人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向納米基因載體制備及 體外細(xì)胞磁共振成像

龐鵬飛，李 冰，毛軍杰，周 斌，胡曉俊，張永裕，敖 峰，單 鴻*

(1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，2.眼科，廣東 珠海 519000)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向納米基因載體制備及體外細(xì)胞磁共振成像

龐鵬飛1，李 冰2，毛軍杰1，周 斌1，胡曉俊1，張永裕1，敖 峰1，單 鴻1*

(1.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，2.眼科，廣東 珠海 519000)

目的探討靶向納米基因載體單鏈神經(jīng)節(jié)苷脂抗體-聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION)轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)的可行性、效率及體外細(xì)胞MR顯像能力。方法合成scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION后，采用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)評(píng)估其復(fù)合外源性基因的能力；動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)量scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位；體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)hBMSCs的細(xì)胞毒性。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION靶向轉(zhuǎn)染hBMSCs的效率，并設(shè)置PEG-g-PEI-SPION組、cAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2)組和同型抗體(scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION)組，通過激光共聚焦顯微鏡及普魯士藍(lán)染色觀察hBMSCs對(duì)納米復(fù)合物的攝入。通過體外細(xì)胞MR掃描驗(yàn)證scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的MR成像功能。結(jié)果scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION細(xì)胞毒性小，復(fù)合外源性基因后能夠形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物，粒徑80～100 nm。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的轉(zhuǎn)染率明顯高于其他組(P<0.001)。N/P=20時(shí)，靶向組具有最高轉(zhuǎn)染率[(59.60±4.50)%]。同時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION中的SPION可有效標(biāo)記hBMSCs，在MR T2/T2*加權(quán)圖像上呈低信號(hào)。結(jié)論scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一種MRI可視的、可有效轉(zhuǎn)染hBMSCs的靶向納米基因載體。

骨髓；間充質(zhì)干細(xì)胞；磁共振成像；靶向基因載體；納米醫(yī)學(xué)

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells, hBMSCs)具有向肝樣細(xì)胞分化的潛能，參與肝損傷的修復(fù)[1-2]。隨著對(duì)治療機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)移植入肝臟的hBMSCs僅少數(shù)分化為肝樣細(xì)胞，多數(shù)hBMSCs以旁分泌和免疫調(diào)節(jié)的方式參與肝損傷的修復(fù)，極大降低了其預(yù)期療效[3]。有學(xué)者[4-6]研究發(fā)現(xiàn)hBMSCs可分化為肌成纖維樣細(xì)胞，不僅未發(fā)揮治療作用，反而加重了肝纖維化，甚至導(dǎo)致肝硬化。目前仍缺乏對(duì)hBMSCs生物學(xué)過程長(zhǎng)期、實(shí)時(shí)示蹤的有效手段[7-9]。納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展和分子影像學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為解決間充質(zhì)干細(xì)胞領(lǐng)域的共性難題提供了可能。本研究根據(jù)hBMSCs表面標(biāo)記物二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2(neural ganglioside)制備靶向納米基因載體，評(píng)價(jià)制備該載體的可行性、效率及體外細(xì)胞MR顯像功能。

1 材料與方法

1.1 材料 根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]的方法合成聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(PEG-g-PEI-SPION)。hBMSCs由中山大學(xué)干細(xì)胞中心惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，low glucose)、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。紅色熒光染料popo-3、綠色熒光染料Oregon Green 488、細(xì)胞核熒光染料DAPI購(gòu)自美國(guó)Molecular Probes公司。商品化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectaminTM2000購(gòu)自廣州碧云天生物科技公司。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(plasmid EGFP-C1, 4.70 kb)提取后采用1%凝膠電泳鑒定，濃度2.40 μg/μl。GD2抗體和GD2同型抗體購(gòu)自美國(guó)BD Biosciene Pharmingen公司。

1.2 靶向納米基因載體單鏈神經(jīng)節(jié)苷脂抗體-聚乙二醇-聚乙烯亞胺-超順磁性氧化鐵(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION)的制備 室溫下100 mg巰基乙胺溶于500 μl含20 μl EDTA(0.5 M，pH=8.0)的PBS中。200 μl GD2抗體與200 μl EDTA充分混合后加入到上述巰基乙胺溶液，37℃孵育90 min，獲得單鏈GD2抗體(single chain AbGD2，scAbGD2)。將單鏈GD2抗體溶液轉(zhuǎn)移至50 ml超濾離心管中(MWCO=10 kDa)，加入15 ml含EDTA的PBS(pH=7.40，每500 μl含10 μl 0.5 M EDTA)，于4℃恒溫離心機(jī)中離心40 min，轉(zhuǎn)速4 000 rpm，重復(fù)3次。加入200 μg mal-PEG-COOH，4℃孵育過夜，反應(yīng)獲得scAbGD2-PEG-COOH。加入15 ml PBS(pH7.4)于4℃恒溫離心機(jī)中離心40 min，轉(zhuǎn)速4 000 rpm，重復(fù)3次。取EDC和NHS各10 μg活化scAbGD2-PEG-COOH中的羧基15 min，加入PEG-g-PEI-SPION 200 μg，充分混合后于4℃反應(yīng)過夜。超濾離心除去小分子雜質(zhì)后將剩余的溶液轉(zhuǎn)移至1.50 ml EP管，12 000 rpm離心除去游離抗體，收集離心后的沉淀，超聲分散至蒸餾水中備用。

1.3 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物的制備 將1 μg的pDNA與不同比例的scAb GD2-PEG-g-PEI-SPION分別溶于超純水中，通過靜電作用形成不同N/P比值(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION 的氮原子與pDNA的磷原子的摩爾比)的納米復(fù)合物。

1.4 瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 制備不同N/P比值(2.1、2.2、2.3、2.4、2.5)的scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物，pDNA 1 μg，體系10 μl。納米復(fù)合物與加樣緩沖液充分混合后加入到1%的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，時(shí)間25 min。

1.5 納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位測(cè)定 制備不同N/P比值(5、10、15、20、25、30、35、40)的PEG-g-PEI-SPION/pDNA和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物，pDNA 2 μg，體系100 μl。室溫下使用動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS，ELS-8000，Photal，Japan)測(cè)量納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位。

1.6 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) hBMSCs以8 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，每孔加入100 μl全培養(yǎng)基(DMEM含10% FBS，1%青霉素，1%鏈霉素)，于培養(yǎng)箱中(37℃，5% CO2)常規(guī)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞與不同N/P比值(5、10、15、20、25、30、35、40)的PEG-g-PEI-SPION/pDNA和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA納米復(fù)合物(pDNA 0.15 μg，體系3 μl)共同培養(yǎng)24 h。然后向每孔加入10 μl CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光值。每個(gè)N/P比值設(shè)3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。

1.7 體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔加入1 ml全培養(yǎng)基，細(xì)胞于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)12 h。實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞與不同N/P比值(0、10、15、20、30、40)的納米復(fù)合物(pDNA 4 μg，體系30 μl)共同培養(yǎng)12 h，PEG-g-PEI-SPION組和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的用量根據(jù)N/P比值計(jì)算。然后更換全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)40 h。對(duì)照組的轉(zhuǎn)染采用商品化的陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine。每個(gè)樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制(scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2)組和同型抗體(scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION)組進(jìn)行抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)和同型抗體實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)束后使用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并使用流式細(xì)胞分析儀(BD，美國(guó))檢測(cè)轉(zhuǎn)染率。

1.8 激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn) 綠色熒光染料Oregon Green 488采用超濾法標(biāo)記納米載體。紅色熒光染料popo-3用于標(biāo)記pDNA。Oregon Green 488標(biāo)記的納米載體與popo-3標(biāo)記的pDNA按照N/P=20制備納米復(fù)合物(pDNA 4 μg，體系30 μl)。2×105個(gè)hBMSCs接種于35 mm玻璃底培養(yǎng)皿，加入1 ml全培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)12 h。將上述熒光標(biāo)記的納米復(fù)合物加入到培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛1 ml固定10 min后使用DAPI染核15 min。培養(yǎng)皿置于激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，德國(guó))下觀察并拍攝圖像。

1.9 普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h。將納米復(fù)合物(N/P=20，pDNA 4 μg，體系30 μl)加入到培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)6 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次，加入4%的多聚甲醛1 ml固定10 min。每孔加入1 ml Perls液(2%的亞鐵氰化鉀與2%的鹽酸水溶液等量混合)染色30 min后于顯微鏡下觀察。

1.10 細(xì)胞MR顯像 將hBMSCs以2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h。制備鐵濃度為0、5、10、20、40、60 μg/ml的納米復(fù)合物(N/P=20，pDNA 4 μg)，共同培養(yǎng)6 h后收集細(xì)胞。采用1.5T MR掃描儀、3 inch表面線圈，對(duì)所得細(xì)胞進(jìn)行掃描，獲得T2/T2*加權(quán)圖像。掃描結(jié)束后測(cè)量不同鐵濃度下細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料以±s表示。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION與PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性和Lipofectamine的轉(zhuǎn)染率采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) PEG-g-PEI-SPION和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION分別在N/P為2.3和2.4時(shí)完全復(fù)合pDNA，形成電中性或偏正電荷的納米復(fù)合物(圖1)。

圖1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) A.N/P=2.3時(shí)，PEG-g-PEI-SPION完全復(fù)合pDNA； B.N/P=2.4時(shí)，pDNA被scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION完全復(fù)合，此時(shí)pDNA在電泳時(shí)的遷移被完全阻滯

2.2 納米復(fù)合物的粒徑大小及表面電位 PEG-g-PEI-SPIO和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION未復(fù)合pDNA時(shí)粒徑大小約60 nm。N/P≥10時(shí)形成穩(wěn)定的粒徑為80～100 nm的納米復(fù)合物，表面電位隨N/P比值的增大而逐漸增加，見圖2。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性隨N/P比值的增大而增加。N/P=20時(shí)靶向組細(xì)胞的存活率為(80.56±1.29)%，非靶向組細(xì)胞的存活率為(77.70±1.49)%，見圖3。在相同的N/P比值下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION與PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 粒徑大小及表面電位測(cè)定，兩者未復(fù)合pDNA時(shí)粒徑大小約為60 nm，N/P≥10時(shí)形成穩(wěn)定的粒徑80～100 nm的納米復(fù)合物，表面電位隨N/P比值的增大而增加 A.PEG-g-PEI-SPIO； B.scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION 圖3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 納米復(fù)合物的細(xì)胞毒性隨N/P比值的增大而增加

圖4 不同載體轉(zhuǎn)染hBMSCs的結(jié)果 A.N/P=20時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； B.10 μl Lipofectamine復(fù)合4 μg pDNA轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； C.N/P=20時(shí)PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs后綠色熒光蛋白表達(dá)情況(×100)； D.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果 (#：與相同的N/P比值下scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組比較，P<0.001；*：N/P=20時(shí)，與其余各組比較，P<0.001)

2.4 轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 在相同N/P比值下，不同組別間轉(zhuǎn)染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.303，P<0.001)。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組的轉(zhuǎn)染率明顯高于PEG-g-PEI-SPION組、scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組和scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION組(P均<0.001)，余兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。N/P=20時(shí)，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組轉(zhuǎn)染率最高，為(59.60±4.50)%；PEG-g-PEI-SPION組的最高轉(zhuǎn)染率為(17.70±2.90)%；scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組的最高轉(zhuǎn)染率為(16.30±2.60)%；scAbGD2a-PEG-g-PEI-SPION組的最高轉(zhuǎn)染率為(16.70±4.10)%。Lipofectamine轉(zhuǎn)染hBMSCs的最佳條件為4 μg pDNA與10 μl Lipofectamin復(fù)合，此時(shí)轉(zhuǎn)染率為(34.90±3.60)%。N/P=0時(shí)無綠色熒光蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染率為零(數(shù)據(jù)未列出)。見圖4。

2.5 激光共聚焦顯微鏡及普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見很強(qiáng)的顆粒狀分布的綠色熒光和紅色熒光(圖5)，即hBMSCs攝入了大量的納米復(fù)合物。普魯士藍(lán)染色示scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的胞質(zhì)內(nèi)可見較多藍(lán)染鐵顆粒(圖6)。

2.6 細(xì)胞MR顯像 scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、PEG-g-PEI-SPION組及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組的細(xì)胞在MR T2/T2*加權(quán)圖像上均呈低信號(hào)(圖7)。隨鐵濃度的增加，細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度逐漸降低。在相同的鐵濃度下，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION信號(hào)降低的程度明顯高于PEG-g-PEI-SPION和scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2制組(圖8)。

圖5 hBMSCs攝取納米復(fù)合物的激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)(×30) scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(A)、Oregon Green 488(B)、popo-3(C)和Merge(D)標(biāo)記后的圖像，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有很強(qiáng)的綠色熒光和紅色熒光;PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(E)、Oregon Green 488(F)、popo-3(G)和Merge(H)標(biāo)記后的圖像，及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD組hBMSCs細(xì)胞被DAPI(I)、Oregon Green 488(J)、popo-3(K)和Merge(L)標(biāo)記后的圖像，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅可見到少量綠色熒光和紅色熒光

圖6 hBMSCs攝取靶向和非靶向納米復(fù)合物的普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)(×200) A.scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的胞質(zhì)內(nèi)可見較多的藍(lán)染鐵顆粒； B.PEG-g-PEI-SPION組hBMSCs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)僅能見到少量的藍(lán)染鐵顆粒 圖7 hBMSCs MR T2/T2*加權(quán)成像 A.T2WI; B.T2*WI (從上向下依次為scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION組、PEG-g-PEI-SPION組及scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2組)

3 討論

Ahn等[12]采用PEI為載體負(fù)載綠色熒光蛋白質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，最高轉(zhuǎn)染率僅19%。本研究PEG-g-PEI-SPION轉(zhuǎn)染hBMSCs的最高轉(zhuǎn)染率僅(17.70±2.90)%。為提高納米載體的轉(zhuǎn)染率，常采用靶向修飾納米載體的方法。細(xì)胞靶向配體如糖基化分子、多肽、蛋白質(zhì)和抗體等均可修飾納米載體，用于細(xì)胞的靶向基因傳輸[13-15]。T淋巴細(xì)胞對(duì)病毒載體及非病毒載體的基因改造均不敏感，T細(xì)胞表面特異性高表達(dá)CD3分子。Chen等[16]利用CD3單鏈抗體修飾PEG-g-PEI，合成具有靶向基因傳輸功能的納米載體scAbCD3-PEG-g-PEI，采用scAbCD3-PEG-g-PEI為載體靶向轉(zhuǎn)染CD3+小鼠T淋巴細(xì)胞，所得轉(zhuǎn)染率為非靶向載體PEG-g-PEI的16倍。因此，本研究旨在構(gòu)建靶向載體，對(duì)hBMSCs進(jìn)行靶向基因轉(zhuǎn)染，以提高轉(zhuǎn)染效率。

雖然hBMSCs表達(dá)多種表面分子，但特異性地高效識(shí)別早期hBMSCs仍較困難。近年來，新的表面分子二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂GD2備受關(guān)注[17-18]，無論是新分離的還是體外培養(yǎng)的hBMSCs均可持續(xù)表達(dá)GD2，且是骨髓細(xì)胞中唯一表達(dá)該分子的細(xì)胞。GD2是一種含唾液酸的鞘糖脂分子，廣泛分布于hBMSCs細(xì)胞膜外層，Martinez等[17]利用GD2抗體免疫磁珠分選從骨髓細(xì)胞中高效獲取hBMSCs，免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR的結(jié)果均顯示hBMSCs高表達(dá)GD2。因此，GD2可作為特異性識(shí)別hBMSCs的表面標(biāo)志物。

圖8 hBMSCs的MR顯像標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度

本研究以GD2為靶點(diǎn)，成功制備了靶向納米基因載體scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION。將GD2雙鏈抗體打開成為單鏈抗體scAbGD2，有利于減小納米載體的粒徑，同時(shí)可保留特異性結(jié)合GD2的能力。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，scAbGD2的存在并不影響scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION復(fù)合外源性DNA的能力，也不增加scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION的細(xì)胞毒性。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION復(fù)合外源性報(bào)告基因pDNA(pEGFP)后可形成穩(wěn)定的納米復(fù)合物scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA粒徑大小及表面電位適中，細(xì)胞毒性較小，hBMSCs的轉(zhuǎn)染率最高為(59.60±4.50)%，明顯高于非靶向組和對(duì)照組的轉(zhuǎn)染率。

為驗(yàn)證scAbGD2靶向轉(zhuǎn)染的特異性，本研究進(jìn)行了抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)、同型抗體實(shí)驗(yàn)、激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)及普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均發(fā)現(xiàn)因scAbGD2與hBMSCs表面的GD2特異性結(jié)合，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA組增加了細(xì)胞對(duì)靶向納米復(fù)合物的攝入，進(jìn)而提高其轉(zhuǎn)染率，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的增加，以及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)SPION顆粒的增多。scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION同樣具有良好的標(biāo)記hBMSCs進(jìn)行MR顯像的能力。由于scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION具有靶向性，因此有可能將scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION作為磁性探針，對(duì)移植的GD2陽(yáng)性的hBMSCs進(jìn)行實(shí)時(shí)活體MR示蹤顯像。

總之，scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION是一種MRI可視的，可有效轉(zhuǎn)染hBMSCs的靶向納米基因載體。

(致謝：感謝中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞中心贈(zèng)予人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞！)

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《中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》增刊征稿啟事

《中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》雜志于1985年創(chuàng)刊，是由中國(guó)科學(xué)院主管，中國(guó)科學(xué)院聲學(xué)研究所主辦的國(guó)家級(jí)學(xué)術(shù)期刊。本刊是中國(guó)科技核心期刊、《中文核心期刊要目總覽》收錄期刊、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)核心期刊，刊號(hào)ISSN 1003-3289，CN 11-1881/R。2017年度《中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》增刊擬定于2017年12月出版，現(xiàn)將有關(guān)事項(xiàng)通知如下：

1增刊稿件內(nèi)容放射、超聲、核醫(yī)學(xué)、內(nèi)鏡、介入治療、醫(yī)學(xué)物理與工程學(xué)等方面的論文。

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《中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)》期刊社

2017年7月20日

Targetednano-vectorforgenedeliveryintohumanbonemarrowmesenchymalstemcellsandcellularMRimaginginvitro

PANGPengfei1,LIBing2,MAOJunjie1,ZHOUBin1,HUXiaojun1,ZHANGYongyu1,AOFeng1,SHANHong1*
(1.InterventionalMedicineCenter, 2.DepartmentofOphthalmology,theFifthAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China)

ObjectiveTo explore the feasibility and efficacy of an MRI-visible, targeted, nano-vector which is synthesized by attaching a targeting ligand, the GD2 single chain antibody (scAb GD2), to the distal ends of PEG-g-PEI-SPION as a carrier for gene delivery into human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMSCs) and in vitro cellular MR imaging.MethodsscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was synthesized as previously reported. Gel electrophoresis was performed to assess the pDNA condensation ability of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION. The particle size and Zeta potential of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA nanocomplexes were observed by dynamic light scattering. Cytotoxicity of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was evaluated by CCK-8 assay using hBMSCs. Gene transfection efficiency of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION in hBMSCs was quantified by flow cytometry, PEG-g-PEI-SPION, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION+free AbGD2 and scAbIgG2a-PEG-g-PEI-SPION group was established. The cellular internalization of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA nanocomplexes was observed by confocal laser scanning microscopy and Prussian blue staining. MRI of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION was performed by cellular MRI scanning in vitro.ResultsscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION condensed pDNA to form stable nanocomplexes of 80—100 nm in diameter and showed low cytotoxicity to hBMSCs. At the same N/P ratio, the transfection efficiency of scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION group was significantly higher than those of other groups (P<0.001). At the optimal N/P ratio of 20, scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION/pDNA obtained the highest transfection efficiency of (59.60±4.50)% in hBMSCs. Furthermore, hBMSCs labeled with scAbGD2-PEG-g-PEI-SPION showed sensitive low signal intensity on MRI T2/T2*-weighted images in vitro.ConclusionscAbGD2-PEG-g-PEI-SPION is an efficient MRI-visible targeted nano-vector for gene delivery into hBMSCs.

Bone marrow; Mesenchymal stromal cell; Magnetic resonance imaging; Targeted gene vector; Nanomedicine

10.13929/j.1003-3289.201612120

R445.2

A

1003-3289(2017)10-1463-07

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81501561)、廣東省自然科學(xué)基金(2014A030310043、2017A030313873)。

龐鵬飛(1980—)，男，河南沈丘人，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：分子影像學(xué)。E-mail: pflb@sina.com

單鴻，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院介入醫(yī)學(xué)中心，519000。E-mail: Shanhong@mail.sysu.edu.cn

2016-12-30

2017-07-27