豚鼠皮膚瘙癢動物模型的建立及評價

米本中，楊武斌，羅曉玲，王旖，胡娟，徐嘉紅，樵星芳

(重慶市中藥研究院實驗動物研究所，重慶 400065)

研究報告

豚鼠皮膚瘙癢動物模型的建立及評價

米本中#，楊武斌#，羅曉玲，王旖，胡娟，徐嘉紅，樵星芳*

(重慶市中藥研究院實驗動物研究所，重慶 400065)

目的通過星點設(shè)計-效應(yīng)平面法優(yōu)化組胺和4-氨基吡啶(4-AP)聯(lián)用建模的劑量，旨在建立一種新型的豚鼠瘙癢動物模型。方法用星點設(shè)計安排實驗，各組分別在脫毛部位皮下注射0.5 mL不同致癢劑，記錄豚鼠30 min內(nèi)的搔抓潛伏期和搔抓次數(shù)，用綜合評分法篩選最佳致癢組方。通過觀察豚鼠的行為學(xué)變化和測定血液中的組胺和白介素-6(interleukin- 6，IL-6)的含量對豚鼠模型進行評價。結(jié)果行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)比組胺組和4-AP組均顯著增多(P<0.01)，搔抓潛伏期顯著縮短(P<0.01)。4-AP組在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)比組胺組顯著增多(P<0.01)。與對照組相比，聯(lián)合組、組胺組豚鼠血清的組胺濃度均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，但聯(lián)合組升高程度低于組胺組(P<0.05)；與對照組相比，組胺組、4-AP組和聯(lián)合組的血清IL-6濃度均有顯著的升高 (P<0.01或P<0.05)，且聯(lián)合組明顯高于組胺組和4-AP組。病理學(xué)檢查顯示，各模型組均出現(xiàn)不同程度的炎細胞增殖，其中聯(lián)合組的反應(yīng)更為明顯。結(jié)論本試驗中優(yōu)化組方(聯(lián)合組)模型容易實現(xiàn)并且有良好的重復(fù)性。

組胺；4-氨基吡啶；豚鼠；瘙癢模型

瘙癢是皮膚科最常見的癥狀之一，見于多種皮膚病、膽道疾病、甲狀腺疾病、腎臟疾病以及惡性腫瘤等多種臨床疾病。目前瘙癢的病理生理學(xué)機制尚不完全清楚，臨床治療過程中也缺少理想的止癢藥物[1，2]。在瘙癢藥物篩選和基礎(chǔ)研究的過程中，適當?shù)酿W動物模型是評估藥效的必要條件。目前瘙癢動物模型多以單一致癢因素建立，如組胺法、4-氨基吡啶法、5-羥色胺法、右旋糖酐法等[3-5]。現(xiàn)有的瘙癢動物模型的方法雖多，但多為單一致癢因素，與臨床實際發(fā)生瘙癢的多因素性與復(fù)雜性區(qū)別較大，且批間重復(fù)性差，使得藥物篩選與基礎(chǔ)研究的準確性存在較大的問題。因此建立重復(fù)性良好的瘙癢模型成為當前外用止癢藥物評估過程中的一大亟待解決的問題。本文擬嘗試通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化組胺和4-氨基吡啶(4-AP)兩種致癢物質(zhì)劑量，通過觀察模型搔抓行為學(xué)、局部組織變化，ELISA方法檢測血清瘙癢相關(guān)細胞因子，與傳統(tǒng)的單因素致瘙癢模型進行比較，旨在建立一種新型同一性較高的豚鼠瘙癢模型，以滿足研究瘙癢發(fā)生機制和開發(fā)止癢藥物的需要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗動物

4周齡普通級豚鼠112只，體重200～250 g，雌雄各半，由重慶市中藥研究院實驗動物研究所提供【SCXK(渝)2012-0006】。實驗動物將飼養(yǎng)在普通級環(huán)境中，飼養(yǎng)設(shè)施符合普通級實驗動物的飼養(yǎng)要求。飼養(yǎng)期間給予豚鼠標準濕顆粒飼料，每天喂一次干草或青飼料。溫度：20～26℃。濕度：50%～70%。實驗豚鼠飼養(yǎng)及組織取材均于重慶市中藥研究院實驗動物研究所實驗設(shè)備內(nèi)進行【SYXK(渝)2012-0003】。本實驗所有操作均符合中華人民共和國《實驗動物管理條例》。實驗方案已通過倫理審查，重慶市中藥研究院實驗動物福利倫理審查【渝中藥院(2014)71號】。

1.1.2 主要試劑

組胺(histamine)，分子式：C5H9N3，分子量：111.15 g/mol，含量≥97%，產(chǎn)品編號101646111，購自美國Sigma公司；4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)，分子式：C5H6N2，分子量：94.11 g/mol，含量≥99%，產(chǎn)品編號1002408342，購自美國Sigma公司；豚鼠組胺和IL-6檢測試劑盒，購自上海篤瑪生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1 豚鼠瘙癢模型的制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，全部豚鼠頸背部脫毛，暴露約2 cm × 2 cm 皮膚，按體重隨機分組。分別在豚鼠的脫毛部位皮下注射致癢劑，給藥體積每只0.5 mL。以豚鼠嘴或后肢搔抓注射部位至停止記作1次搔抓(連續(xù)搔抓記作1次)。

1.2.2 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化致癢劑的劑量

(1)設(shè)計試驗

在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以致癢劑組胺(X1)、4-AP(X2)的百分濃度為考察因素。根據(jù)星點設(shè)計原理，每因素設(shè)五水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，因素水平見表1。以30 min內(nèi)的搔抓潛伏期(注射結(jié)束至第1次搔抓開始的時間)和搔抓次數(shù)作評價指標，試驗安排見表2，每組豚鼠8只。

按公式(a-b)×X=(c-b)×10進行計算(a：最優(yōu)值；b：最劣值；c：待求組值；X：待求組得分)[6]，將所有指標綜合為一個能反映總體效應(yīng)結(jié)果的值，對于搔抓潛伏期，9號試驗時間最短，排第一，給10分；7號試驗時間最長，排最后，給1分。對于搔抓次數(shù)，9～13號試驗次數(shù)最多，排第一，給10分；7號試驗次數(shù)最少，排最后，給1分；其他號試驗各指標值則由公式(a-b)×X=(c-b)×10進行計算。最后對每號試驗的所有指標分數(shù)相加得綜合評分A值。

表1 星點設(shè)計因素與水平Tab.1 Variables and levels of the central composite design

表2 星點試驗設(shè)計Tab.2 Experimental designs by central composite design-response surface methodology (CCD-RSM)

注：No．9～13為重復(fù)試驗。

Note. No. 9～13： repeated experiment.

(2)模型擬合與效應(yīng)面優(yōu)化

以總評A值為因變量，使用Design-Expert 8.0.6.1對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，并進行方差分析。根據(jù)回歸方程以及擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析磷酸組胺和4-AP濃度(w/v)對豚鼠瘙癢模型中搔抓潛伏期及和搔抓次數(shù)的影響，并對最佳造模條件進行預(yù)測。

(3)最優(yōu)條件的驗證

根據(jù)確定的致癢劑最優(yōu)造模劑量，分別建立8只動物模型，進行驗證實驗，并將測定的平均結(jié)果與擬合方程的預(yù)測值進行比較，并計算其相對偏差。驗證本實驗得到的擬合方程是否具有較好的描述因素。

1.2.3 最佳組方模型的評價

將豚鼠隨機分為對照組(生理鹽水)、最佳聯(lián)合組(0.03%組胺 + 0.07% 4-AP)、組胺組(0.03%組胺)和4-AP組(0.07% 4-AP)，每組各10只，給藥體積見“1.2.1”。

記錄各組豚鼠30 min內(nèi)的搔抓潛伏期和搔抓次數(shù)，行為學(xué)變化記錄結(jié)束后立即心臟采血約每只5 mL，靜置至血液分層后離心分離血清。按ELISA試劑盒要求操作檢測豚鼠血清中組胺、白介素-6(IL-6)的含量。采血完成后，取各組試驗動物注射部位周圍皮膚切成小塊置于甲醛溶液。將所取注射部皮膚小塊進行病理切片并做HE染色，觀察皮膚組織有無急性炎癥反應(yīng)，毛細血管通透性是否增加、水腫以及炎性成分的滲出。

2 結(jié)果

2.1星點設(shè)計試驗結(jié)果

根據(jù)“1.2.2”項下的表2進行試驗，試驗結(jié)果見表3。以總評A值為因變量，使用Design-Expert對各因素進行多元線性回歸和二項式擬合，擬合模型如下：多元線性回歸方程

Y=18.32470 - 122.53134X1+ 51.45559X2；

二項式擬合方程Y=11.22890 + 225.89505X1+ 130.98160X2-148.39520X1X2-3459.50086X12-902.25555X22。

多元線性回歸擬合方程方差分析發(fā)現(xiàn)擬合方程概率P>0.05，表明建立的模型不具顯著性，r=0.4337較低，表示自變量與因變量之間的線性相關(guān)性較差，擬合度和預(yù)測性不佳，因此該數(shù)學(xué)模型不適合。對二項式擬合方程進行方差分析可知(見表4)，因素X1，X2中一次項和二次項均具有顯著性差異，說明各具體試驗因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，模型組具有高度的顯著性(r=0.9048)，說明方程擬合度和可信度均良好，可用此模型對豚鼠的造模工藝進行分析和預(yù)測。

表3 星點試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.3 Experimental designs by CCD-RSM and scoring results

注：每組豚鼠8只，潛伏期和搔抓次數(shù)求平均值。

Note.n=8 in each group. The values are averages of latency and scratching frequency.

表4 二項式擬合方程的方差分析Tab.4 Results of variance analysis of quadratic model

2.2效應(yīng)面優(yōu)化及預(yù)測驗證

根據(jù)回歸方程，作響應(yīng)曲面圖(圖1)，根據(jù)所擬合的響應(yīng)曲面形狀和已建立的數(shù)學(xué)模型，分析得到致癢劑最佳劑量為：組胺0.03%，4-AP 0.07%。按最佳條件對6只豚鼠進行造模驗證，結(jié)果潛伏期平均值為23 s，搔抓次數(shù)平均值35次，總評A值18.646，預(yù)測值19.329，偏差率-3.66%，說明本實驗得到的擬合方程具有較好的描述因素，數(shù)學(xué)模型可靠，具有良好的預(yù)測性。

圖1 因素A和B 對A值的三維效應(yīng)面及等高線的影響Fig.1 Effects of factors A and B on 3-D-response surface and contour map of OD values

2.3行為學(xué)實驗結(jié)果

實驗結(jié)果用SPSS 19.0軟件進行分析，結(jié)果如表5。與組胺組和4-AP組相比，聯(lián)合組在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)顯著增多(P<0.01)，搔抓潛伏期顯著縮短(P<0.01)。4-AP組在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)比組胺組顯著增多(P<0.01)。

表5 不同建立方法對豚鼠瘙癢模型搔抓行為學(xué)的影響Tab.5 Effect of different modeling methods on the quinea pig itching models

注：與組胺組和4-AP組比較，**P<0.01；與4-AP組比較，#P<0.01。

Note. Compared with the histamine group and 4-AP group：**P<0.01；Compared with the 4-AP group：#P<0.01.

2.4血清指標檢測

血清檢測結(jié)果用SPSS 19.0軟件分析發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，聯(lián)合組、組胺組豚鼠血清的組胺濃度均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，但聯(lián)合組升高程度低于組胺組(P<0.05)，見圖2；與對照組相比，組胺組、4-AP組和聯(lián)合組的血清IL-6濃度均有顯著的升高(P<0.01或P<0.05)，且聯(lián)合組明顯高于組胺組和4-AP組，見圖3。

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。圖2 組胺豚鼠瘙癢模型血液中組胺的濃度Note. Compared with the control group：**P<0.01，*P<0.05.Fig.2 Concentration of histamine in the blood of itching model guinea pigs

注：與對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。圖3 各組豚鼠瘙癢模型血液中白介素-6的濃度Note. Compared with the control group：**P<0.01，*P<0.01.Fig.3 Concentration of IL-6 in the blood of itching model guinea pigs

2.5病理學(xué)檢查

HE染色鏡下觀察結(jié)果病理檢查顯示，與對照組相比，聯(lián)合組出現(xiàn)輕度急性炎癥反應(yīng)，真皮中有少量炎細胞，出現(xiàn)輕度毛細血管擴張、水腫和炎性滲出；組胺組和4-AP組出現(xiàn)輕微急性炎癥反應(yīng)，真皮中偶見炎細胞，輕度毛細血管擴張。綜合分析認為聯(lián)合組致瘙癢模型出現(xiàn)了較明顯的急性炎癥反應(yīng)，見圖4。

3 討論

瘙癢模型的建立方法主要有直接使用特定種系動物法、炎癥介質(zhì)刺激法和化學(xué)物質(zhì)刺激法等，其中較為常用的主要是炎癥介質(zhì)刺激法和化學(xué)物質(zhì)刺激法，如組胺致刮傷豚鼠瘙癢模型、組胺致小鼠瘙癢模型、4-AP致小鼠瘙癢模型等[7]。組胺是較早發(fā)現(xiàn)的瘙癢介導(dǎo)物質(zhì)之一，只存在于肥大細胞和嗜堿性粒細胞內(nèi)，隨著這兩種細胞的激活，它被釋放到細胞外發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，是肥大細胞和嗜堿性粒細胞脫顆粒的標志。在許多過敏性疾病的動物模型建立中組胺被廣泛應(yīng)用[8-10]。由于豚鼠具有自身易致敏的特性被廣泛用于皮膚過敏動物模型的建立，其對組胺的敏感性，成為組胺致疹癢模型的首選動物。4-AP是一種鉀通道阻滯劑，其作用機制是加入鉀通道阻斷劑后，促進血管平滑肌細胞去極化，從而激活電壓依賴性鈣通道開放，導(dǎo)致準跨膜內(nèi)流增加，引起血管收縮。同時它也具有促肥大細胞釋放組胺的作用[11]。目前豚鼠皮膚瘙癢動物模型中最常用的的是表皮擦傷，滴加磷酸組織胺及5-羥基色胺建模的方法，本實驗通過對刮傷瘙癢模型進行改進，采用組胺和4-AP聯(lián)合進行皮下注射造模，建立有多種介導(dǎo)因子共同參與瘙癢模型。

星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法是一種多因素五水平的實驗設(shè)計，常用來進行非線性擬合的優(yōu)化。通常在最佳條件附近，指標與影響因素之間的關(guān)系為非線性，此時不宜用線性方程進行擬合，應(yīng)選用二次多項式或更高次的多項式進行擬合，可以提高優(yōu)化效果，其具有精密度高、預(yù)測性好、簡便等優(yōu)點，逐漸替代了均勻設(shè)計和正交設(shè)計在處方優(yōu)化中的應(yīng)用[12]。本文采用星點設(shè)計法綜合考慮組胺、4-AP兩因素間的交互作用，并通過效應(yīng)面法分析得出致癢劑的最佳劑量為0.03%組胺、0.07% 4-AP。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用組胺和4-AP建立瘙癢模型與對照以及單一因素致瘙癢模型相比，實驗豚鼠在30 min內(nèi)搔抓次數(shù)增多，搔抓潛伏期縮短；血清檢測的結(jié)果顯示聯(lián)合致癌癢模型組的血清組胺、白介素-6的濃度與對照組相比均有顯著變化，表明該模型是一種較好的瘙癢動物模型，有望在外用止癢藥物的篩選中推廣應(yīng)用。

[1] 馮雨苗, 王洪生, 王淼淼, 等. 瘙癢神經(jīng)生理機制的研究進展[J]. 國際皮膚性病學(xué)雜志, 2009, 35(2): 124-126.

[2] 丁媛, 普雄明. 瘙癢的發(fā)生機制, 相關(guān)疾病和治療[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2006, 22(6): 492-495.

[3] Thomsen JS, Petersen MB, Benfeldt E, et al. Scratch induction in the rat by intradermal serotonin: a model for pruritus [J]. Acta Derm-Venereol, 2001, 81(4): 250-254.

[4] 王彥禮, 包旭宏, 王怡薇, 等. 青鵬膏劑對豚鼠瘙癢及濕疹模型的影響 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2011, 17(14): 233-236.

[5] 王暉, 沈非沉, 陳墾, 等. 組胺和 4-氨基吡啶聯(lián)用建立瘙癢模型 [J]. 中國病理生理雜志, 2009, 25(7): 1454-1456.

[6] 陳月葵, 王暉, 梁慶, 等. 復(fù)合物質(zhì)致小鼠瘙癢模型的建立 [J]. 中國藥理學(xué)通報, 2009, 25(1): 133-135.

[7] 吳娜, 方厚華. 實驗動物瘙癢的評價 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 13(2): 115-116.

[8] 彭華, 李添應(yīng). 組胺 H4 受體在變態(tài)反應(yīng)性炎癥中的作用 [J]. 中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志, 2008, 2(3): 208-211.

[9] Minami K, Kamei C. A chronic model for evaluating the itching associated with allergic conjunctivitis in rats [J]. Int Immunopharmacol, 2004, 4(1): 101-108.

[10] Rosa AC, Fantozzi R. The role of histamine in neurogenic inflammation [J]. B J Pharmacol, 2013, 170(1): 38-45.

[11] 王凱, 向翠英, 張瓊. 4-氨基吡啶致小鼠舔體反應(yīng)與瘙癢關(guān)系的初步探討 [J]. 中國新藥雜志, 2011, 20(2): 170-172.

[12] 吳琳, 彭欣, 孫芳, 等. 星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法與中藥學(xué)實驗研究 [J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2014, 38(6): 582-585.

Establishmentandevaluationofaguineapigmodelofitching

MI Ben-zhong#, YANG Wu-bin#, LUO Xiao-ling, WANG Yi, HU Juan, XU Jia-hong, QIAO Xing-fang*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Experimental Animal Institute, Chongqing 400065, China)

ObjectiveTo optimize the optimal doses of histamine and 4-aminopyridine (4-AP) in the establishment of guinea pigs models of itching, and to establish a new guinea pig model of itching.MethodsThe central composite design-response surface method was used to arrange the experiment. In the experiment different pruritus agents were hypodermically injection of 0.5 mL in the depilated area, and the scratching incubation period and scratching number in 30 minutes were counted after the injection. The guinea pig itching model was evaluated by observing the behavioral changes of guinea pigs and measuring the levels of histamine and interleukin-6 in the blood.ResultsThe behavioral experiments found that the scratching frequency in the the combination group was significantly higher than the histamine group and 4-AP group (P<0.01). The itching latency of the combination group was significantly shorter than that of the histamine group and 4-AP group (P<0.01). Compared with the control group, the histamine concentrations of the combination group and histamine group were significantly increased (P<0.05 orP<0.01), and the level of the combination group was lower than that of the histamine group (P<0.05). Compared with the control group, the serum IL-6 concentrations of histamine group, 4-AP group and combination group were significantly higher (P<0.01 orP<0.05), and those in the combination group were significantly higher than the histamine and 4-AP groups. Compared with the control group, pathologic examination showed proliferation of inflammatory cells in all model groups, and the reaction of the combination group was more obvious.ConclusionsThe optimal conditions used in this experiment are easy to achieve and have good reproducibility in the establishment of a guinea pig model of itching.

Histamine; 4-aminopyridine; Guinea pig; Itching model

QIAO Xing-fang. E-mail： Email： 745647159@qq.com

2017-05-04

重慶市科技項目(No.2015cstc-jbky-01907，cstc2015shmszx10010)。

米本中(1987-)，男，助理研究員，專業(yè)：動物醫(yī)學(xué)。Email： 858885377@qq.com;楊武斌(1986-)，男，碩士，研究方向：中藥藥理學(xué)。Email： yangwubinhome@163.com。#共同第一作者

樵星芳(1980-)，女，副研究員，研究方向：實驗動物學(xué)。Email： 745647159@qq.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0528-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.011

2017-03-28