高效木質(zhì)素降解菌株的分離篩選與鑒定

常燕　盧曉鳳　王兆慧

摘要：為提高農(nóng)作物秸稈中木質(zhì)素的降解速度，從腐爛的樹(shù)枝和土壤中篩選出一株高效降解木質(zhì)素的菌株。結(jié)果表明，該菌株18S rDNA序列與二年殘孔菌（Abortiporus biennis）有高度的同源性，結(jié)合其形態(tài)特征，初步鑒定該菌株為二年殘孔菌，命名為H。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)素；同源性；二年殘孔菌（Abortiporus biennis）

中圖分類號(hào)：Q81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3431-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.010

Abstract： In order to increase crop stalk degradation， one strain of ligninase-producing epiphyte was selected from rotten plants and soil. The results showed that 18S rDNA sequence showed high homology with Abortiporus biennis， and in combination withmorphologic character，the strian was determined as A. biennis，named as H.

Key words： lignin； homology； Abortiporus biennis

農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的一種重要的可再生性能源[1]，傳統(tǒng)的方法將其進(jìn)行焚燒或廢棄，不僅浪費(fèi)了資源還污染了環(huán)境。如果將農(nóng)作物秸稈先通過(guò)微生物的作用腐熟再還田，不僅可以改良土壤結(jié)構(gòu)，使土壤物理性狀更加趨于合理化[2-4]，還可以豐富土壤中微生物種群的數(shù)量和結(jié)構(gòu)[5-7]，使農(nóng)作物秸稈還田的意義更重大，也是目前利用秸稈資源最合理、最有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 樣品采集于南通大學(xué)主校區(qū)北側(cè)朽木眾多、空氣潮濕、樹(shù)林茂密且長(zhǎng)年無(wú)人進(jìn)入的地表下2～5 cm的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑盒 富集培養(yǎng)基：硫酸銨2.0 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸二氫鉀1.0 g、氯化鈉0.5 g、木質(zhì)素20 g、定容至1 000 mL，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min。

PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g，去皮，切成小塊煮沸30 min，接著用紗布過(guò)濾，取濾液，加入蔗糖20 g、瓊脂20 g，待融化后補(bǔ)水至1 000 mL，自然pH，121 ℃高壓蒸氣滅菌15 min[8]。

GU-PDA固體培養(yǎng)基：于PDA培養(yǎng)基中加入愈創(chuàng)木酚，使其濃度為0.1%[9]。

真菌DNA基因組抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）。

1.1.3 儀器 電子天平、搖床、冰箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、紅外爐、高壓蒸氣滅菌鍋、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、顯微鏡、離心機(jī)、電泳槽、PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 可降解木質(zhì)素菌株的富集 用電子天平稱取土壤樣品2 g，加入到裝有200 mL的富集培養(yǎng)基中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。

1.2.2 可降解木質(zhì)素菌株的復(fù)篩 取1 mL上述富集培養(yǎng)液，通過(guò)梯度稀釋法將其稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6不同的濃度，分別涂布在GU-PDA固體培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃的隔水式恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3 菌株的純化與保藏 將上述復(fù)篩培養(yǎng)基上顯色圈最大的作為目的菌株，命名為H。通過(guò)劃線法進(jìn)行純化，將純化的目的菌株制成孢子懸液，加入適當(dāng)甘油，置于與-70 ℃超低溫冰箱保藏。

1.2.4 菌株的鑒定

1）菌株形態(tài)觀察。以點(diǎn)接法將目的菌株的孢子接種在PDA平板上，30 ℃培養(yǎng)5 d觀察其菌落的形態(tài)；菌絲體的觀察則采用插片法進(jìn)行觀察[10]。

2）分子鑒定。①菌株基因組的提取。將目的菌株接種于裝有50 mL PDA培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，160 r/min 30 ℃搖床培養(yǎng)5 d；用無(wú)菌紗布過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移到冰凍的無(wú)菌研缽中進(jìn)行研磨破壁；用真菌DNA基因組抽提試劑盒提取該菌株的DNA。②提取基因組的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增采用25 μL體系，其中模板2 μL、Buffer 2.5 μL、上引物ITS1 1 μL、下引物ITS3 1 μL、dNTPs 2 μL、ddH2O 16.4 μL，最后加入Taq酶0.1 μL；PCR條件：95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。③PCR產(chǎn)物的測(cè)序。將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送到南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序。④18S rDNA基因序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。通過(guò)NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)，對(duì)所篩選菌株的18S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，從結(jié)果中獲取相似的11種多孔菌菌株18S rDNA基因序列，利用Mega 4軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

圖1為所篩菌株H在GU-PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后的菌落形態(tài)。由圖1可以看出，該菌在鑒定培養(yǎng)基上有很大的顯色圈，表明該菌能代謝較高的木質(zhì)素酶。菌落較疏松，菌絲乳白色。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的菌絲形態(tài) 插片培養(yǎng)5 d后，在40倍顯微鏡下觀察菌株H菌絲的形態(tài)，無(wú)色透明，壁薄，有簡(jiǎn)單的隔膜（圖2）。

2.2.2 菌株的鑒定 以菌株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增18S rDNA片段，測(cè)序結(jié)果顯示克隆片段長(zhǎng)1 716 bp。將其基因序列用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，依據(jù)同源性檢索結(jié)果，選取不同多孔菌種屬的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，其與二年殘孔菌（Abortiporus biennis）18S rDNA基因序列相似性為100%（圖3）。因而，從分子水平上進(jìn)一步證實(shí)分離菌株H為二年殘孔菌。endprint

3 討論

二年殘孔菌屬屬于真菌界擔(dān)子菌門(mén)多孔菌科，分布于世界各地。本菌屬的菌多數(shù)具有較高的纖維素酶和木質(zhì)素酶降解能力[11]，且該菌常出現(xiàn)在許多種類的闊葉樹(shù)上或地下埋有腐木的地上，是一種能引起木質(zhì)腐朽的真菌，這與本試驗(yàn)的篩菌目的相吻合。此菌株可以作為后續(xù)進(jìn)行秸稈的復(fù)合降解以及與木質(zhì)素降解相關(guān)的實(shí)際應(yīng)用的研究。

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