小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)體系的建立與應用

萬光升，張新艷

(1. 復旦大學附屬婦產科醫(yī)院研究所，上海 200011； 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，上海 200062)

研究報告

小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)體系的建立與應用

萬光升2，張新艷1*

(1. 復旦大學附屬婦產科醫(yī)院研究所，上海 200011； 2. 上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院，上海 200062)

目的建立一種研究腸上皮細胞的體外模型—小腸類器官培養(yǎng)體系，探索其相關病理檢測技術方法，為腸道相關疾病的體外研究提供便利平臺。方法將小鼠腸上皮隱窩分離并培養(yǎng)成小腸類器官，體外模擬腸上皮的生長發(fā)育過程。通過制作石蠟切片，探索應用免疫組化技術以及基于基質膠中類器官三維水平免疫熒光技術對相應的增殖與分化信號進行檢測。結果探索并建立了小腸類器官體外培養(yǎng)體系，應用石蠟切片免疫組化技術與三維水平免疫熒光技術能夠準確檢測小腸上皮結構的生長發(fā)育狀態(tài)。結論小腸類器官體外培養(yǎng)體系的建立與免疫檢測技術的應用，將逐漸使其成為人們研究腸道相關疾病最為有利的技術手段。

小腸類器官；石蠟切片；免疫組化；免疫熒光；小鼠

腸上皮形成了一種天然屏障，將腸的腔體與免疫系統分隔開來[1]。上皮層向固有層內陷形成無數隱窩，隱窩中存在著干細胞群維持著上皮細胞的更新[2,3]。干細胞能夠增殖分化為行使不同功能的小腸終末分化細胞：腸吸收細胞、杯狀細胞、內分泌細胞以及潘氏細胞等[4]，這些細胞不僅是維持小腸穩(wěn)態(tài)和小腸上皮的損傷修復所必需的，而且對于腸炎的發(fā)病機理也十分重要[5]。鑒于體內研究腸道疾病的空間局限性，2009年Hans Clever實驗室建立了一種新型的腸上皮細胞培養(yǎng)方法—小腸類器官培養(yǎng)[6]，體外模擬腸上皮的增殖分化過程。這一方法的建立既實現了腸上皮長期體外培養(yǎng)又可以維持腸上皮細胞原始分化能力，該技術已經逐漸被應用于干細胞、疾病模型以及再生藥物等相關研究[7]。然而，國內極少數實驗室能夠熟練掌握小腸類器官體外培養(yǎng)技術，其應用及推廣更是止步不前。本研究旨在建立穩(wěn)定的小鼠小腸類器官培養(yǎng)體系的基礎上，探索小腸類器官切片的制作及免疫染色檢測方法，為腸道相關疾病的基礎研究提供便利的體外研究平臺。

1 材料與方法

1.1實驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6的小鼠6只，體重約25 g左右，雌雄不限，由華東師范大學SPF級實驗動物中心提供【SCXK(滬)2016-0004】，并飼養(yǎng)于華東師范大學SPF級實驗動物中心【SYXK(滬)2015-0011】，動物實驗符合華東師范大學動物倫理委員會的規(guī)定并被授權(審批號：AR2013/12011)。

1.2實驗試劑

1.2.1 小腸類器官的分離與培養(yǎng)

加有青霉素和鏈霉素雙抗P/S的磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma公司)、小腸隱窩消化液：5 mM乙二胺四乙酸(EDTA，Gibco公司)、基質膠(Matrigel，BD 公司)、類器官培養(yǎng)基：1× N2 Supplement(Life-Invitrogen-Gibco)、1% glutamax(Life-Invitrogen-Gibco)、1 μmol/LN-acetylcysteine(Sigma)、1× B27 serum-free supplement(Life-Invitrogen-Gibco)、0.1% penicillin/streptomycin(Roche)、0.1 μg/μL EGF(Life-Invitrogen-GIBCO)、1 μg/μL Human R-spondin 1(PeproTech)、0.1 μg/μL Murine Noggin(PeproTech)、基礎培養(yǎng)基為DMEM/F12(Life-Invitrogen-GIBCO)。

1.2.2 小腸類器官石蠟切片的制作及阿幸蘭、免疫組織化學染色

4%多聚甲醛(PFA，上海潤捷化學有限公司)、各濃度梯度乙醇(上海凌峰化學試劑有限公司)、二甲苯(上海潤捷化學有限公司)、液體蠟(上海潤捷化學有限公司)、雙氧水(H2O2，上海潤捷化學有限公司)、蘇木精染液(Selleck中國)、阿幸蘭-核快紅染液(鼎國生物)、磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma公司)、PBST(PBS 加0.2% Triton X-100，上海生工生物有限公司)、檸檬酸抗原修復液(上海生工生物有限公司)、抗體稀釋液(北京諾博萊德科技有限公司)、中性樹脂膠(鼎國生物)、免疫組化試劑盒(包含封閉液、二抗、顯色液、信號放大素HRP，Vector Labs)、增殖標記蛋白Brdu抗體(1∶500，Sigma公司)、增殖標記蛋白Ki67抗體(1∶3000，NeoMarker公司)、杯狀細胞標記蛋白Muc2抗體(1∶50，Immunostar公司)、潘氏細胞特異標記蛋白Lysozyme抗體(1∶1500，Dako公司)。

1.2.3 小腸類器官三維水平免疫熒光技術

磷酸鹽緩沖液(PBS，Sigma公司)、4%多聚甲醛(PFA，上海潤捷化學有限公司)、PBST(PBS 加0.2% Triton X-100，上海生工生物有限公司)、封閉液(Vector Labs)、一抗(Ki67、Muc2、Lysozyme抗體同上)、熒光二抗(Cell Signal Technology公司)、DAPI(Roche公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 小腸類器官的分離與培養(yǎng)

將6～8周齡的小鼠安樂死，在75%乙醇中浸泡30 min，轉移至超凈工作臺中，取其十二指腸、空腸、回腸各約5 cm，縱向剖開后用預冷的加有雙抗P/S的PBS清洗數次。將洗凈的小腸剪成5 mm左右的片段，轉移至50 mL離心管，冰浴靜置至腸片段沉底，小心棄掉上清，加入30 mL 5 mmol/L預冷的EDTA，冰上靜置消化30 min，消化期間每隔5 min上下顛倒離心管數次，便于消化徹底。將上清換成預冷的PBS，用移液槍輕柔吹打沉淀混合液，并及時鏡檢，棄去含有大量絨毛片段的上清，直至視野中出現大量小腸隱窩開始收集上清。將帶有小腸隱窩的上清用100 μmol/L細胞過濾器過濾到15 mL離心管，用70 μmol/L細胞過濾器再次過濾，4℃ 1200 r/min離心5 min后收集沉淀。用預冷的DMEM/F12基礎培養(yǎng)基重懸沉淀，再用600 r/min離心收集，反復3～4次直至洗凈多余的絨毛碎片；如果單細胞過多，可200 r/min離心2 min收集上清以去除單細胞。計數，以每微升基質膠(Matrigel)約10個隱窩的密度計算重懸隱窩的體積，用基質膠重懸隱窩，混合均勻后接種到預熱的培養(yǎng)孔中央。將接種好的培養(yǎng)皿放置37℃培養(yǎng)箱中靜置10 min，待基質膠凝固后添加預先配制好的類器官培養(yǎng)基。

1.3.2 小腸類器官石蠟切片的制作

將小腸類器官培養(yǎng)數天后，連同基質膠和培養(yǎng)基一起轉移到1.5 mL離心管內，在4℃ 離心機中1600 r/min 離心3 min收集沉淀。用4%多聚甲醛(PFA)在4℃冰箱中固定樣品6 h，將樣品按乙醇濃度逐漸升高的順序(50%、75%、85%、95%、100%、1∶1 乙醇/二甲苯、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ)在室溫下逐級脫水，每一濃度乙醇或二甲苯浸潤組織20 min，最后65℃浸蠟過夜。石蠟包埋后，將樣品切成約0.5 μm厚度的切片，烘片機上60℃烘烤2 h，收片常溫保存。

1.3.3 阿幸蘭(Alcian blue)染色

將小腸類器官石蠟切片置于二甲苯-乙醇-水梯度濃度中進行脫蠟：二甲苯Ⅰ(10 min)、二甲苯Ⅱ(10 min)、乙醇與二甲苯1∶1(10 min)、100%乙醇(5 min)、95%乙醇(3 min)、85%乙醇(3 min)、75%乙醇(3 min)、50%乙醇(3 min)。將蒸餾水浸潤過的組織切片放入阿幸蘭染液中染色20 min，自來水沖洗玻片數次，洗去多余的阿幸蘭染液。將切片置于核快紅染液中染色5 min，自來水沖去多余的染液，在蒸餾水中浸潤5 min。組織切片經乙醇-二甲苯梯度脫水(與脫蠟步驟相反)，最后中性樹脂封片。

1.3.4 免疫組織化學染色

將小腸類器官石蠟切片置于二甲苯-乙醇-水梯度濃度中進行脫蠟(步驟同上)，將200 mL抗原修復液倒入修復盒中，將玻片置于盒中，蓋緊蓋子放入100℃水浴箱中進行抗原修復20 min后，組織切片置于修復液中自然冷卻。 將切片置于1%～3%的H2O2中避光反應10 min，用蒸餾水潤洗2～3次，用PBS潤洗3 min，用PBST潤洗2次(5 分/次)。滴加封閉液覆蓋組織，在濕盒內靜置反應10 min， 后用50 μL一抗覆蓋組織在濕盒內平放至4℃冰箱中進行一抗孵育10 h。PBST清洗玻片3次(5 分/次)；滴加二抗，室溫反應10 min，去掉二抗，用PBST清洗3次(5 分/次)；滴加信號放大素(HRP)覆蓋組織，在避光條件下反應10 min，用PBST清洗3次(5 分/次)，加入顯色液(每個玻片約50 μL)覆蓋組織，顯色時間視抗體靈敏度而定，用自來水清洗玻片3次。蘇木精染色5 min，自來水清洗玻片3次，置于鹽酸乙醇中去色5 s，蒸餾水清洗2次，在自來水中浸泡返藍20 min，脫水封片。

1.3.5 三維水平免疫熒光技術

小腸類器官培養(yǎng)數天后棄去培養(yǎng)基，用常溫的PBS在培養(yǎng)皿中潤洗3～4次。用4%多聚甲醛(PFA)將樣品在室溫下固定30 min，PBS潤洗3次(5 分/次)，PBST常溫處理2 h，棄去PBST，加入封閉液封閉樣品30 min。吸掉封閉液，加入一抗室溫反應2 h。PBST洗3次(10 分/次)，室溫條件下加入熒光二抗反應2 h。用PBST洗凈二抗，DAPI染細胞核5 min，洗凈DAPI后，在PBS浸潤條件下，用倒置顯微鏡采集圖片。

2 結果

2.1小腸類器官體外培養(yǎng)體系的建立

這種分離出的小腸隱窩在EGF、R-spondin 1、Noggin等基本生長因子存在的條件下可以持續(xù)生長。在接種后的24 h內，成活的隱窩首先變?yōu)槟覡畹膱A球體(圖1A)。圓球體逐漸增大，內部漸呈現類似腸腔的中空結構，充斥著各種細胞(圖1B黑色箭頭所示)。培養(yǎng)1.5 d左右，在圓球體外側會有芽狀的上皮結構突起，在突起的頂端可以觀察到小腸終末分化細胞如潘氏細胞(圖1C，黑色箭頭指向潘氏細胞)。隨著培養(yǎng)時間的增加，出芽數逐漸增多(圖1D)。最后，一個成熟的芽可以逐漸從母體上脫落下來(圖1E黑色箭頭所示)，形成一個新的類器官單位(圖1F黑色箭頭所示)。

2.2免疫染色技術在小腸類器官研究中的應用

將生長數天的小腸類器官制作成石蠟切片后，通過免疫組化技術可以清晰地檢測到小腸類器官的增殖標記物Brdu和Ki67(圖2A-B)，說明代表著腸上皮結構的小腸類器官具有強烈的增殖能力，這種增殖能力在出芽的頂端尤其明顯(圖2B黑色箭頭所示)。通過阿辛蘭-核快紅染色技術(Alcian blue)可以檢測到腸上皮杯狀細胞所在位置(圖2C黑色箭頭所示)。而通過免疫組化技術，溶菌酶(lysozyme)抗體標記了腸上皮另一種終末分化細胞，也是具有重要功能的潘氏細胞的存在(圖2D黑色箭頭所示)。增殖與分化細胞的檢測說明體外培養(yǎng)的小腸類器官確實可以模擬腸上皮細胞的生長狀態(tài)。

2.3免疫熒光技術在小腸類器官研究中的應用

基于小腸類器官在基質膠中的三維水平的生長，探索了應用于三維水平的免疫熒光技術。研究發(fā)現在類器官出芽的同時，各種終末分化細胞如杯狀細胞(Muc2)、潘氏細胞(Paneth cell)也開始形成(圖3A～B中紅色熒光信號所示)，并且在芽的頂端可以檢測到強烈的增殖信號(Ki67)(圖3C中紅色熒光信號所示)。這種3D水平的信號檢測能夠在保持樣品立體結構的基礎上，比較便捷且全面地呈現出類器官的增殖分化等情況，利于掌握小腸類器官連續(xù)生長的動態(tài)過程。

注：A.培養(yǎng)24 h的小腸類器官；B.黑色箭頭指向小腸類器官內容物；C.黑色箭頭指向潘氏細胞；D.小腸類器官出芽數增多；E.黑色箭頭指向即將從母體上脫落的芽；F.黑色箭頭指向脫落的芽形成一個新的類器官。圖1 小腸類器官形成過程Note. A. A small intestinal organoid cultured for 24 hours; B. Black arrow points to the contents of the small intestinal organoid; C. Black arrow points to a Paneth cell; D. A small intestinal organoid has more buds; E. Black arrow points to the bud falling off form the matrix; F. Black arrow points to a new organoid fallen off from the matrix.Fig.1 The formation process of small intestinal organoid

注：A.黑色箭頭指向BrdU標記的增殖細胞；B.黑色箭頭指向Ki67標記的增殖細胞；C.黑色箭頭指向阿辛蘭染液標記的杯狀細胞；D. 黑色箭頭指向Lysozyme標記的潘氏細胞。圖2 免疫染色技術檢測小腸類器官的增殖與分化Note. A. Black arrow points to a BrdU-labeled proliferating cell; B. Black arrow points to a Ki67-labeled proliferating cell; C. Black arrow points to an Alcian blue-labeled goblet cell; D. Black arrow points to lysozyme-labeled Paneth cells.Fig.2 Detection of the proliferation and differentiation of small intestinal organoids by immunohistochemical staining

注：A.紅色熒光信號表示Muc2標記的杯狀細胞；B. 紅色熒光信號表示Lysozyme標記的潘氏細胞；C. 紅色熒光信號表示Ki67標記的增殖細胞。圖3 免疫熒光技術檢測三維水平的小腸類器官的增殖與分化Note. A. Red fluorescent signal represents Muc2-labeled goblet cells; B. Red fluorescent signal represents lysozyme-labeled Paneth cells; C. Red fluorescent signal represents Ki67-labeled proliferating cells.Fig.3 Detection of the proliferation and differentiation of three-dimensional small intestinal organoids by immunofluorescence-staining

3 討論

腸上皮在維持腸穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著十分重要的作用—包括形成小腸微環(huán)境、識別有益或者有害細菌、分泌影響微生物的復合物以及調節(jié)免疫反應等[8]。腸上皮通過快速的自我更新來維持自身的穩(wěn)態(tài)，而這種快速增殖的自我更新能力來源于位于隱窩基底部的腸干細胞[9]。2007年，Barker等[10]運用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa26RlacZ工具鼠，通過世系追蹤(lineage tracing)的方法證明了Lgr5是腸干細胞標志物。小腸類器官體外培養(yǎng)體系為研究小腸干細胞提供了更為直接的證據。2009年，Hans Clever團隊用小腸類器官體外培養(yǎng)方法證明了小腸單個Lgr5干細胞能夠在體外增殖并分化出腸上皮各種功能細胞[6]。這種體外培養(yǎng)的小腸類器官不僅能夠進行移植，修復DSS誘導造成的腸上皮的損傷[11]，甚至實現了用CRISPR-Cas9技術對人類腸類器官進行基因編輯，模擬結腸癌模型[12]。科學家們已經著手于將該技術應用于臨床疾病治療，這種類器官培養(yǎng)體系能夠對治療腸道相關疾病的藥物進行篩選，或應用于一些細胞因子對腸道損傷修復的作用研究[13]，應用前景廣泛。

然而，如此便利的體外研究腸道的技術平臺在國內并沒有得到很好的掌握與推廣。雖然Hans Clever實驗室公開發(fā)表了小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)的方法步驟[14]，但是我們在實際模擬操作中還是會因為細節(jié)處理不當導致培養(yǎng)體系的失敗。在不斷地探索與改進中，我們優(yōu)化了實驗步驟，建立了穩(wěn)定的小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)體系，較好地模擬了腸上皮的增殖分化過程，該結構不但具有“腸腔”，還具有小腸的各種功能細胞。其較為單一的微環(huán)境為體外研究腸上皮的功能提供了一個便利的平臺。小腸類器官相關病理檢測技術方法目前在國內外并沒有詳細的報道，本研究中這一檢測方法的建立能夠清晰呈現出類器官結構增殖分化動態(tài)，進一步推動了小腸類器官體外培養(yǎng)體系的應用，將促進該技術成為人們探索腸的生長發(fā)育及腸炎腸癌最為有力的研究模型。

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Establishmentandapplicationofaninvitromouseintestinalorganoidculturesystem

WAN Guang-sheng2, ZHANG Xin-yan1*

(1. Hospital and Institute of Obstetrics and Gynecology Affiliated to Fudan University,Shanghai 200011, China； 2. Putuo Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200062)

ObjectiveTo establish a small intestinal organoid culture system as aninvitrostudy model of intestinal epithelial cells, and to explore the relevant pathological detection techniques and provide a convenient platform forinvitrostudy of various intestinal diseases.MethodsThe mouse intestinal epithelium was isolated and cultured into organoids to simulate the growth and development of intestinal epitheliuminvitro. The proliferation and differentiation signals were detected by immunohistochemistry and three-dimensional immunofluorescence technique.ResultsThe culture system of the mouse small intestine epithelium was established. Immunohistochemical staining and three-dimensional immunofluorescence technique were successfully used to detect the growth and development of small intestinal organoids.ConclusionsThe successfully established mouse small intestinal organoid culture system and application of immunoassay technology will gradually become a most favorable technical means for studies of various intestinal diseases.

Small intestinal organoids; Pathology; Immunohistochemistry; Immunofluorescence; Mouse

ZHANG Xin-yan. E-mail： 1989117xyz@sina.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0513-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.008

2017-04-19

國家自然科學基金項目 (No.31371455 2014-2017)。

萬光升(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合治療消化道腫瘤。E-mail： great_sunny@163.com

張新艷(1989-)，女，碩士，初級技師，研究方向：腸干細胞。E-mail： 1989117xyz@sina.com