新型序貫應(yīng)激法致焦慮樣胃高敏感性大鼠功能性消化不良模型的建立

景富春，張軍，馮誠，年媛媛，楊寶德，胡浩,，孫曉明，鄭建云

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 西安 710004； 2. 延安大學附屬寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 陜西 寶雞 721000； 3. 西安交通大學醫(yī)學部藥理學系， 西安 710068； 4. 西安交通大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心， 西安 710068； 5. 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科， 西安 710077)

研究報告

新型序貫應(yīng)激法致焦慮樣胃高敏感性大鼠功能性消化不良模型的建立

景富春1,2，張軍1，馮誠1，年媛媛1，楊寶德3，胡浩3,4，孫曉明4，鄭建云5

(1. 西安交通大學第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科， 西安 710004； 2. 延安大學附屬寶雞市人民醫(yī)院消化內(nèi)科， 陜西 寶雞 721000； 3. 西安交通大學醫(yī)學部藥理學系， 西安 710068； 4. 西安交通大學醫(yī)學部基礎(chǔ)醫(yī)學實驗教學中心， 西安 710068； 5. 西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科， 西安 710077)

目的應(yīng)用新型序貫應(yīng)激法建立焦慮樣胃高敏感性大鼠模型。方法將新生大鼠幼仔隨機分為對照組與模型組，每組13只。出生后第2天起序貫采用胃刺激法、母嬰分離法和束縛應(yīng)激法制作焦慮樣胃高敏感性模型。于第8周開始采用高架十字迷宮試驗(EPM)、曠場試驗(OF)、腹肌回縮試驗(AWR)、肌電圖試驗(EMG)和胃排空試驗(GET)等評價模型成功與否。結(jié)果EPM和OF實驗提示模型組大鼠較對照組表現(xiàn)出明顯的焦慮樣行為，AWR和EMG實驗顯示模型組大鼠對胃擴張刺激的敏感性亦顯著升高(P<0.05，P<0.01)，但兩組在體重變化和胃黏膜炎癥反應(yīng)方面差異無顯著性，符合胃敏感性增高為主功能性消化不良的臨床特點。結(jié)論應(yīng)用新型序貫應(yīng)激法可成功建立焦慮樣胃高敏感性大鼠模型。

序貫應(yīng)激法；焦慮；胃高敏感性；功能性消化不良；大鼠；模型

胃高敏感性(gastric hypersensitivity, GHS)是功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)的特征性發(fā)病機制之一[1-4]，也是FD的重要病理生理改變。它不僅與FD的主要癥狀餐后上腹痛密切相關(guān)，也參與了上腹飽脹、惡心、嘔吐等其他FD癥狀的發(fā)生[5-7]，是FD治療效果差且易于復(fù)發(fā)的重要原因。臨床研究表明，35%～65%的FD患者存在不同程度的胃敏感性增高[5]，其中10%～25%的個體患有GHS相關(guān)的餐后上腹痛[8，9]。由此可見，闡明GHS的發(fā)生機制對FD患者的臨床診治和藥物開發(fā)至關(guān)重要。

焦慮是臨床常見的精神心理應(yīng)激狀態(tài)，也是FD患者常見的伴隨癥狀[10]，發(fā)生率高達40%～90%[11]，是誘發(fā)或加重FD的重要因素[12-14]。但是，焦慮等精神心理因素如何影響FD的發(fā)生和發(fā)展，其與FD尤其是GHS形成的關(guān)系是什么，目前尚不十分清楚。究其原因主要是臨床上缺乏相應(yīng)的病人和正常人活體組織標本，而基礎(chǔ)研究中則缺乏適宜的動物模型供研究使用[15]。因此，建立伴焦慮癥狀的GHS動物模型是探討FD的病因和發(fā)病機制、開發(fā)FD防治藥物的重要手段之一。既往已有研究人員分別運用新生幼仔胃刺激法(AGI)、母嬰分離法 (NMS)或束縛應(yīng)激法(RS)建立了GHS大鼠模型和FD大鼠模型[16，17]，但伴焦慮癥狀的GHS大鼠模型則尚未見報道。

本研究擬將上述兩種方法與精神心理實驗方法結(jié)合，建立一種新型焦慮樣胃高敏感性大鼠模型，以為探討FD及GHS的發(fā)生機制、開發(fā)相關(guān)治療藥物提供可供選擇的手段和工具。

1 材料與方法

1.1動物及分組

SPF級雄性1日齡SD大鼠32只，體重3～5 g，購自第四軍醫(yī)大學實驗動物中心【SCXK(陜)2014-002】。隨機分為對照組與模型組，每組16只，其中8只造模成功后用于進行全部行為學及肌電圖等實驗，8只用于胃黏膜炎癥評價實驗。母嬰同籠飼養(yǎng)、造模實驗及無菌手術(shù)均于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心進行【SYXK(陜)2012-005】，室溫(22±2)℃，相對濕度(50±20)%，按12/12 h明暗循環(huán)，母鼠自由進食和飲水。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。

1.2試劑

碘乙酰胺(iodoacetamide，IA)購自上海麥克林公司，蔗糖購自國藥集團，戊巴比妥鈉購自德國Merck公司。甲醛及其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。

1.3儀器

PMT-100型大鼠高架十字迷宮由成都泰盟科技公司生產(chǎn)，由表面用無光澤黑色丙烯酸涂裝的中密度纖維板制作，包括兩個開放臂和兩個閉合臂，均長50 cm、寬10 cm，閉合臂的側(cè)壁高30 cm，同一類型的臂對接后呈十字形，十字中央?yún)^(qū)長寬為10 cm × 10 cm。四個臂置于距地面50 cm高的支架上。正上方安裝視頻攝像追蹤系統(tǒng)。曠場實驗裝置為自制，箱高30 cm，底邊長100 cm，底面平均分為5個20 cm × 20 cm小方格。生物機能實驗系統(tǒng)由成都泰盟公司生產(chǎn)的BL-420S及其配套軟件TM-WAVE組成。PE-240充氣導(dǎo)管為江西洪達醫(yī)療用品公司生產(chǎn)。大鼠束縛應(yīng)激裝置為自制的長15 cm、直徑6 cm之塑料圓筒，兩端自由通氣。

1.4造模方法

1.4.1 母嬰分離法 (NMS)[18]

模型組乳鼠自出生后第2天起，每天與母鼠分離3 h，時間為上午9:00-12:00，至滿3周時結(jié)束。對照組母嬰常規(guī)同籠飼養(yǎng)。所有幼鼠自出生后第22天斷奶，與母鼠完全分離，單籠飼養(yǎng)至生后第8周進入束縛應(yīng)激試驗。

1.4.2 束縛應(yīng)激法(RS)[19]

經(jīng)母嬰分離等實驗后發(fā)育而成的雄性SD大鼠，于生后第8周接受束縛應(yīng)激試驗。每只大鼠每天被置于通風良好的束縛應(yīng)激裝置內(nèi)，持續(xù)90 min后放回原籠，連續(xù)1周。

1.4.3 新生幼仔胃刺激法(AGI)[16]

模型組乳鼠于出生后第10天起，每天采用含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液灌胃0.2 mL，對照組僅用等容積2%蔗糖溶液灌胃，連續(xù)6 d。

1.5模型評價方法

1.5.1 體重測定

于灌胃后第2～6天、第18天及第56天分別將兩組大鼠稱重，觀察其體重變化。

1.5.2 高架十字迷宮試驗(elevated plus maze, EPM)[20]

將每只大鼠以同樣方式置于高架十字迷宮中央?yún)^(qū)、面向?qū)嶒炚邔?cè)的開放臂，同時立即開啟視頻攝像追蹤系統(tǒng)并同步計時5 min，記錄大鼠進入開放臂及閉合臂的次數(shù)、在開放臂及閉合臂內(nèi)的停留時間(注意大鼠的四爪全部到達一個臂內(nèi)方可計算為一次進入)。每只大鼠實驗結(jié)束后將實驗儀器四臂用10%乙醇清潔并用紙巾擦干以消除不同動物氣味的干擾。

1.5.3 曠場(open field, OF)試驗[21]

將大鼠置于反應(yīng)箱底部中心格內(nèi)并立即開始計時，記錄5 min內(nèi)大鼠在中央格的停留時間(從大鼠放入中心格計時開始至4爪均離開此格的時間)；穿行格數(shù)(大鼠4爪均進入中心格以外方格的總數(shù))；直立次數(shù)(前2爪離地1 cm以上的站立次數(shù)，攀附墻壁亦計算在內(nèi))；修飾行為。每只大鼠檢測完畢后均用10%乙醇清潔反應(yīng)箱內(nèi)壁及底面并用紙巾擦干，以排除上次動物的大小便、氣味等余留信息對下次檢測的影響。

1.5.4 氣囊和電極植入術(shù)[22]

大鼠術(shù)前夜禁食但不禁飲水。將大鼠用戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，整個手術(shù)過程均在嚴格消毒下進行。事先將用乳膠手套制作的2.5 cm長的氣囊連接固定于PE240導(dǎo)管上。術(shù)中在大鼠側(cè)腹部切開一條長約3～4 cm的切口，暴露胃，將氣囊從胃底部切口插入胃內(nèi)，適當固定并檢查在不充氣情況下，幽門不出現(xiàn)梗阻且不影響胃排空。然后將胃底的切口緊密結(jié)扎以防止胃液漏入腹腔。將連接胃氣囊的聚乙烯導(dǎo)管經(jīng)皮下放置到頸背部并露出皮膚。氣囊植入完成后，腹腔及腹部切口予以縫合。

電極植入：將消毒過的不銹鋼電極線植入到肩斜方肌(頸部表淺肌肉)上，縫合切口。

1.5.5 腹肌回縮試驗

腹肌回縮試驗(abdominal withdrawal reflex，AWR)于胃氣囊植入術(shù)后第6天進行，主要用于測定大鼠對胃氣囊擴張時的行為學反應(yīng)。胃氣囊充氣壓力梯度為20、40、60、80、100 mmHg，每個壓力持續(xù)20 s，間隔2 min[15]。其評分標準如文獻[16]所述：0，對胃擴張無行為反應(yīng)；1，簡單頭部運動；2，腹肌收縮；3，腹部抬高；4，軀體弓形，骨盆抬高或身體扭伸。

1.5.6 肌電圖試驗[22]

肌電圖(electromyography，EMG)是用于量化記錄大鼠對胃擴張反應(yīng)產(chǎn)生肌電活動的一種方法，與AWR同步進行。實驗時先采集基線肌電圖數(shù)據(jù)，然后分別記錄前述不同胃氣囊充氣壓力梯度下的EMG。所獲原始數(shù)據(jù)通過計算曲線下面積加以量化，胃對胃擴張的反應(yīng)以不同胃氣囊充氣壓力梯度下曲線下面積增加的百分比表示。

1.5.7 胃排空試驗[23]

兩組動物各另取若干只進行胃排空試驗。先將大鼠禁食一夜，實驗開始后允許自由進食和飲水3 h，然后撤去飲食，繼續(xù)觀察3 h后處死，取胃稱重后將胃內(nèi)食物全部倒出并稱重。胃排空率(%)=100 — (胃內(nèi)容物重量/攝食量) × 100。

1.5.8 胃黏膜炎癥反應(yīng)評價

(1)組織學評價

另取兩組大鼠在接受IA或蔗糖灌胃后第6天和第8周被迅速處死后，取胃底組織1塊，置入10%甲醛溶液中固定48～72 h，蠟塊包埋切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察胃黏膜炎癥情況。

(2)MPO試驗[24]

組織學評價同時，取同一胃組織按MPO試劑盒說明書進行試驗，ELISA法檢測，結(jié)果以每單位MPO活性/組織干重表示。

1.6統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1體重變化

模型組和對照組大鼠在含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液或2%蔗糖溶液灌胃及母嬰分離法處理同時，自出生后第2～6天、第18天和第56天分別稱重，結(jié)果顯示模型組大鼠體重增加百分比在上述各時間點均低于對照組，對照組體重增長率呈現(xiàn)高于模型組的趨勢，但兩組間的體重變化差異無顯著性(P>0.05)。結(jié)果見圖1。

2.2胃黏膜炎癥反應(yīng)

在含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液或2%蔗糖溶液灌胃后第6天，胃黏膜HE染色發(fā)現(xiàn)黏膜表面炎癥反應(yīng)以模型組大鼠較明顯，但MPO試驗結(jié)果提示其與對照組間炎癥未見明顯差異。第56天序貫應(yīng)激結(jié)束后，模型組和對照組胃黏膜炎癥反應(yīng)的HE染色和MPO試驗均未見明顯異常。見圖2。

圖1 兩組大鼠的體重變化Fig.1 Body changes in the two groups

圖2 模型組和對照組大鼠幼年和成年胃組織學(A 和 C)和MPO活性(B和 D)試驗Fig.2 Changes of gastric histological (A and C) and MPO activity (B and D) in neonatal and adult rats of the control and model groups

2.3焦慮樣行為試驗

2.3.1 EPM

與對照組比較，模型組大鼠進入開放臂次數(shù)/進入開放臂和閉合臂總次數(shù)、在開放臂停留時間/在開放臂和閉合臂停留總時間的比值均降低，組間比較差異有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠高架十字迷宮實驗結(jié)果比較Tab.1 Comparison of the results of elevated plus maze test between the two groups

注：與對照組比較,*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.3.2 OF試驗

與對照組比較，模型組大鼠在中央格停留時間明顯縮短(P<0.05)、穿行格數(shù)和直立次數(shù)明顯減少(P<0.01)，但在修飾行為方面差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.4胃敏感性變化

胃敏感性改變主要通過AWR和EMG實驗加以驗證。

2.4.1 AWR實驗

經(jīng)碘乙酰胺灌胃和序貫應(yīng)激處理后，模型組大鼠對胃擴張的敏感性明顯增加，擴張壓達到40 mmHg以上時AWR得分明顯高于對照組(P<0.05)。見表3。

2.4.2 肌電圖試驗 (EMG) 試驗

與AWR實驗結(jié)果相似，模型組大鼠在擴張壓達到40 mm Hg以上時肩斜方肌EMG曲線下面積較對照組明顯增加，兩組相比差異有顯著性(P<0.01)。見圖3、表4。

表2 兩組大鼠曠場實驗結(jié)果比較Tab.2 Comparison of the results of open field test between the two groups

注：與對照組比較*P<0.05，ΔP<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,ΔP<0.01.

表3 兩組大鼠AWR實驗結(jié)果比較Tab.3 Comparison of the results of AWR test between the two groups

注：與對照組比較*P<0.05，ΔP<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,ΔP<0.01.

表4 兩組大鼠EMG實驗結(jié)果比較Tab.4 Comparison of the results of EMG test between the two groups

注：與對照組比較ΔP<0.01。

Note. Compared with the control group,ΔP<0.01.

2.5胃排空實驗

禁食18 h后，模型組大鼠3 h的攝食量與對照組比較無明顯差別(P>0.05)，但停止攝食3小時后對已攝取食物的胃排空率組間比較差異有顯著性(P<0.05)，模型組明顯低于對照組。見表5。

圖3 模型組和對照組的代表性EMGFig.3 Representative EMG response in the two groups

組別Groups3h攝食量/gFoodintakein3h停止攝食3h后的胃排空率/%Gastriccontentat3hafterfoodintake對照組Control6.75±0.5171.21±3.35模型組Model6.52±0.3454.95±5.29*

注：與對照組比較*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

3 討論

焦慮等精神心理異常在FD患者中的發(fā)生率高達40%～90%[11]，是FD的常見癥狀，也是其難治的主要原因之一，與胃功能紊亂本身所致癥狀高度重疊，互為因果、相互影響，促進了FD的發(fā)生和發(fā)展[12,25]。但焦慮對FD及GHS的影響機制尚不十分明確，其主要原因除與臨床標本缺乏有關(guān)外，更重要的是迄今為止尚無較為成熟的焦慮樣GHS動物模型。

研究表明，幼年的不良生理或心理體驗及成年的急性應(yīng)激狀態(tài)均參與了FD癥狀的形成[26，27]，而幼年時出現(xiàn)急性輕度胃炎，也可能是成年后慢性胃敏感性增高和胃功能紊亂的誘因之一[16]。母嬰分離作為幼年的不良刺激可造成大鼠成年后出現(xiàn)焦慮樣行為[28,29]，對中樞的5HT、GABA、去甲腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)和胃腸道的5HT、乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)有重要影響[30-34]，同時亦能影響下丘腦-垂體-腎上腺軸的雙向調(diào)節(jié)作用，誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)焦慮樣心理應(yīng)激反應(yīng)[35]。成年大鼠的急性應(yīng)激狀態(tài)除同樣影響下丘腦-垂體-腎上腺軸外，尚可影響血清ghrelin的分泌，后者對胃動力、胃敏感性和胃容受性舒張等具有一定調(diào)節(jié)作用[19,36]。而大鼠幼年時的急性輕度胃黏膜炎癥，可通過內(nèi)臟傳入神經(jīng)，最終影響成年后的胃敏感性、攝食量和胃容受性舒張功能[16]。

然而，盡管已有大量研究分別采用母嬰分離、急性應(yīng)激和新生大鼠胃刺激法制作FD樣GHS模型，但卻鮮有研究關(guān)注上述方法對實驗動物帶來的焦慮等精神心理應(yīng)激反應(yīng)及其與GHS間的相互影響和發(fā)生機制。

本研究顯示，應(yīng)用新型序貫應(yīng)激法制作的焦慮樣GHS模型，大鼠在實驗初期表現(xiàn)出體重增長減緩和胃黏膜輕度炎癥，但體重增長在短期內(nèi)即已恢復(fù)且在第8周時胃黏膜組織學和MPO試驗完全正常，符合FD患者的臨床特點。同時，與對照組相比，模型組大鼠的攝食量未明顯減少、但胃排空率明顯下降。

已有的臨床研究提示，35%～65%的FD患者存在不同程度GHS，且后者與餐后上腹痛密切相關(guān)，也與惡心、早飽、上腹脹等非腹痛性癥狀有關(guān)[4，5,37]。本研究顯示，模型組大鼠胃敏感性明顯增高，對照組變化不大，與前述臨床研究結(jié)果具有一致性，表明本模型成功復(fù)制了FD樣GHS模型。

與此同時，與對照組相比，模型組大鼠在EPM上向開放臂探索的次數(shù)和在開放臂的停留時間均明顯減少，而后腿直立次數(shù)和頭部下探次數(shù)均明顯增高，提示存在焦慮樣行為特征。曠場試驗進一步觀察到模型組大鼠在中央格停留時間縮短、穿行格數(shù)明顯減少，與EPM實驗結(jié)果具有相似性。提示本模型較好地模擬了焦慮樣癥狀，具備了焦慮樣大鼠模型的特點。

綜上所述，本研究探索建立了一種新型焦慮樣GHS大鼠FD模型，其行為學特征符合焦慮和GHS表現(xiàn)，提示模型制作成功。同時本模型也為伴焦慮樣癥狀、以胃敏感性增高為主要病理生理改變的FD患者的發(fā)病機制研究和新藥開發(fā)等提供了一種新的手段。

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Establishmentofananxiety-likegastrichypersensitivityratmodeloffunctionaldyspepsiainducedbyanewmethodofsequentialstress

JING Fu-chun1,2, ZHANG Jun1, FENG Cheng1, NIAN Yuan-yuan1, YANG Bao-de3, HU Hao3, SUN Xiao-ming4, ZHENG Jian-yun5

(1. Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710004, China； 2. Department of Digestive Diseases, Baoji People’s Hospital Affiliated to Yan’an University, Baoji 721000； 3. Department of Pharmacology, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061； 4. Basic Medical Experiment Teaching Center, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061； 5. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Medical University, Xi’an 710004)

ObjectiveTo establish an anxiety-like gastric hypersensitivity (GHS) rat model of functional dyspepsia induced by new sequential stress.MethodsTwenty-six male 1-day-old Sprague-Dawley rat pups were randomly divided into control and model groups (n=13 in each group). The model rats

sequential stress from postnatal day 2: neonatal maternal separation (NMS), acute gastric irritation (AGI) and restraint stress (RS). The control rats were reared freely with their mothers without undergoing the sequential stress. From postnatal 8thweek all rats started to receive elevated plus maze (EPM), open field test (OF), abdominal withdrawal reflex (AWR) and electromyographic test (EMG).ResultsEPM and OF experiments depicted that the model rats showed obvious anxiety-like behavior (P<0.05 orP<0.01). AWR and EMG tests exhibited that the model rats had elevated gastric hypersensitivity to gastric distention (P<0.05 orP<0.01).ConclusionsAn anxiety-like GHS rat model of functional dyspepsia can be successfully established with our new method of sequential stress.

Sequential stress; Anxiety; Gastric hypersensitivity; Functional dyspepsia; Rat model

ZHANG Jun. Email: jun3z@163.com.

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0551-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.015

2016-10-15

景富春(1969-)，男，在讀博士，副主任醫(yī)師。研究方向：功能性消化不良。Email: fleming7798@163.com

張軍(1959-)，女，醫(yī)學博士，教授。研究方向：消化系疾病診治。Email: jun3z@163.com