20 Hz方波及正弦波頻閃光對(duì)豚鼠眼球發(fā)育的影響

邸悅，陸娜，周曉東，羅秀梅，喬彤

(1. 上海市兒童醫(yī)院，上海 200062； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院，上海 201907； 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

研究報(bào)告

20 Hz方波及正弦波頻閃光對(duì)豚鼠眼球發(fā)育的影響

邸悅1#，陸娜2#，周曉東3，羅秀梅3，喬彤1*

(1. 上海市兒童醫(yī)院，上海 200062； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院，上海 201907； 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

目的評(píng)估持續(xù)高頻正弦波及方波頻閃光對(duì)豚鼠眼球正視化及眼球發(fā)育的影響。方法30只2周齡豚鼠分為20 Hz方波、20 Hz正弦波頻閃組及無(wú)頻閃對(duì)照組共3組(n=10)，光照強(qiáng)度統(tǒng)一為500 lx，每2周測(cè)量豚鼠眼球屈光度、眼軸長(zhǎng)度及曲率半徑，第8周時(shí)對(duì)三組豚鼠行電生理閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢查，取出眼球后行病理評(píng)估組織學(xué)改變。結(jié)果3組豚鼠眼球屈光度與眼軸長(zhǎng)度呈正相關(guān)，第8周時(shí)與對(duì)照組相比，20 Hz正弦波頻閃組及20 Hz方波屈光度出現(xiàn)(-0.75±0.79)D及(-1.50±0.91)D近視性改變(P< 0.05)，曲率半徑3組間差異無(wú)顯著性(P> 0.05)，F(xiàn)-ERG潛伏期20 Hz正弦波及20 Hz方波頻閃組a波延長(zhǎng)了3.8 s及7.9 s，病理三組間組織學(xué)未見(jiàn)顯著性差異。結(jié)論持續(xù)暴露于高頻方波及正弦波頻閃光一定程度上影響眼正視化。

頻閃；頻率；豚鼠；近視；屈光

近年的研究證實(shí)，視覺(jué)體驗(yàn)引導(dǎo)了眼球的生長(zhǎng)并調(diào)控正視化進(jìn)程。眼球在發(fā)育過(guò)程中屈光介質(zhì)會(huì)相互協(xié)調(diào)，最終達(dá)到正視狀態(tài)[1, 2]。眼球發(fā)育除受先天因素影響外，還受視覺(jué)輸入信號(hào)的調(diào)控[3]，進(jìn)而調(diào)控眼軸生長(zhǎng)速度以獲得理想的視網(wǎng)膜圖像[4, 5]。迄今為止，任何一種人工照明均無(wú)法做到對(duì)自然光照的充分模擬，頻閃光近年來(lái)引起了學(xué)者們更多的關(guān)注。在這一方面，Cynader及Cremieux[6, 7]的實(shí)驗(yàn)表明，頻閃光環(huán)境下的貓會(huì)出現(xiàn)不同程度的近視性改變。程振英等[8]通過(guò)將2周齡豚鼠置于200 lx亮暗循環(huán)的頻閃光環(huán)境，6周后證實(shí)眼球增長(zhǎng)，產(chǎn)生了高度近視。王紅等[9]報(bào)道不同波長(zhǎng)的頻閃光紅光組、黃光組、綠光組、白光組與自然光照組相比，不同波長(zhǎng)的閃爍光對(duì)近視的影響存在差異。俞瑩等[10]通過(guò)將C57BL/6大鼠置于及2 Hz、250 lx光強(qiáng)度的LED燈的頻閃光環(huán)境中，證實(shí)頻閃光誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生程度低于形覺(jué)剝奪的軸性近視，這種近視趨勢(shì)在8周左右達(dá)到最高峰。在這一方面，我們分別采用5、1、0.5、0.25、0.1 Hz這5種不同的低頻方波頻閃，對(duì)2周齡豚鼠進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)12周的持續(xù)性暴露，證實(shí)各個(gè)低頻頻閃組均出現(xiàn)了近視性改變，相對(duì)而言0.5 Hz的頻閃光影響最為明顯[11]。

盡管如此，以上研究采用的均為低頻率方波頻閃光，對(duì)于生活中更為常見(jiàn)的高頻頻閃，相關(guān)研究并不充分。此外，人工照明中交流電源發(fā)出的正弦波更為常見(jiàn)，方波相對(duì)少見(jiàn)。因此，本次研究選取了更高頻率的20 Hz的頻閃光，分別采用方波及正弦波頻閃刺激，將發(fā)育敏感期豚鼠置于這兩種不同頻率的異常光覺(jué)環(huán)境中，測(cè)量屈光度、眼軸、曲率等生物參數(shù)，并對(duì)電生理傳導(dǎo)功能及眼底視網(wǎng)膜進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性英國(guó)短毛三色種清潔級(jí)豚鼠共30只【SCXK(滬)2015-0005】，2周齡，體重90～110 g，屈光介質(zhì)透明，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)福利倫理審查(2016R032-F01)，動(dòng)物管理和使用符合法規(guī)要求，飼養(yǎng)于醫(yī)院提供的標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房【SYXK(滬)2010-0098】。本實(shí)驗(yàn)分20 Hz正弦波、20 Hz方波頻閃組及對(duì)照組共3組(n=10)，實(shí)驗(yàn)前屈光度明顯偏離正常范圍豚鼠提前排除。

1.2實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置及分組情況

30只豚鼠分籠飼養(yǎng)，暗室遮光，通風(fēng)良好，室溫20～22℃，濕度55%～65%。獨(dú)立飼養(yǎng)籠具長(zhǎng)×寬×高：50 cm × 40 cm × 60 cm，每個(gè)豚鼠籠由4盞發(fā)光二極管(light-emitting diode，LED，窄譜)固定于鼠籠高50 cm處，所有燈泡通過(guò)控制器調(diào)節(jié)燈光頻閃的頻率及亮度，見(jiàn)圖1-A。實(shí)驗(yàn)前先通過(guò)照度計(jì)測(cè)量籠內(nèi)照明亮度，平均值為500 lx。首次測(cè)量日記錄為0 周，每2 周記錄一次，三組光照時(shí)間6:00～18:00。

1.3眼球生物參數(shù)測(cè)量

1.3.1 眼屈光度

屈光測(cè)定前，雙眼結(jié)膜囊內(nèi)1%復(fù)方托吡卡胺(美多麗)滴眼3次，每次間隔5 min，1 h后在瞳孔直徑>3 mm的情況下，助手撫摸豚鼠使其處于安靜狀態(tài)，予佳能自動(dòng)驗(yàn)光儀進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)量，記錄平均值，見(jiàn)圖1-B。散光予等效球鏡折算，每只眼重復(fù)測(cè)量3次取平均值[12, 13]。

1.3.2 豚鼠眼軸長(zhǎng)度測(cè)定

0.4%鹽酸奧布卡因(倍諾喜)進(jìn)行角膜表面麻醉，BME-200眼科A超儀測(cè)量眼軸長(zhǎng)度(角膜表面到眼球后極部玻璃體視網(wǎng)膜界面的距離)，探頭垂直于角膜平面，自動(dòng)模式連續(xù)測(cè)量10次，記錄眼軸長(zhǎng)度，計(jì)算平均值，精確到0.1 mm[13, 14]。

1.3.3 角膜曲率半徑

OM-4型角膜曲率計(jì)測(cè)量豚鼠角膜曲率半徑。參照目前通用的換算方法，用+8.0 D鏡片貼于曲率計(jì)鏡頭前，測(cè)得的讀數(shù)乘以校正系數(shù)0.451即為豚鼠角膜曲率半徑[15]。

1.3.4 視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)測(cè)量

第8周時(shí)，30只豚鼠予全自動(dòng)視覺(jué)電生理檢測(cè)儀(重慶康華)記錄暗適應(yīng)閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)。Ganzfeld全視野刺激球作閃光刺激器，銀針鉤狀電極。豚鼠視網(wǎng)膜電圖標(biāo)準(zhǔn)化方案[16, 17]記錄左眼F-ERG。測(cè)量前常規(guī)散瞳，記錄電極置于左眼角鞏膜緣，參考電極刺入左側(cè)頰部皮下，接地電極銀針刺于顱頂皮下，刺激閃光強(qiáng)度：2.0 logcd/m2，刺激模式：?jiǎn)未碳?，背景?qiáng)度：off，刺激頻率：0.5 Hz，閃光顏色：白光，刺激次數(shù)：約10次直至波形平滑，生物放大器放大倍數(shù)：10 k，低通頻率：75 Hz，高通頻率：0.1 Hz。測(cè)量過(guò)程中豚鼠保持清醒狀態(tài)，特制支架固定，系統(tǒng)自動(dòng)記錄生成的a、b波的潛伏期及振幅，取平均值。實(shí)驗(yàn)時(shí)測(cè)量圖形見(jiàn)圖1-C。

1.3.5 病理學(xué)觀察組織學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡步驟：沿水平徑通過(guò)角膜中心和視神經(jīng)切開(kāi)眼球，放入2.5%戊二醛-多聚甲醛溶液中固定，HE染色，石蠟固定，BH-2型Olympus光學(xué)顯微鏡觀察并拍照通過(guò)光鏡觀察視網(wǎng)膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1各組屈光度、眼軸及角膜曲率改變

實(shí)驗(yàn)前各組豚鼠屈光度、眼軸及角膜曲率改變差異無(wú)顯著性(P>0.05)，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組隨時(shí)間推移，均出現(xiàn)屈光度降低，眼軸延長(zhǎng)，至第2周時(shí)各組間整體經(jīng)方差分析差異有顯著性(P<0.05)，角膜曲率半徑在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都逐漸增加，但各時(shí)間點(diǎn)各組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)，各組豚鼠屈光度、眼軸及角膜曲率各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。20 Hz正弦波、20 Hz方波及對(duì)照組三組間所測(cè)眼軸及屈光度兩者相關(guān)性有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：屈光度單位為D，角膜曲率及眼軸長(zhǎng)度單位為mm,*三組間方差分析差異有顯著性。

Note. Reraction unit: diopter. The unit of corneal curvature and axial length: mm.*represents the significance of the inter-group difference using ANOVA.

圖2 三實(shí)驗(yàn)組豚鼠眼球眼軸及屈光度相關(guān)性比較(P<0.05)Fig.2 Correlation between axial length and refraction in the three guinea pig groups

2.2第8周時(shí)三組間眼屈光度及眼軸比較

三組間屈光度總體差異有顯著性(F=23.2，P<0.05)，Bonferroni多重比較顯示各組間差異均有顯著性(P<0.05)。三組間眼軸長(zhǎng)度差異有顯著性(F=22.6，P<0.05)，多重比較三組間差異有顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖3。第8周時(shí)，20 Hz正弦波頻閃組與對(duì)照組相比眼球發(fā)生(-0.75±0.79)D的近視，眼軸長(zhǎng)度增加(0.21±0.21)mm。20Hz方波組與對(duì)照組相比眼球發(fā)生(-1.50±0.91)D的近視，眼軸增加(0.39±0.13)mm。

圖3 第8周時(shí)三實(shí)驗(yàn)組屈光度(A)及眼軸(B)比較(*P<0.05)Fig.3 Comparison between refraction (A) and axial length (B) in the three guinea pig groups at 8 weeks old

2.3視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)結(jié)果比較

3組間閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)前兩組間a、b波潛伏期及波幅經(jīng)比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)；在持續(xù)頻閃刺激8周后，20 Hz正弦波頻閃組豚鼠眼球F-ERG的a波潛伏期延長(zhǎng)(3.8±5)s，20 Hz方波頻閃組豚鼠眼球F-ERG的a波潛伏期延長(zhǎng)(7.9±4)s與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.05)；而a波的波幅、b波的潛伏期及波幅經(jīng)比較均無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.4病理學(xué)觀察鞏膜、脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)改變

光鏡觀察：視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜及鞏膜：頻閃組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞層外段形態(tài)差異并不明顯，見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)持續(xù)8周的高頻頻閃光刺激，最后豚鼠的角膜曲率與對(duì)照組相比無(wú)顯著性(P>0.05)，這一點(diǎn)與形覺(jué)剝奪[18]、光學(xué)離焦[18]等豚鼠近視模型的結(jié)果相一致。最后測(cè)量的豚鼠屈光度與眼軸兩者呈正相關(guān)，提示這種正視化的改變?cè)醋杂谘圯S延長(zhǎng)，高頻頻閃光與低頻頻閃光一樣，可以干擾正視化進(jìn)程。就這一點(diǎn)，Crewther[19]指出低頻的時(shí)間調(diào)節(jié)信號(hào)促進(jìn)了近視的發(fā)展，相反，高頻頻閃光可能會(huì)造成一個(gè)遠(yuǎn)視性漂移。在頻閃的頻率高低的界定方面，目前并沒(méi)有明確的定義，本次研究通過(guò)將豚鼠置于20 Hz相對(duì)高頻的頻閃光環(huán)境中，最終并非產(chǎn)生遠(yuǎn)視，而是低度的近視性漂移，考慮這一差異與選取的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、頻閃方式及持續(xù)時(shí)間均有關(guān)。以往研究多集中于小雞，而小雞與哺乳動(dòng)物間有較大差異；此外，以往研究采用的是旋轉(zhuǎn)風(fēng)扇產(chǎn)生的頻閃，這與本實(shí)驗(yàn)中采用的高頻控制器產(chǎn)生的方波及正弦波頻閃有明顯的不同，這兩種頻閃方式對(duì)眼球發(fā)育的具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

表2 三組間豚鼠閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Comparison of F-ERG between the three guinea pig groups

注： 0.024<0.05，20Hz正弦波 VS 對(duì)照組P=0.044<0.05，20Hz方波 VS 對(duì)照組P<0.05。

Note. Comparison of ANOVA (Bonferroni) (20 Hz sinusoidal wave group vs. 20 Hz square wave group,P=0.024<0.05. 20 Hz sinusoidal wave group vs. control wave group,P=0.044<0.05. 20 Hz square wave group vs. control group,P<0.05.

注：20 Hz正弦波頻閃組(A)，20 Hz方波頻閃組(B)及對(duì)照組(C)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)比較(HE×100，標(biāo)尺：20 μm)。圖4 病理學(xué)觀察鞏膜、脈絡(luò)膜及視網(wǎng)膜的組織學(xué)結(jié)構(gòu)Note. 20 Hz sinusoidal wave group (A), 20 Hz square wave group (B) and control group (C). H&E staining, ×100, bar=20 μm.Fig.4 Histological structure of the sclera, choroid membranes and retina

在我們之前的研究中[20]，暴露于0.5 Hz的方波頻閃光的豚鼠產(chǎn)生了近-6.6 D的近視性漂移。與之前研究的低頻方波頻閃光相比，高頻頻閃光誘導(dǎo)的豚鼠產(chǎn)生的近視屈光度明顯低，而正弦波頻閃光低于方波頻閃。8周的方波頻閃光誘導(dǎo)僅產(chǎn)生了(-1.50±0.91)D的近視，而正弦波頻閃光更是僅產(chǎn)生了(-0.75±0.79)D的近視。通過(guò)對(duì)豚鼠眼底視網(wǎng)膜組織學(xué)的分析，在病理上，無(wú)論是方波還是正弦波組，我們均未發(fā)現(xiàn)頻閃光組與對(duì)照組間有明顯的差異。在以往研究中，程振英等[8]通過(guò)將出生2周齡豚鼠置于0.25 Hz的頻閃光環(huán)境下，證實(shí)近視模型的視網(wǎng)膜感覺(jué)細(xì)胞層可見(jiàn)外段排列紊亂且有大量脫落節(jié)盤(pán)。這種結(jié)構(gòu)的改變?cè)谛斡X(jué)剝奪性近視模型中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)[21]。Meyer[22]指出光線介導(dǎo)的感光細(xì)胞的損害一旦表現(xiàn)出來(lái)，就會(huì)趨向于漸進(jìn)且不可逆，與過(guò)多的調(diào)亡的膜盤(pán)積累在視網(wǎng)膜色素上皮層內(nèi)，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為脂褐素有關(guān)[23]。本研究中，我們選取了更高的20 Hz頻閃，頻率要比以往的0.5 Hz及0.25 Hz要高很多，結(jié)果表明對(duì)眼球視網(wǎng)膜的影響比較微弱，這提示低頻頻閃對(duì)眼球的影響要明顯大于高頻頻閃。就這一點(diǎn)，有研究[24]提示感知對(duì)某些特定頻率可能更有傾向性，不同的頻率會(huì)產(chǎn)生不一樣的作用效果。Umino[25]指出視力是由空間與時(shí)間信號(hào)共同組成，在中間的時(shí)空頻率作用達(dá)到最大。我們此前選取也表明，0.5 Hz的頻率刺激對(duì)正視化更為明顯。

對(duì)于頻閃光產(chǎn)生的屈光改變，一種可能解釋是：忽明忽暗的影像閃動(dòng)使視網(wǎng)膜僅接受了少一半的光刺激，視覺(jué)系統(tǒng)正常的發(fā)育調(diào)控機(jī)制沒(méi)有充分激活，這種物像不清的狀況與形覺(jué)剝奪產(chǎn)生的近視相類(lèi)似。本研究中正弦波要比方波的光刺激更弱，考慮與此有關(guān)。另一種解釋是：由于瞳孔頻繁應(yīng)對(duì)頻閃刺激，睫狀肌始終處于收縮狀態(tài)，最終不得不放棄正常的調(diào)節(jié)，致使視覺(jué)系統(tǒng)無(wú)法對(duì)物像進(jìn)行準(zhǔn)確的聚焦，這種紊亂本質(zhì)上可能接近調(diào)節(jié)滯后，使得圖像成像在視網(wǎng)膜后，這一點(diǎn)與遠(yuǎn)視性離焦相似。顯然，高頻率的頻閃光較低頻率的頻閃對(duì)視覺(jué)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制以及調(diào)節(jié)系統(tǒng)的影響會(huì)更小，因此對(duì)正視化的影響也更小。

綜上，本次研究在以往低頻率方波頻閃近視模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察了高頻率頻閃光對(duì)眼球發(fā)育的影響，同時(shí)，分析了兩種不同波形的頻閃光之間的差異。結(jié)果表明20 Hz高頻下的方波和正弦波均可以一定程度產(chǎn)生近視性漂移，未來(lái)的研究應(yīng)著重于分子通路機(jī)制方面的研究，而頻閃光的頻率及波長(zhǎng)對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育存在的內(nèi)在機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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Effectsof20Hzsinusoidalor20Hzsquarewavestroboscopicilluminationontheeyeballgrowthinguineapigs

DI Yue1#, LU Na2#, ZHOU Xiao-dong3, LUO Xiu-mei3, QIAO Tong1*

(1. Shanghai Children’s Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200062, China； 2. Huashan Hospital North Area, Fudan University, Shanghai 201907； 3. Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508)

ObjectiveTo investigate the effect of prolonged stroboscopic illumination exposure on the growth of eyeball of guinea pig.MethodsThirty 2-week-old guinea pigs were randomized into three groups (n=10 for each). Two strobe-reared groups were raised with 20 Hz sinusoidal and 20 Hz square wave stroboscopic illumination, respectively. The control group

usual light illumination.The illumination intensity was 500 lux. All animals underwent refraction and biometric measurements prior to and after 2, 4, 6 and 8 weeks of treatment. Finally, flash electroretinograms were compared, and retinal microstructures were examined.ResultsThere was a significant correlation between refractive errors and axial eye elongation, and myopia increasing was observed with eye elongation. After 8 weeks of treatment, the animals raised in 20 Hz sinusoidal and 20 Hz square wave stroboscopic illumination were (-0.75±0.79)D and (-1.50±0.91)D more myopic than the group raised in continuous illumination. The implicit time of the a-wave was delayed by 3.8 and 7.9 ms, respectively. No significant difference was found in retinal ultrastructures among the three groups.ConclusionsChronic exposure to 20 Hz sinusoidal or square wave stroboscopic illumination alters the emmetropization of the guinea pig eye to some extent.

Stroboscopic illumination; Frequency; Guinea pig; Myopia; Refraction

QIAO Tong. E-mail： Qiaojoel@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0500-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.006

2017-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81400428)。

邸悅(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，E-mail： diyue9@126.com;陸娜(1980-),女，博士，副主任醫(yī)師，E-mail： drluna@126.com。#共同第一作者。

喬彤，女，博士，主任醫(yī)師，研究方向：小兒眼科。E-mail： Qiaojoel@163.com