幾種天然培養(yǎng)料對(duì)羊肚菌（Morchella Mel-21）菌絲生長(zhǎng)影響研究

謝敬宜，張 能，趙 苗，王 銀，賀新生

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

幾種天然培養(yǎng)料對(duì)羊肚菌（Morchella Mel-21）菌絲生長(zhǎng)影響研究

謝敬宜，張 能，趙 苗，王 銀，賀新生*

（西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

羊肚菌是具有較高食（藥）用價(jià)值和市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類食用菌。以不同梯度的5種天然培養(yǎng)料單因素作用于1種羊肚菌，研究不同培養(yǎng)料對(duì)羊肚菌（Morchella sp.）菌絲生長(zhǎng)情況的影響。采用平板培養(yǎng)法，測(cè)量菌落生長(zhǎng)長(zhǎng)度，以多因素分析法分析不同添加量之間的顯著關(guān)系，得到菌絲生長(zhǎng)的最佳配料和添加量。羊肚菌菌絲均可在各培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其中在添加10 g·L-1木屑的培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最佳，添加100 g·L-1松針的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最緩慢，表現(xiàn)出明顯的抑制作用。本研究對(duì)于優(yōu)化羊肚菌培養(yǎng)條件，指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)具有重要的意義。

羊肚菌屬；天然成分；培養(yǎng)基；方差分析；多重比較

羊肚菌是十分名貴且珍稀的真菌，具有十分重要的藥用和食用價(jià)值[1]。羊肚菌屬（Morchella） 屬于子囊菌門（Ascomycota） 盤菌亞門（Pezizomycotina）盤菌綱（Pezizomycetes） 盤菌亞綱（Pezizomycetidae）盤菌目（Pezizales） 羊肚菌科（Morchellaceae）[2]。羊肚菌含有豐富的氨基酸及其他營(yíng)養(yǎng)元素，尤其是對(duì)于人體非常重要的必須氨基酸，如色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸[3]，其性平，味甘寒，具有益腸胃、化痰理氣等功效，是出口創(chuàng)匯的主要土特產(chǎn)品之一[4]。有關(guān)羊肚菌的研究始于1905年，之后各國(guó)從業(yè)人員不斷研究羊肚菌的栽培技術(shù)，我國(guó)羊肚菌人工栽培相關(guān)專利出現(xiàn)于1989年，此后大量的菌物界專家與從業(yè)人員斷完善相關(guān)技術(shù)[5]。張玲、賀新生等[6]對(duì)羊肚菌菌絲體的培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索，找到1種有效的液體靜置培養(yǎng)方法。陳惠群[7-8]持續(xù)觀測(cè)野生羊肚菌子實(shí)體形成的生長(zhǎng)條件，為人工栽培羊肚菌提供了較為明確的參照依據(jù)。此后經(jīng)過進(jìn)一步完善，人工栽培的羊肚菌開始在市場(chǎng)上占據(jù)一定份額，但是目前市場(chǎng)供需仍存在不足，因此，進(jìn)一步提高產(chǎn)量成為廣大種植者追求的目標(biāo)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)科研人員加緊了對(duì)羊肚菌人工栽培技術(shù)的研究，多地時(shí)有羊肚菌人工栽培成功的報(bào)道。2012年孟俊龍等[9]對(duì)小羊肚菌人工栽培進(jìn)行了研究，篩選出最佳母種和原種培養(yǎng)基，成功栽培出羊肚菌子實(shí)體。劉松青等[10]將水稻、小麥、大豆等7種秸稈用于羊肚菌人工栽培試驗(yàn)。2013年在四川什邡市和甘孜州康定縣開展的羊肚菌人工栽培試驗(yàn)都取得了明顯成效[11]。目前，我國(guó)羊肚菌栽培已經(jīng)取得較大進(jìn)展，但大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化栽培仍然沒有實(shí)現(xiàn)，因而天然培養(yǎng)料對(duì)羊肚菌菌絲生長(zhǎng)影響的研究對(duì)于完善栽培過程有一定的借鑒意義。

本研究利用龍門山區(qū)廣泛分布的物種羊肚菌Mel-21，研究5種天然培養(yǎng)料對(duì)其菌絲生長(zhǎng)的影響，以期為研究羊肚菌生理特性、進(jìn)一步優(yōu)化栽培條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

羊肚菌（Morchella sp.）野生標(biāo)本采自廣元市朝天區(qū)花石鎮(zhèn)，分子系統(tǒng)學(xué)鑒定為羊肚菌屬黑色類群中的物種：Mel-21。組織分離、純化得到純菌種。

1.2 試劑與材料

蔗糖、蛋白胨、瓊脂、新鮮土豆、松針、細(xì)木屑、棉籽殼、麩皮、酒精等。

1.3 儀器設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、接種針、酒精燈、培養(yǎng)皿、250 mL錐形瓶、燒杯、玻璃棒、試管、尺子、電子天平、電磁爐。

1.4 培養(yǎng)基配制

蔗糖10 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g，水1 L。

固體瓊脂培養(yǎng)基共5組，天然培養(yǎng)料分別為麩皮、細(xì)木屑、棉籽殼、土豆和松針。以1 L計(jì)算，分別取 10 g·L-1、25 g·L-1、50 g·L-1、75 g·L-1、100 g·L-1，加入水1 L，煮沸后用6層紗布過濾取濾液，再加入蔗糖10 g、蛋白胨1 g、瓊脂20 g，完全溶解后定容至1 L，滅菌后倒平板備用。

1.5 試驗(yàn)方法

選取已培養(yǎng)好的斜面菌種，接種于直徑9 cm的PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d～4 d，然后在超凈工作臺(tái)上挑取約3 mm大小帶菌絲的培養(yǎng)基，分別接種到5種不同梯度的固體培養(yǎng)基平板上，每個(gè)梯度重復(fù)3次，置于25℃下培養(yǎng)，每隔24 h，觀察并記錄菌絲長(zhǎng)勢(shì)和菌絲長(zhǎng)度，當(dāng)菌絲體培養(yǎng)4 d（96 h）時(shí)，以菌絲將近長(zhǎng)滿而未長(zhǎng)滿平皿時(shí)作為測(cè)量終點(diǎn)。以接種塊為中心用刻度尺測(cè)量菌落直徑（cm），隨機(jī)測(cè)量3次，取平均值，最后取3個(gè)重復(fù)的平均值作為菌絲生長(zhǎng)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 麩皮用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

為探究麩皮用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行麩皮用量梯度試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 麩皮用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.1 Effect of wheat bran content on mycelium growth rate

從圖1中可以看出，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間在0～24 h時(shí)，加入麩皮對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用，且麩皮用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的差異性體現(xiàn)并不明顯。培養(yǎng)時(shí)間約36 h時(shí)，加入麩皮10 g·L-1、25 g·L-1的試驗(yàn)組，菌絲生長(zhǎng)速度超過不加入麩皮的空白對(duì)照組，且10 g·L-1麩皮的培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好。但是若繼續(xù)提高麩皮的加入量，菌絲的生長(zhǎng)受到明顯抑制，表明添加較少的麩皮對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，隨著麩皮用量的增加，反而會(huì)明顯抑制菌絲生長(zhǎng)。

為進(jìn)一步探明麩皮加入量與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲生長(zhǎng)是否存在顯著影響，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果詳見表1、表2。

表1 麩皮用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析Tab.1 Variance analysis of the effect of wheat bran dosage on mycelium growth rate

表2 麩皮不同用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的多重比較結(jié)果Tab.2 Multiple comparative results of the effect of wheat bran dosage on mycelium growth rate

方差分析表明，麩皮加入量對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響極顯著。所以，對(duì)不同麩皮用量的菌絲生長(zhǎng)情況進(jìn)行多重比較，進(jìn)一步也證明菌絲在加入10 g·L-1和25 g·L-1麩皮條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)較好，但加入25 g·L-1麩皮的條件下與不加入麩皮條件下的菌絲長(zhǎng)勢(shì)相比無(wú)顯著差異。

2.2 木屑用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

為探究木屑用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行木屑用量梯度試驗(yàn)，結(jié)果見圖2。

圖2 木屑用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.2 Effect of sawdust content on mycelium growth rate

從圖2中可以看出，添加一定量的木屑可以有效地促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，但是不同添加量之間的促進(jìn)作用體現(xiàn)并不明顯。為進(jìn)一步確定不同木屑加入量是否對(duì)菌絲生長(zhǎng)存在顯著影響，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了方差分析和多重比較，結(jié)果見表3、表4。

表3 木屑用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析Tab.3 Variance analysis of the effect of sawdust dosage on mycelium growth rate

表4 木屑不同用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的多重比較結(jié)果Tab.4 Multiple comparative results of the effect of sawdust dosage on mycelium growth

方差分析表明，木屑加入量雖對(duì)菌絲的生長(zhǎng)構(gòu)成顯著影響，但不構(gòu)成極顯著影響。對(duì)木屑不同用量的菌絲生長(zhǎng)結(jié)果進(jìn)行多重比較表明，木屑不同用量間對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響沒有明顯差別。說明木屑的添加對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，這與秦小波等[12]對(duì)梯棱羊肚菌菌絲生長(zhǎng)條件的探究結(jié)果得出的結(jié)論一致，但木屑用量的多少對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不大。

2.3 棉籽殼用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

為探究棉籽殼用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行棉籽殼用量梯度試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 棉籽殼用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.3 Effect of cottonseed hull content on mycelium growth rate

從圖3中可以看出，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，雖然生長(zhǎng)情況有所波動(dòng)，但也可以看出，加入25 g·L-1及以上用量棉籽殼抑制菌絲的生長(zhǎng)。而棉籽殼用量10 g·L-1對(duì)于菌絲的生長(zhǎng)卻表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用。以上說明適量棉籽殼的加入對(duì)菌絲的生長(zhǎng)具有促進(jìn)效果。

為進(jìn)一步探明棉籽殼用量與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌絲生長(zhǎng)是否存在顯著影響，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果詳見表5、表6。

表5 棉籽殼用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析結(jié)果Tab.5 Variance analysis of the effect of cottonseed hull dosage on mycelium growth rate

表6 棉籽殼用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響的多重比較結(jié)果Tab.6 Multiple comparative results of the effect of cottonseed hull dosage on mycelium growth

方差分析結(jié)果顯示，加入棉籽殼對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生極顯著的影響。多重比較結(jié)果表明，棉籽殼不同用量條件下菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)存在差異，當(dāng)用量為10 g·L-1時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)情況最優(yōu)。其他用量雖然對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但是抑制效果并不顯著。

2.4 土豆用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

為探究土豆用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行土豆用量梯度試驗(yàn)，結(jié)果見圖4。

圖4 土豆用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Effect of potato content on mycelium growth rate

從圖4可以看出，不論土豆用量為多少，菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)和不添加土豆的條件下相比，都表現(xiàn)為抑制生長(zhǎng)。并且，抑制的程度與添加土豆的量大致呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。為進(jìn)一步探明不同土豆用量所產(chǎn)生抑制效果的顯著性，進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果見表7、表8。

表7 土豆用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析結(jié)果Tab.7 Variance analysis of the effect of potato dosage on mycelium growth rate

方差分析結(jié)果顯示，土豆的添加對(duì)菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)有著極顯著的影響。多重比較發(fā)現(xiàn)，加入土豆后對(duì)菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯抑制作用，但不同用量造成的抑制效果差別較小。

表8 土豆用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的多重比較結(jié)果Tab.8 Multiple comparative results of the effect of potato dosage on mycelium growth

2.5 松針用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

為探究松針用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，進(jìn)行松針用量梯度試驗(yàn)，結(jié)果見圖5。

圖5 松針用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.5 Effect of pine needles content on mycelium growth rate

從圖5中可以看出，松針的加入同樣對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生了明顯的抑制作用。培養(yǎng)時(shí)間在24 h內(nèi)時(shí)，不同用量對(duì)菌絲產(chǎn)生的抑制作用無(wú)明顯差異；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過24 h，添加10 g·L-1松針的抑制作用較其他用量明顯減弱。對(duì)加入松針條件下的菌絲生長(zhǎng)結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果見表9、表10。

表9 松針用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析Tab.9 Variance analysis of the effect of pine needles dosage onmycelium growth rate

表10 松針用量對(duì)菌絲生長(zhǎng)的多重比較結(jié)果Tab.10 Multiple comparative results of the effect of pine needles dosage on mycelium growth

方差分析表明加入松針確實(shí)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生極顯著的影響，多重比較的結(jié)果說明加入松針的量為10 g·L-1時(shí)，所產(chǎn)生的抑制效果要弱于其他較大的用量，繼續(xù)增加松針的用量，抑制作用變化不大。陳惠群等[13]的研究結(jié)果顯示，對(duì)于尖頂羊肚菌，松針的添加可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)結(jié)果不一致可能是用于試驗(yàn)的羊肚菌品種不同所致。

2.6 同時(shí)間點(diǎn)不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響

選取各培養(yǎng)基培養(yǎng)96 h的菌絲生長(zhǎng)量，比較不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見圖6。

總體而言，培養(yǎng)基中加入木屑對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，而且木屑的不同用量所產(chǎn)生的效果相同，少量加入即可得到良好的效果。麩皮與棉籽殼產(chǎn)生的效果相近，麩皮的用量為10 g·L-1和25 g·L-1時(shí)可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，更高的用量將會(huì)起到抑制作用；棉籽殼在用量為10 g·L-1時(shí)可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，25 g·L-1及以上的用量將會(huì)抑制其生長(zhǎng)。因此，麩皮與棉籽殼的添加應(yīng)注意用量。土豆與松針的加入均會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)，不適合作為菌絲培養(yǎng)料。對(duì)不同培養(yǎng)基的菌絲生長(zhǎng)結(jié)果進(jìn)行了方差分析和多重比較，見表11、表12。

圖6 不同培養(yǎng)料對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of different culture materials on mycelium growth

表11 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度影響的方差分析結(jié)果Tab.11 Variance analysis of the effect of different culture materials on mycelium growth rate

表12 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的多重比較結(jié)果Tab.12 Multiple comparative results of the effect of different culture materials on mycelium growth

由表11可以得出，培養(yǎng)料用量與種類均會(huì)對(duì)菌絲生長(zhǎng)產(chǎn)生極顯著的影響，而培養(yǎng)料種類的影響程度更大。因此，不同的培養(yǎng)料種類對(duì)菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)的影響進(jìn)行多重比較，添加木屑時(shí)，菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)與其他條件下相比有明顯差別，而松針的抑制效果也十分顯著。

3 結(jié)論

本研究中選取的5種天然培養(yǎng)料均會(huì)對(duì)羊肚菌Mel-21菌絲生長(zhǎng)造成顯著影響，其中以添加木屑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，木屑用量的多少對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響并不顯著，因此實(shí)際應(yīng)用中若需要添加木屑，比例選取10 g·L-1即可。少量的麩皮與棉籽殼對(duì)菌絲的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用，但是實(shí)際應(yīng)用應(yīng)注意用量，麩皮用量為10 g·L-1時(shí)效果較好，超過25 g·L-1后將抑制菌絲生長(zhǎng)，而棉籽殼用量也以10 g·L-1為好，達(dá)到25 g·L-1時(shí)已經(jīng)有明顯的抑制菌絲生長(zhǎng)作用。土豆與松針的添加都會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)，因此在實(shí)際培養(yǎng)時(shí)最好不予采用。

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Study on the Effect of Several Natural Culture Materials on the Mycelium Growth of Morchella Mel-21

XIE Jing-yi,ZHANG Neng,ZHAO Miao,WANG Yin,HE Xin-sheng
(School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China)

Morchell is a kind of edible fungi with high medicinal and market economy value.The effects of five natural culture materials with different concentrations on mycelial growth of one Morchella strain by single factor were studied.The colony growth length of Morchella was measured by plate culture method.The significant relationship between different addition amounts was analyzed by multi-factor analysis method to obtain the optimum ingredients and amount for the mycelium growth.In this research,the mycelium could grow on each culture medium,and the growth was best on the medium supplemented with 10 g·L-1sawdust.The mycelium growth in medium with 100 g·L-1pine needles was the slowest,which showed obvious inhibitory effect.The research is of great significance to optimize the culture conditions of Morchella and to guide practical production.

Morchella;natural materials;medium;variance analysis;multiple comparisons

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0031-06

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.008

謝敬宜（1992-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)槭秤镁耘嘌芯?。E-mail:528999098@qq.com

*通信作者：賀新生（1965-），男，本科，教授，主要從事大型真菌分類及栽培研究。E-mail:hexinsheng@swust.edu.cn

2017-07-20