三七皂苷S-6的溶血性及體外免疫活性研究

秦 楓，朱善元，成大榮，陳玉勇，左偉勇，王安平，王永娟，吳 雙，洪偉鳴

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

三七皂苷S-6的溶血性及體外免疫活性研究

秦 楓1,2，朱善元1，成大榮1,2，陳玉勇1，左偉勇1，王安平1，王永娟1，吳 雙1，洪偉鳴1

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，泰州 225300；2. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

研究三七皂苷S-6 的溶血性及體外免疫活性。常規(guī)方法提取PNS，大孔樹脂柱層析分離純化得S-6。溶血試驗(yàn)測(cè)定紅細(xì)胞溶血率。脾淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定S-6 的安全劑量范圍，體外脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和IL-2的誘生及含量測(cè)定檢測(cè)S-6 的體外免疫活性。S-6 溶血性較小，2 mg/mL濃度以下無溶血性；S-6（0.1 μg/mL、1 μg/mL）顯著促進(jìn)了Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，且與PNS和APS組相比，差異不顯著；S-6（1 μg/mL）極顯著地促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，且與PNS相比，S-6（1 μg/mL）差異顯著，其余各個(gè)劑量與PNS和APS組相比，差異不顯著；S-6（12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL）顯著或極顯著地提高了IL-2的含量，且與PNS和APS組相比，差異不顯著。S-6 安全性好，體外具有較好的細(xì)胞免疫活性和誘生細(xì)胞因子的能力。

S-6；溶血性；體外免疫活性；脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；IL-2

Abstract:To investigate the hemolytic characteristics and biologic immunocompetence of S-6 in vitro, PNS was extracted using butyl alcohol and S-6 was obtained by separation and puri fi cation with D101 macroreticular resin. The in vitro hemolytic activity, range of safe dose and immunocompetence of S-6 were examined for parameters including hemolysis, inducible and content determination of IL-2, splenocyte toxicity and proliferation. The hemolytic activity of S-6 was lower than 2 mg/mL. S-6 significantly increased concanavalin A-stimulated splenocyte proliferation in vitro at 0.1 μg/mL. However, S-6 had no signi fi cant difference with PNS and APS at 1 μg/mL. S-6 signi fi cantly increased concanavalin lipopolysaccharide-stimulated splenocyte proliferation in vitro at 1 μg/mL and had signi fi cant difference with PNS. S-6 also increased the content of IL-2 at 12.5 μg/mL, 25 μg/mL and 50 μg/mL and had no signi fi cant difference with PNS and APS. In conclusion, S-6 had high security and increased cellular response and in vitro content of IL-2.

Key words:S-6; hemolytic characteristics; immunocompetence in vitro; splenocyte proliferation; IL-2

近年來，新城疫、禽流感、口蹄疫、豬藍(lán)耳等畜禽疾病在各地頻繁爆發(fā)，給我國(guó)畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來重大損失。疫苗免疫是目前控制動(dòng)物傳染病的較好的方法。然而，雖然大部分養(yǎng)殖企業(yè)嚴(yán)格按照免疫流程接種疫苗，但很多情況下免疫效果并不理想，很多傳染病仍不能從根本上得以控制。如在疫苗免疫的同時(shí)，配合應(yīng)用免疫增強(qiáng)劑可以提高疫苗的免疫應(yīng)答能力，因此研制出高效、安全的免疫增強(qiáng)劑成為畜牧業(yè)發(fā)展的迫切需求。三七為五加科人參屬植物三七Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen的根及根莖，是歷年來醫(yī)家圣藥，其主要有效成份為三七總皂苷（PNS），含有多種單體皂苷，具有抑制血小板凝集、降低心肌耗氧量等作用，近來，隨著其抗腫瘤作用的發(fā)現(xiàn)，其研究日益廣泛[1]。皂苷在高等動(dòng)物消化道中吸收要經(jīng)過轉(zhuǎn)化，故口服一般無溶血性，但其注射劑應(yīng)用于臨床對(duì)溶血性要求很高，故研究其溶血性對(duì)臨床用藥安全性評(píng)價(jià)有重要的作用。Sun等[2,3]已經(jīng)報(bào)道過PNS對(duì)于OVA受免小鼠的免疫作用，但其不同極性組分的免疫作用研究較少。S-6系PNS中皂苷含量最高的組分，本文旨在探討S-6的溶血性和體外免疫活性，為PNS分離精制工藝的優(yōu)化及臨床合理用藥等提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭兔，普通級(jí)，體重（2.6±0.2）kg；ICR小鼠，體重（18～22）g。均購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院動(dòng)物比較醫(yī)學(xué)中心。

1.2 試劑三七藥材，購(gòu)于文山三七研究院；黃芪多糖（APS），江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，含量為78%；刀豆蛋白A（Con A），脂多糖（LPS），噻唑藍(lán)（MTT），均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；小鼠IL-2測(cè)定試劑盒購(gòu)自揚(yáng)州科能生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器NU-4750E型CO2培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海三發(fā)科技儀器公司；EL×800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、CKX41型倒置顯微鏡，均購(gòu)自美國(guó)伯騰儀器科技有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠；HPX-9162MBE 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；KQ-2200DB 型數(shù)控超聲波清洗器，購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 S-6 的制備按文獻(xiàn)[3]所報(bào)道方法，制備精制三七總皂苷PNS。將PNS經(jīng)D101大孔吸附樹脂柱初步分離，得到S-1、S-2、S-3、S-4 4個(gè)組份。S-2以大孔樹脂柱再次分離，得S-5、S-6 2個(gè)組份，各部分單獨(dú)收集濃縮，各組份的含量測(cè)定，按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行，S-6系含量最高的組份，總皂苷含量為815. 2 mg/g。

1.5 S-6 溶血性的測(cè)定

1.5.1 紅血球細(xì)胞懸浮液的制備 按文獻(xiàn)[2]的方法，調(diào)整紅細(xì)胞懸液濃度為2%。

1.5.2 測(cè)定 按文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行，PNS、S-6分別以生理鹽水稀釋，配制成濃度為4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL的濃度系列，并設(shè)4個(gè)重復(fù)；以蒸餾水和生理鹽水組分別作陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組溶血對(duì)照。測(cè)定OD412值。

1.5.3 溶血率的計(jì)算 溶血率=(Ti-T0)/(Tmax-T0)×100。Tmax：陽性對(duì)照作用組的吸光度；T0：陰性作用組吸光度；Ti：不同濃度的PNS、S-6作用時(shí)測(cè)得的吸光度。陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的溶血率分別為100%和0%。

1.6 脾淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)

1.6.1 脾細(xì)胞懸液制備 無菌條件下取小鼠的脾臟，加適量Hanks液研磨，以200目不銹鋼網(wǎng)濾過，1500 rpm離心5分鐘，棄上清，加Hanks液重復(fù)洗滌2次。收集脾細(xì)胞，加適量RPMI 1640培養(yǎng)液混懸，以0.4%臺(tái)盼蘭活細(xì)胞拒染法計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)不小于95%，加RPMI 1640完全培養(yǎng)液稀釋，并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL。

1.6.2 脾淋巴細(xì)胞毒性的測(cè)定 于96孔培養(yǎng)板中每孔加入脾細(xì)胞懸液100 μL，各加入50 μL的PNS、S-6和APS進(jìn)行處理，并設(shè)培養(yǎng)液為對(duì)照組。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱溫育48 h，培養(yǎng)終止前4 h加5 mg/mL MTT（20 μL/孔），終止培養(yǎng)后，離心，棄上清，每孔加DMSO 150 μL，振蕩10 min，測(cè)定OD570。

1.7 S-6 免疫活性測(cè)定

1.7.1 脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 按文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行，并計(jì)算其刺激指數(shù)（SI）。

1.7.2 小鼠脾細(xì)胞上清中IL-2含量的測(cè)定

1.7.2.1 小鼠 IL-2 的誘生 按文獻(xiàn)[5]的方法在無菌條件下常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)（應(yīng)在95% 以上），用含10%小牛血清的RPM I-1640 調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×106個(gè)/mL，加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每孔加入Con A 50 μL（終濃度 5 μg/mL）和500 μL不同濃度（50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）的PNS、S-6 和APS，每個(gè)濃度設(shè)3孔，對(duì)照組加入完全培養(yǎng)液。在 37℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 48 h，離心（268×g，10 min），收集上清，－20℃保存。

1.7.2.2 小鼠IL-2的檢測(cè) 按照試劑盒說明，用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IL-2的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所得數(shù)據(jù)用±s表示，并用SPSS 17.0獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 溶血性試驗(yàn)結(jié)果由表1可以看出，在0.5 mg/mL時(shí)，PNS開始出現(xiàn)明顯的溶血作用，與陰性對(duì)照溶血性具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在2 mg/mL濃度以下，S-6幾乎無溶血作用，而PNS的溶血作用與陰性對(duì)照的溶血性具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），此濃度遠(yuǎn)小于臨床應(yīng)用濃度；4 mg/mL時(shí)，呈現(xiàn)極明顯的溶血作用。

表1 S-6的溶血性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of the hemolytic experiment (the percentage of hemolysis

2.2 S-6對(duì)脾臟細(xì)胞安全濃度的測(cè)定S-6對(duì)脾臟細(xì)胞安全濃度的測(cè)定詳見表2，在所選濃度范圍內(nèi)，PNS、S-6及APS均在500 μg/mL 時(shí)，其細(xì)胞OD570值與對(duì)照組差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，為便于在相同濃度比較其活性，選擇100 μg/mL濃度開始測(cè)定S-6的活性。

表2 S-6對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞安全濃度Table 2 The safe concentration of S-6 to splenic lymphocyte of mice

2.3 免疫活性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 S-6體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響S-6體外對(duì)Con A和LPS誘導(dǎo)小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)影響，結(jié)果見圖1、圖2。由圖1可見，PNS（1～100 μg/mL）、APS（0.1～100 μg/mL）和S-6（0.1 μg/mL）體外均能顯著或極顯著促進(jìn)Con A誘導(dǎo)的小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05或P＜0.001）。且S-6的作用與PNS、APS差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。由圖2可見，PNS（1～100 μg/mL）、APS（0.1～100 μg/mL）和S-6（0.1 μg/mL）體外均能顯著或極顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05或P＜0.001），1～10 μg/mL時(shí)，S-6和APS之間差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖1 S-6體外對(duì)Con A誘導(dǎo)小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 1 Effect of S-6 on Con A-stimulated T lymphocytes proliferation of mice in vitro

圖2 S-6體外對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠B淋巴細(xì)胞增殖能力的影響Fig. 2 Effect of S-6 on LPS-stimulated B lymphocytes proliferation of mice in vitro

2.3.2 S-6體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2能力的影響 如表3所示，PNS、S-6、APS濃度在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)小鼠 T細(xì)胞分泌 IL-2 均表現(xiàn)出一定的增強(qiáng)作用，且濃度在12.5～50 μg/mL時(shí)對(duì) IL-2 分泌的促進(jìn)作用具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。S-6與相同濃度的PNS、APS相比，差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

3.1 S-6的溶血性研究皂苷具有溶血性，據(jù)研究[6]，其溶血性與分子結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系，并不是所有的皂苷都有溶血性，且三萜皂苷的溶血性小于甾體皂苷。Quil A系從南美皂樹Quillaja saponaria中分離得到的三萜總皂苷，具有較好的免疫活性，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物臨床，但溶血性很大，其半數(shù)溶血量（hemolytic dose，HD50）為19.91±0.57 μg/mL[7]。本文溶血性試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了S-6的溶血性顯著低于Quil A，安全性較好。

相關(guān)學(xué)者對(duì)三七的溶血性做了一定的研究。張劍鋒等[8,9]以三七為主要成分的血塞通注射液為研究對(duì)象，就肉眼觀察法、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)法和分光光度法3種溶血檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)分光光度法較其他2種方法更適合用于藥物溶血活性的檢測(cè)，并檢測(cè)了不同血塞通注射液作用于兔紅細(xì)胞后的溶血作用和血紅蛋白變化，結(jié)果表明，在達(dá)到一定濃度時(shí)，可出現(xiàn)正常溶血和異常溶血情況，正常溶血下，血紅蛋白釋放出來，異常溶血下，血紅蛋白的特征吸收峰發(fā)生了變化，提示發(fā)生了結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。靜脈注射由于皂苷直接作用于紅細(xì)胞未經(jīng)過轉(zhuǎn)化，易發(fā)生溶血，其溶血作用與體外作用相似,口服制劑由于經(jīng)過胃腸道吸收、轉(zhuǎn)化，僅少數(shù)有溶血性。唐嬌[10]以大鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，取三七粉按照高、中、低三個(gè)劑量組按照各自的劑量灌胃，連續(xù)灌胃90 d，取抗凝血進(jìn)行血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白含量等指標(biāo)與對(duì)照組相比均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。取血清進(jìn)行血清溶血素試驗(yàn)，測(cè)定血清溶血素的半數(shù)溶血值，與對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。由于S-6的溶血性遠(yuǎn)小于三七的主要成分PNS，在臨床上，合理控制S-6的濃度，可以安全應(yīng)用。

表3 S-6對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IL-2的影響Table 3 Effect of S-6 on the secretion of IL-2 from spleen lymphocytes of mice

3.2 S-6體外對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的影響淋巴細(xì)胞增殖是反映細(xì)胞免疫最直接的指標(biāo)，有絲分裂原Con A能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的分裂，T淋巴細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞免疫的一種重要反應(yīng)，可以抵抗細(xì)胞內(nèi)微生物感染，其數(shù)量和功能直接對(duì)細(xì)胞免疫具有決定性的作用。有絲分裂原LPS能夠促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖，并能夠產(chǎn)生各種抗體，主要參與體液免疫反應(yīng)，本研究證明了S-6既能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，也能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，但效果較PNS差。

3.3 S-6體外對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2能力的影響IL-2主要由活化的CD4+Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)Th0和CTL的增殖，具有廣泛的生物活性。各種刺激物活化的T細(xì)胞一般不能在體外培養(yǎng)中長(zhǎng)期存活，加入IL-2則能其長(zhǎng)期持續(xù)增殖，因此IL-2又稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子。靜止的T細(xì)胞表面不表達(dá)IL-2R，對(duì)IL-2沒有反應(yīng)；受絲裂原或其他刺激活化后T細(xì)胞才能表達(dá)IL-2R，成為IL-2的靶細(xì)胞；而IL-2又可誘導(dǎo)靶細(xì)胞增加IL-2R的表達(dá)。IL-2對(duì)B細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化均有一定的促進(jìn)作用，較高密度的IL-2可誘導(dǎo)B細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)抗體分泌，并誘使B細(xì)胞由分泌IgM向著分泌IgG2轉(zhuǎn)換。IL-2能在體外與IL-4、IL-5和IL-6一起共同誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）的產(chǎn)生，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷能力。

本研究發(fā)現(xiàn)，各種濃度的S-6均可以促進(jìn)小鼠T 細(xì)胞 IL-2 的分泌，在較低劑量下即可促進(jìn)小鼠 T細(xì)胞 IL-2的分泌。但隨著S-6 濃度的升高，促進(jìn)作用有所下降。S-6對(duì)Con A誘導(dǎo)的小鼠 T 體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)也呈現(xiàn)這種趨勢(shì)。其原因可能與IL-2 和淋巴細(xì)胞之間的協(xié)同作用有關(guān)，即S-6首先促進(jìn)了IL-2 的分泌，IL-2 作為一種激活物誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞表達(dá)IL-2R，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-2的產(chǎn)生。

綜上，S-6的溶血性較小，安全濃度較高，能夠顯著促進(jìn)體外T、B淋巴細(xì)胞增殖，且能夠促進(jìn)IL-2的表達(dá)，其體外免疫增強(qiáng)效果較APS強(qiáng)，但與PNS相比，差異不顯著，不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明若如要進(jìn)一步對(duì)PNS進(jìn)行分離純化，得到含量較高的皂苷，并不影響其免疫活性，PNS里含有的其他類別物質(zhì)如多糖類亦可能對(duì)免疫功能有一定的促進(jìn)作用，其體內(nèi)作用及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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STUDY ON HEMOLYTIC ACTIVITY AND IMMUNOCOMPETENCE OF S-6 IN VITRO

QIN Feng1,2, ZHU Shan-yuan1, CHENG Da-rong1,2, CHEN Yu-yong1, ZUO Wei-yong1, Wang An-ping1,Wang Yong-juan1, WU Shuang1, HONG Wei-ming1

(1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China; 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

S853.74

A

1674-6422（2017）04-0045-05

2016-12-28

江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目；江蘇省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目“新型中獸藥免疫增強(qiáng)劑復(fù)方桑杜口服液的研制”項(xiàng)目(BY2015066-01)；江蘇高?！扒嗨{(lán)工程”資助；“泰州市311人才工程”項(xiàng)目；學(xué)院“鳳凰人才工程”項(xiàng)目

秦楓，女，博士，副教授，主要從事天然藥物與動(dòng)物免疫藥理研究

朱善元，E-mail：jstzzsy@126.com