白花蛇舌草總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

張俊霞　王應(yīng)玲　姜寧

摘要：研究白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）總黃酮的提取工藝及其體外抗氧化活性。以白花蛇舌草總黃酮提取率為評(píng)價(jià)參數(shù)，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝；測定了總還原力及Fe2+螯合力、羥自由基和超氧陰離子清除能力研究白花蛇舌草總黃酮的抗氧化活性。結(jié)果表明，用95%乙醇與白花蛇舌草粉末按40∶1（mL∶g），在90 ℃下提取180 min，此時(shí)提取率最高，達(dá)（2.22±0.01）%。體外抗氧化活性結(jié)果顯示白花蛇舌草總黃酮具有較強(qiáng)的總還原力，F(xiàn)e2+螯合率最高為90%，羥自由基和超氧陰離子的清除率分別達(dá)79%、77%。白花蛇舌草總黃酮具有顯著的體外抗氧化活性，具有進(jìn)一步開發(fā)利用的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）；總黃酮；正交試驗(yàn)；體外抗氧化

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3523-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.033

Abstract： This study was to optimize the conditions of extraction of total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd and detect their antioxidant activities in vitro. Using extraction rate as the evaluation index，single factor experiments and orthogonal test were adopted to optimze the extraction process. Then，four antioxidant parameters of total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd，including total reducing power，F(xiàn)e2+ chelating，hydroxy radical scavenging，and superoxide anion radical scavenging capacities，were measured. The results showed that the optimum conditions of extraction were as following：ethanol concentration was 95%，the ratio of liquid to solid was 40∶1（mL∶g）； extraction time 180 min and temperature，90 ℃. Under these conditions，the extrction ratio was（2.22±0.01）%. The total flavonoids from Hedyotis diffusa Willd had showed high total reducing power，their chelating rate of Fe2+ reached 90%，the radical scavenging activities against hydroxyl radical and superoxide anion were 79% and 77%，respectively. So the antioxidant activities in vitro of flavonoids from Hedyotis diffusa Willd is obvious，which is worth further being developed and utilized.

Key words： Hedyotis diffusa Willd； total flavonoids； orthogonal test； antioxidant activities

白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）屬于茜草科耳草屬，全草含三萜類、環(huán)烯醚萜、蒽酮類、黃酮類化合物、有機(jī)酸及酯類等化合物[1，2]，具有抗腫瘤、抗炎、提高免疫力、抗氧化、抗化學(xué)誘變、保護(hù)胃黏膜損傷等作用[3-12]。

黃酮類化合物是大多數(shù)植物的次生代謝產(chǎn)物，分布廣泛，是一種新發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)元素，對人體具有重要的生理保健功效[13，14]。黃酮類化合物具有多種生理活性且對人體的不良反應(yīng)較少，是一種對人類健康有促進(jìn)作用的化合物。臨床上常用于治療心血管疾病、糖尿病、腫瘤等[15-20]。目前，關(guān)于如何高效獲得白花蛇舌草總黃酮及其抗氧化作用的報(bào)道較少。本試驗(yàn)就乙醇浸提法研究白花蛇舌草總黃酮提取工藝，以4個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，為白花蛇舌草活性成分的進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白花蛇舌草購于來鳳縣地產(chǎn)中藥材綜合開發(fā)有限責(zé)任公司，經(jīng)60 ℃烘干粉碎，過60目篩；抗壞血酸、EDTA-Na2、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、焦性沒食子酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、水楊酸等試劑購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；亞硝酸鈉、氫氧化鈉片、無水乙醇、硝酸鋁、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞鐵等試劑購自天津市福晨化學(xué)試劑廠；菲咯嗪購自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社，以上藥品均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9140 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），ITDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠制造），TU-1810型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），BC-R501C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海貝凱生物化工設(shè)備有限責(zé)任公司）。endprint

1.3 方法

1.3.1 總黃酮含量測定 參照2015版《中華人民共和國藥典》[21]采用NaNO2-Al（NO3）3法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度c（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得回歸方程：y=9.809 6x+0.000 9，R2=0.999 2。按如下公式計(jì)算總黃酮含量：

總黃酮含量=■×100%

式中，c為樣品溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）、A為稀釋倍數(shù)、V為提取液體積（mL）、m為白花蛇舌草質(zhì)量（mg）。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1）液固比對總黃酮提取率的影響。稱取適量的白花蛇舌草粉末，分別按液固比10∶1、20∶1、30∶1、 40∶1、50∶1（mL∶g，下同）加入70%乙醇于80 ℃水浴120 min，然后將提取液于3 500 r/min離心15 min，測定上清液中總黃酮含量。

2）提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響。稱取適量白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1加入70%乙醇于80 ℃水浴鍋中水浴，水浴時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 min。3 500 r/min離心15 min，測定上清液中總黃酮含量。

3）提取溫度對總黃酮提取率的影響。稱取適量白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1加入70%乙醇分別于50、60、70、80、90 ℃水浴120 min。相同條件下將提取液離心后測定上清液中總黃酮含量。

4）乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。稱取適量的白花蛇舌草粉末，按液固比20∶1分別加入60%、70%、80%、90%、95%的乙醇于80 ℃水浴120 min，然后提取液離心，測定上清液中總黃酮含量。

1.3.3 正交試驗(yàn) 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了4因素3水平正交試驗(yàn)L9（34），因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

1.4 白花蛇舌草總黃酮抗氧化活性測定

1.4.1 總還原力的測定 總還原力的測定參照Oyaizu等[22]的方法。以抗壞血酸為陽性對照，比較相同濃度下白花蛇舌草總黃酮和抗壞血酸還原力的強(qiáng)弱。吸光度越大，表示總還原力越強(qiáng)。

1.4.2 鐵離子螯合力的測定 Fe2+螯合力的測定參照Fan等[23]的研究方法。以EDTA-Na2為對照，比較濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL時(shí)白花蛇舌草總黃酮和EDTA-Na2螯合金屬離子能力的強(qiáng)弱，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。鐵離子螯合率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，其中，A0、A1、A2分別為不加樣品溶液體系，加樣品和菲咯嗪溶液體系，加樣品和不加菲咯嗪溶液體系的吸光度。

1.4.3 羥自由基清除力的測定 通過水楊酸鈉法[24]測定羥自由基清除力。以抗壞血酸為陽性對照，設(shè)置不加水楊酸鈉的體系為陰性對照，測定反應(yīng)液在510 nm的吸光度，并將結(jié)果用羥自由基清除能力表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。羥自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，式中，A0、A1、A2分別為不加樣品溶液體系，加樣品和水楊酸鈉溶液體系，陰性對照的吸光度。

1.4.4 超氧陰離子清除力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[25]，以抗壞血酸作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，利用濃鹽酸終止反應(yīng)，比較白花蛇舌草總黃酮和抗壞血酸抑制超氧陰離子生成的能力，結(jié)果用超氧陰離子清除率表示，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。超氧陰離子清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%，其中，A0、A1、A2分別為不加樣品溶液體系，加樣品和鄰苯三酚溶液體系，加樣品和稀鹽酸體系的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Origin 8.0進(jìn)行單因素和體外抗氧化數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Standard deviation，SD）表示，組間多重比較采用Tukey法；正交試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花蛇舌草總黃酮干物質(zhì)組分分析

白花蛇舌草浸膏真空干燥后為即為其總黃酮粗品，粗品總黃酮含量可達(dá)96.2%，為粗品的主要成分。因此，總黃酮為白花蛇舌草體外抗氧化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 白花蛇舌草總黃酮提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 液固比對白花蛇舌草總黃酮提取率有一定的影響，在一定范圍內(nèi)，增大液固比能提高白花蛇舌草總黃酮的提取率，當(dāng)液固比達(dá)到40∶1時(shí)，總黃酮提取率不再顯著提高（圖1A）。圖1B顯示，提取時(shí)間較短時(shí)白花蛇舌草總黃酮提取率呈增加狀態(tài)，但變化并不顯著，當(dāng)水浴時(shí)間達(dá)到150 min時(shí)提取率顯著上升，隨后有下降趨勢。高溫能促進(jìn)白花蛇舌草總黃酮的溶出。從圖1C可以看出，在適當(dāng)?shù)臏囟确秶鷥?nèi)升高溫度總黃酮提取率顯著提高，超過該溫度后提取率變化不明顯。圖1D表明乙醇濃度升高能促進(jìn)白花蛇舌草總黃酮溶出，且作用顯著，在乙醇濃度達(dá)到90%后作用效能減弱。因此，以液固比30∶1、40∶1、50∶1，水浴時(shí)間120、150、180 min，水浴溫度70、80、90 ℃，乙醇濃度80%、90%、95%為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。

2.2.2 乙醇浸提白花蛇舌草總黃酮的結(jié)果 正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，最優(yōu)工藝為A2B3C3D3，即用95%的乙醇以40∶1的液固比在90 ℃下提取180 min。表3為正交試驗(yàn)方差分析，浸提溫度和溶劑濃度對產(chǎn)物溶出率的影響，均為顯著（P<0.05），而提取溶劑加入的比例和浸提時(shí)間對總黃酮的溶出作用并不明顯。比較F值可知，試驗(yàn)因素的主次順序與極差分析一致。對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，總黃酮的提取率可達(dá)（2.22±0.01）%。

2.3 白花蛇舌草總黃酮體外抗氧化活性

2.3.1 總還原力測定 白花蛇舌草總黃酮的總還原力在一定濃度范圍內(nèi)逐漸增大，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，總還原力達(dá)到最大，不再上升。比較VC和白花蛇舌草總黃酮的總還原力發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下的作用效果，低濃度時(shí)白花蛇舌草總黃酮的總還原力較VC弱，隨著溶液濃度的升高，白花蛇舌草總黃酮的總還原力上升幅度大于VC，并超過VC的總還原力，二者濃度在1.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大（圖2）。endprint

2.3.2 鐵離子螯合力的測定 白花蛇舌草總黃酮具有較強(qiáng)的鐵離子螯合力。由圖3可以得知，EDTA-Na2和白花蛇舌草總黃酮對鐵離子螯合率均具有劑量依賴性。低濃度時(shí)，鐵離子螯合率隨著濃度增大而增幅較快，其后隨著溶液濃度的增大，螯合率的變化逐漸減小直至極值。低濃度的白花蛇舌草總黃酮對鐵離子的螯合能力大于相同濃度EDTA-Na2的螯合能力；當(dāng)濃度超過1.0 mg/mL后，EDTA-Na2的螯合能力略大于白花蛇舌草總黃酮的鐵離子螯合力。

2.3.3 羥自由基清除力的測定 白花蛇舌草總黃酮對羥自由基有明顯的清除作用，但該作用較同濃度VC弱。VC和白花蛇舌草總黃酮對羥自由基的清除效率隨濃度的升高作用越來越大，直至濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)VC對該自由基的清除作用達(dá)到最大，為99%，此時(shí)白花蛇舌草總黃酮的清除效率為80%；當(dāng)白花蛇舌草總黃酮的濃度大于1.0 mg/mL時(shí)其對羥自由基的清除能力變化不再明顯，相同濃度相同條件下VC對羥自由基的清率始終大于白花蛇舌草總黃酮（圖4）。

2.3.4 超氧陰離子清除力的測定 白花蛇舌草總黃酮具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的作用，白花蛇舌草黃總酮的超氧陰離子清除能力在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。比較VC與白花蛇舌草黃總酮二者的超氧陰離子清除能力，發(fā)現(xiàn)高濃度的VC對超氧陰離子的清除率接近100%，而白花蛇舌草總黃酮對超氧陰離子的清除率在達(dá)到70%后不再增大（圖5）。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了影響溶液浸提法的4個(gè)因素——液固比、提取時(shí)間、提取溫度及乙醇濃度對白花蛇舌草總黃酮溶出率的影響。結(jié)果表明，用95%乙醇與白花蛇舌草粉末按40∶1，在90 ℃下提取180 min，總黃酮提取率可達(dá)（2.22±0.01）%。白花蛇舌草總黃酮具有較強(qiáng)的總還原力和Fe2+螯合力，對羥自由基和超氧陰離子自由基有較強(qiáng)的清除能力。白花蛇舌草總黃酮潛在的抗氧化活性有望使其開發(fā)為新的抗氧劑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張 軻.白花蛇舌草化學(xué)成分研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2016.

[2] 馬 河，李方麗，王 芳，等.白花蛇舌草化學(xué)成分研究[J].中藥材，2016，39（1）：98-102.

[3] 李方麗.白花蛇舌草化學(xué)成分及其體外抗腫瘤活性研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[4] 紀(jì)寶玉，范崇慶，裴莉昕，等.白花蛇舌草的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（19）：235-240.

[5] 毛 宇，徐 芳，徐小娟，等.白花蛇舌草抗腫瘤成分及其作用機(jī)理研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2015，42（17）：3128-3132.

[6] 李文婷，戴紫函，程海波，等.白花蛇舌草活性成分及其協(xié)同抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2015，17（3）：670-674.

[7] 肖 云，伍治平，金從國，等.白花蛇舌草提取物抗小鼠結(jié)直腸癌血管生成的實(shí)驗(yàn)研究[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（10）：53-57.

[8] 文雪梅，陳 瑛，李 婷，等.白花蛇舌草對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡及Ki-67表達(dá)的影響[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（3）：561-563.

[9] 吳逢選，周郁鴻，葉寶東.白花蛇舌草抗腫瘤機(jī)制研究進(jìn)展及其在血液病中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015（1）：167-169.

[10] 楊真真，姜夢麗，賴宏強(qiáng)，等.白花蛇舌草抗炎作用及優(yōu)選組分處方[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，24（3）：49-51.

[11] 王洪鴿，湯 承，王 航，等.白花蛇舌草多糖對小鼠免疫功能和生長發(fā)育的影響[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（10）：140-143.

[12] 樸紅梅，宋秋紅，金延燕，等.白花蛇舌草對哮喘模型小鼠Th1/Th2免疫平衡的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33（17）：1381-1385.

[13] 劉星雨，周 敏，孫體健.天然黃酮類化合物的藥理活性及分離提取[J].中國藥物與臨床，2014，14（5）：621-624.

[14] 胡云霞，樊金玲，武 濤.黃酮類化合物分類和生物活性機(jī)理[J].棗莊學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，31（2）：72-78.

[15] 張懷民，楊 虹，鄭海洲.天然黃酮類化合物防治心腦血管疾病的研究進(jìn)展[J].中國新藥與臨床雜志，2016（10）：704-708.

[16] 李湘洲，欒芳菲，張 勝，等.黃酮類化合物的抗腫瘤和抗血管生成作用研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2016（1）：199-201，206.

[17] 孫曉潤，陳蘋蘋，林 悅，等.天然黃酮類化合物抗腫瘤作用靶點(diǎn)研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（6）：218-228.

[18] 李 丹，彭 成，謝曉芳.黃酮類化合物治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（11）：239-242.

[19] 董麗紅，張瑞芬，蘇東曉，等.食源性黃酮類化合物改善脂質(zhì)代謝作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2016， 38（1）：81-90.

[20] 徐學(xué)君，張秀芳，徐德琴，等.黃酮類化合物調(diào)節(jié)血脂作用的研究進(jìn)展[J].中國藥房，2016，27（1）：114-117.

[21] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（2015版）一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[22] OYAIZU，M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J].The Janpanese Journal of nutrition，1986， 44：307-315.

[23] FAN L P，LI J W，DENG K Q，et al. Effects of drying methods on the antioxidant activities of polysaccharides extracted from Ganoderma lucidum[J].Carbohydrate Polymers，2012，87：1849-1854.

[24] 邰 超，鄒 洪，谷學(xué)新，等.Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基及其清除的電化學(xué)方法測定[J].分析測試學(xué)報(bào)，2002，21（5）：30-32.

[25] SUN C，WANG J W，F(xiàn)ANG L. Free radical scavenging and antioxidant activities of EPS2，an exopolysaccharide produced by a marine filamentous fungus Keissleriella sp.YS 4108[J].Life Sciences，2004，75：1063-1073.endprint