)表達(dá)量與哈密瓜果實(shí)采后冷害發(fā)生負(fù)相關(guān)(r=-0.663)，為進(jìn)一步研究哈密瓜果實(shí)低溫貯藏過程中的冷害發(fā)生機(jī)制提供理論依據(jù)。

References)

[1] 王堅(jiān).中國(guó)西瓜甜瓜[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.

WANG Jian. (2000).ChineseWatermelon[M]. Beijing: China Agriculture Press. (in Chinese)

[2] 劉同業(yè),張婷,車?guó)P斌,等.不同貯藏溫度下西周密25號(hào)哈密瓜果實(shí)冷害生理的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,52(1):26-32.

LIU Tong-ye, ZHANG Ting, CHE Feng-bin, et al. (2015). Studies on Chilling Injury Physiology of 'Xizhoumi No.25' Hami Melon Fruits at Different Storage Temperature [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(1):26-32. (in Chinese)

[3] 李科友,朱海蘭.植物非生物逆境脅迫DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué),2011,(47):124-134.

LI Ke-you ZHU Hai-la. (2011).Research progress Of DREB/CBF transcription factor in Response to abiotic-stresses in plants [J].ScientiaSilvaeSinicae, (47):124-134. (in Chinese)

[4] 呂勝男,申吉萍,趙丹瑩,等. CBF基因調(diào)控植物抗冷徑途的研究進(jìn)展[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2011, 31( 6) : 1 275-1 281.

Lü Sheng-nan, SHEN Ji-ping, ZHAO Dan- ying, et al. (2011). Advances of plant cold-resistance pathway regulated by CBF gene [J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 31(6): 1,275-1,281. (in Chinese)

[5] Chiang, D. A., Keh, H. C., Huang, H. H., & Chyr, D. (2002). Transcription factor cbf4 is a regulator of drought adaptation in arabidopsis.PlantPhysiology, 130(2):639-648.

[6] Gilmour, S. J., Fowler, S. G., & Thomashow, M. F. (2004). Arabidopsis transcriptional activators cbf1, cbf2, and cbf3 have matching functional activities.PlantMolecularBiology, 54(5):767-781.

[7] 李丹,蔣欣梅,于錫宏.黃瓜中CBF1基因的克隆及其表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)通訊,2010,46(3):245-248.

LI Dan, JIANG Xin-Mei, YU Xi-Hong. (2010).Cloning and Expression Analysis of CBF1 from Cucumber (Cucumis sativus L.) [J].PlantPhysiologyCommunications, 46(3): 245-248. (in Chinese)

[8] Zhang, X., Fowler, S. G., Cheng, H., Lou, Y., Rhee, S. Y., & Stockinger, E. J., et al. (2004). Freezing‐sensitive tomato has a functional cbf cold response pathway, but a cbf regulon that differs from that of freezing‐tolerant arabidopsis.PlantJournalforCell&MolecularBiology, 39(6):905-919.

[9] Kitashiba, H., Matsuda, N., Ishizaka, T., Nakano, H., & Suzuki, T. (2002). Isolation of genes similar to dreb1/cbf from sweet cherry (prunusaviuml.).EngeiGakkaiZasshi, 71(5): 651-657.

[10] Fernandez-Caballero, C., Rosales, R., Romero, I., Escribano, M. I., Merodio, C., & Sanchez-Ballesta, M. T. (2012). Unraveling the roles of cbf1, cbf4 and dehydrin 1 genes in the response of table grapes to high co2levels and low temperature.JournalofPlantPhysiology, 169(7): 744-748.

[11] He, L. G., Wang, H. L., Liu, D. C., Zhao, Y. J., Xu, M., & Zhu, M., et al. (2012). Isolation and expression of a cold-responsive gene ptcbf, in poncirus trifoliata, and isolation of citrus cbf, promoters.BiologiaPlantarum, 56(3): 484-492.

[12] Zhang, X., Fowler, S. G., Cheng, H., Lou, Y., Rhee, S. Y., & Stockinger, E. J., et al. (2004). Freezing‐sensitive tomato has a functional cbf cold response pathway, but a cbf regulon that differs from that of freezing‐tolerant arabidopsis.PlantJournalforCell&MolecularBiology, 39(6):905-919.

[13] Liang, L., Zhang, B., Yin, X. R., Xu, C. J., Sun, C. D., & Chen, K. S. (2013). Differential expression of the cbf, gene family during postharvest cold storage and subsequent shelf-life of peach fruit.PlantMolecularBiologyReporter, 31(6):1,358-1,367.

[14] Ma, Q., Suo, J., Huber, D. J., Dong, X., Han, Y., & Zhang, Z., et al. (2014). Effect of hot water treatments on chilling injury and expression of a new c-repeat binding factor ( cbf ) in 'Hongyang' kiwifruit during low temperature storage.PostharvestBiology&Technology, 97:102-110.

[15] Zhang, Z., Zhu, Q., Hu, M., Gao, Z., An, F., & Li, M., et al. (2017). Low-temperature conditioning induces chilling tolerance in stored mango fruit.FoodChemistry, 219: 76-84.

[16] Yang, B., Shiping, T., Hongxia, L., Jie, Z., Jiankang, C., & Yongcai, L., et al. (2003). Effect of temperature on chilling injury, decay and quality of hami melon during storage.PostharvestBiology&Technology, 29(2): 229-232.

[17] Chang, S., Puryear, J., & Cairney, J. (1993). A simple and efficient method for isolating rna from pine trees.PlantMolecularBiologyReporter, 11(2): 113-116.

[18] Livak, K.J., & Schmittgen, T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitativePCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.Methods, (25): 402-408.

[19] Sakuma, Y., Liu, Q., Dubouzet, J. G., Abe, H., Shinozaki, K., & Yamaguchishinozaki, K. (2002). Dna-binding specificity of the erf/ap2 domain of arabidopsis drebs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression.Biochemical&BiophysicalResearchCommunications, 290(3): 998-1,009.

[20] Okamuro, J. K., Caster, B., Villarroel, R., Van, M. M., & Jofuku, K. D. (1997). The ap2 domain of apetala2 defines a large new family of dna binding proteins in arabidopsis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 94(13): 7,076-7,081.

[21] Dubouzet, J. G., Sakuma, Y., Ito, Y., Kasuga, M., Dubouzet, E. G., & Miura, S., et al. (2003). Osdreb genes in rice, oryza sativa l. encode transcription activators that function in drought‐, high‐salt‐ and cold‐responsive gene expression.PlantJournalforCell&MolecularBiology,33(4):751-763.

[22] 陳娟,張婷,車?guó)P斌,等. NO處理對(duì)哈密瓜果實(shí)采后冷害及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,52(12):2 238-2 244.

CHENG Juan, ZHANG Ting, CHE Feng-bin, et al. (2015). Effects of Nitric Oxide Fumigation Treatments on Chilling Injury and Osmotic Regulatory Metabolites Contents of Hami Melon Fruits during Cold Storage [J].XinjiangAgriculturalSciences, 52(12): 2,238-2,244. (in Chinese)

[23] 潘儼,車?guó)P斌,吳斌,等. 2012. 預(yù)冷對(duì)哈密瓜采后乙烯釋放和呼吸強(qiáng)度的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 49(8): 1 391-1 396.

PAN Yan, CHE Feng-bin, WU Bin, et al. (2012). Effect of Precooling on Ethylene Release and Respiration Rate of Hami Melon [J].XinjiangAgriculturalSciences, 49(8): 1,391-1,396. (in Chinese)

CloningandExpressionAnalysisofaCRT/DRE-bindingFactorGeneCmCBF1fromHamiMelonFruit

ZHANG Ting, PAN Yan, MENG Xin-tao, ZHENG Su-hui, XU Bin

(1.ResearchInstituteofAgriculturalProductsStorageandProcessing，XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

ObjectiveIn order to make clear the regulatory function ofCBFgene in the cold tolerance of Hami melon fruits, the transcription factor namedCmCBF1was cloned and expression analysis was carried out.Method'Xinmi No.3' Hami melon postharvest fruit was selected as materials. The primers used to amplify the full-length coding sequences were designed based on the predictedCBF1gene sequence (XM_008440940). These sequences were used as the templates in blast searches against the melon genome databases (https://melonomics.net), and the ATG and TAA codons of the coding regions were determined. Specific primers were designed based on the conserved regions ofCBF1, The resulting cDNA was employed as a template for PCR reactions using gene-specific primers to amplify the coding regions ofCmCBF1, the expression ofCmCBF1was carried out in triplicate with different cDNA samples synthesized from tissue collected at each sampling time with PCR amplification.ResultTheCmCBF1gene from the cDNA contained an open reading frame of 639 bp, its GenBank accession number was KT737742, which encoded a polypeptide of 212 amino acids residues with a molecular mass of 23.89 kD and a pI of 5.23. The sequence homology comparison showed that theCmCBF1had a relatively close evolutionary relationship with Fragariaananassa,FaCmCBF1, which shared 85 %. RT-PCR analysis showed that the expression ofCmCBF1was induced by low temperature, including 1℃、3℃ and 5℃, but not expressed at room temperature at 20℃.ConclusionThere is a negative correlation between the relative expression of transcription factorCmCBF1and the incidence of chilling injury of Hami melon fruit, which provides the theoretical basis for studying the mechanism of the incidence of chilling injury of Hami melon fruit during the storage at low temperature.

Hami melon fruit;CmCBF1; gene cloning; gene expression

ZHANG Ting (1980-), female, native place: Meixian, Shanxi. Associate professor, research field: Postharvest physiology and molecular biology of fruit. (E-mail)zhangtingkikie@163.com

S652

A

1001-4330(2017)10-1765-10

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.10.001

2017-08-14

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目“哈密瓜抗冷途徑中CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與表達(dá)”(2014211B026)

張婷(1980-)，女，陜西眉縣人，副研究員，博士，研究方向?yàn)楣凡珊笊砑胺肿由飳W(xué)，(E-mail)zhangtingkikie@163.com

Supported by: The Natural Science Foundation of Xinjiang, China "Cloning and expression analysis of a CRT/DRE-binding factor gene CBF from Hami melon fruit during cold resistance pathway" (2014211B026)