鏈球菌2型對恩施黑豬致病性的研究

譚仕旦

摘要：為研究豬鏈球菌2型對恩施黑豬的致病性，采用分組試驗法，選取同窩8頭恩施黑豬，隨機分組，試驗組（6頭）注射豬鏈球菌2型菌液進行攻毒試驗，對照組（2頭）正常飼喂，觀察記錄50 h的試驗情況。結果表明，試驗組豬全部發(fā)病，體溫升高、呼吸迫促、敗血癥和神經(jīng)癥狀；剖檢病（處）死豬尸體可見不同程度的腦膜充血淤血、關節(jié)炎、心肌炎、肺淤血、出血性炎癥等病理變化，對照組無異常。證實了豬鏈球菌2型對恩施黑豬有很強的致病性。

關鍵詞：豬鏈球菌2型；恩施黑豬；致病性；攻毒試驗

中圖分類號：S858.28；S855.1+1 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2017）010-0007-02

豬鏈球菌?。⊿wine streptococcosis）是由豬鏈球菌引起豬的一種發(fā)病急、死亡率高的細菌性傳染病，被列入我國動物傳染病中的二類病，人畜共患病，嚴重地威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展和人類食品公共衛(wèi)生安全，引起了人們的高度重視。近年來，依據(jù)鏈球菌莢膜抗原的不同，人們將其分為 35 個血清型（1～34型和1/2 型）[1]。其中豬鏈球菌 2型（Strptococcus suis type 2， 簡稱SS2）被認為是豬鏈球菌 35個血清型中分布最廣致病性最強的一個血清型，人感染后可引起化膿性關節(jié)炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎和中毒性休克綜合癥等[2]。1998年江蘇海安縣暴發(fā)豬鏈球菌病，25人感染，死亡14人；2005年7月四川省資陽市暴發(fā)豬鏈球菌病，并見有人感染而引起死亡的報道[1]。

近年來，因恩施黑豬的肉質(zhì)好，養(yǎng)殖效益高，恩施黑豬養(yǎng)殖量日益增加，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，時常發(fā)生疑似鏈球菌混合感染的病例。為了有效防控黑豬鏈球菌病的發(fā)生，特開展本次試驗。

1 材料與方法

1.1 菌株

豬鏈球菌2型菌株[3]來源于長江大學動物科學院實驗室分離制備的菌液。

1.2 試劑

TSA、TSB購自上海生工生物工程股份有限公司，按說明書制備培養(yǎng)基；生化鑒定試劑購自杭州天河微生物有限公司；豬鏈球菌2型高免血清由長江大學動物科學院制備并保存[4]。

1.3 試驗動物

試驗豬選取90日齡、體重25 kg左右的同窩恩施黑豬，購自恩施咸豐尖山鄉(xiāng)某農(nóng)戶。

選擇豬群采食量正常，試驗前用滅菌拭子采集鼻腔、扁桃體樣本檢測SS2為陰性，同時對頸靜脈采血，用ELISA方法檢測其SS2抗體均為陰性。

1.4 菌種的復蘇與菌液的制備

室溫下解凍菌種，在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許菌種，以分區(qū)劃線法接種在TSA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。眼觀復蘇菌種在TSA平板上的菌落大小、邊緣整齊度、濕潤度、隆起度、表面光滑度、顏色等。挑選單個可疑菌落作標記后，挑取少許按常規(guī)方法進行革蘭氏染色，觀察革蘭氏染色后細菌在顯微鏡下的狀態(tài)。取鏡檢后確認的細菌按常規(guī)方法接種于TSA平板中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。挑取單菌落接種THB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h。各菌平板法計數(shù)后，調(diào)整菌液濃度至1×109 CFU/mL，備用。

1.5 試驗豬的感染與臨床觀察

本試驗分A、B兩個組，A組為6頭恩施黑豬，B組為2頭恩施黑豬。試驗前將A、B兩組分別飼養(yǎng)在獨立的欄中，預試期7 d。攻毒試驗前測量每頭豬的體溫。

取“1.4”中制備好的菌液，對A組豬采用頸部肌肉注射，每頭注射6 mL，為試驗組。B組不注射為對照組。攻毒后，保障充足的飼料和飲水，每天觀察豬的臨床表現(xiàn)，如飲食情況、體溫變化、跛行和神經(jīng)癥狀等。每4 h測量全部豬的直腸溫度。

1.6 試驗豬的病料采集與處理

死后立即解剖、拍照，無菌收集其肝臟、脾臟、心血、腦脊液、胃大小彎水腫液、腸淋巴結等，分別放入液氮罐和甲醛中固定，觀察記錄病死豬的病理學變化。對未死的試驗豬50 h后進行人工處死，記錄各器官的病理變化，進行細菌涂片、染色及鏡檢，并在TSA平板上劃線分離培養(yǎng)。

1.7 病料細菌培養(yǎng)計數(shù)

尸體剖檢取實質(zhì)器官，淋巴結、肝、脾、肺、腎稱重后按10 mL/g加滅菌生理鹽水，充分研磨，倍比稀釋至10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13稀釋度。每個稀釋度取10 μL涂布法接種3個TSA平板，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，檢驗平板。

1.8 免疫器官的病理學觀察

將試驗豬主要病變組織按常規(guī)技術進行細胞病理學及組織病理學檢驗，并記錄結果。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀

對照組的豬飲食、體溫等均正常，無明顯的臨床癥狀。試驗組的豬接種豬鏈球菌2型菌液均出現(xiàn)臨床癥狀和病理變化，接種3 h后出現(xiàn)了如扎堆、精神委頓、食欲不振或廢食、結膜潮紅、樹枝狀充血，流淚，可見黏液樣鼻涕流出。仔細觀察黑豬的皮膚色澤，可見頸部、耳廓、腹下及四肢下端皮膚發(fā)紺，有出血點，整個試驗過程豬喜臥，皮膚肌肉顫抖，糞便干燥，便秘且個別糞便夾血，有個別豬拉稀。病情嚴重的臨死前出現(xiàn)共濟失調(diào)、角弓反張等神經(jīng)癥狀。其中有兩頭豬在接種后35～48 h內(nèi)死亡。攻毒后體溫上升。

2.2 病理變化

對照組進行剖檢，眼觀和顯微鏡下觀察組織切片均為正常組織狀態(tài)，無病變。

對試驗組已經(jīng)死亡的豬及瀕死期處死的病豬進行剖檢，病變主要表現(xiàn)為敗血癥癥狀（圖1），病豬腹部皮下有出血點，血液凝固不良；腎臟有點狀出血點，被膜難剝離，腎皮質(zhì)彌散性出血；肝臟腫大，表面有出血點，質(zhì)度變脆；肺臟水腫，淤血；全身淋巴結腫大、出血，尤其頜下淋巴結、腹股溝淋巴結和腸系膜淋巴結表現(xiàn)最為明顯；心臟內(nèi)膜有出血點，心肌質(zhì)地變軟；脾臟腫大、出血；扁桃體腫大，有出血點；胃內(nèi)膜出血。endprint

2.2.1 心臟病變 試驗組豬心肌組織結構破壞，閏盤消失；心肌細胞顆粒變性，腫大，胞漿中見大量紅色蛋白性顆粒（圖2）；心肌細胞水泡變性，腫脹、淡染，有的細胞呈空泡狀。對照組豬心肌結構清晰（圖3）。

2.2.2 肝臟病變 試驗組豬肝小葉結構被破壞，索狀結構消失，肝竇擴張，充滿紅細胞和其他血細胞（圖4）；細胞核凝固溶解，肝細胞腫脹，出現(xiàn)空泡樣變性，中央靜脈發(fā)生淤血。對照組豬肝細胞索明顯可見。

2.2.3 脾臟病變 試驗組豬脾臟可見大面積出血，紅白髓混亂，脾小結不明顯，嗜中性粒細胞浸潤，淋巴細胞減少；壞死性脾炎，出血壞死部分細胞脫落。

2.2.4 肺臟病變 試驗組豬肺臟可見間質(zhì)性肺炎，肺泡隔充血、水腫，炎性細胞浸潤，間隔明顯增寬，肺泡縮??；有的在肺泡間質(zhì)可見大量纖維素滲出物和少量中性炎性粒細胞，脫落的肺泡上皮細胞。對照組豬肺泡壁薄、肺泡腔內(nèi)沒有黏液等異物。

2.2.5 腎臟病變 試驗組豬腎小球體積腫大，充滿整個腎小囊；腎小管上皮細胞腫脹、出血（圖5），管壁增厚，局部腎小管上皮細胞開始脫落。對照組豬腎小球、腎小管清晰可辨，未見異常。

2.3 細菌分離鏡檢

取實質(zhì)器官淋巴結、肝、脾、肺、腎病料培養(yǎng)的菌落進行細菌染色、鏡檢，病料中培養(yǎng)出了與攻毒株SS2形態(tài)特征完全相同的細菌菌落。

3 小結與討論

以鏈球菌2型對恩施黑致病性的臨床觀察和組織病理學觀察得出結論，豬鏈球菌2型對恩施黑豬具有很強的致病性。從試驗的組織病理學觀察結果可見，感染豬呈現(xiàn)多器官組織出血為主的急性敗血癥變化，特別是肺臟、淋巴結、脾臟和腎臟出血較為嚴重，此外也可見腦膜炎、心肌炎和關節(jié)炎等病變，這與崔立等[5]用SPF巴馬小型豬研究結果一致。本次試驗用豬鏈球菌2型菌株對恩施黑豬進行攻毒成功復制了該病，其臨床癥狀和病理變化已基本清楚，但由于豬鏈球菌的血清型多，致病性復雜多變，關于豬鏈球菌2型感染動物的致病機制雖有一些國內(nèi)外學者做了一定的研究，但仍不完全清楚，還有待于繼續(xù)深入研究。

參考文獻：

[1] 鄭世軍，宋清明.現(xiàn)代動物傳染病學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.316.

[2] TANG J，WANG C，F(xiàn)ENG Y，et al. Streptococcal toxic shock syndrome caused by streptococcus suis serotype 2[J].PLoSM ed，2006，3（5）：151.

[3] 劉國平，梁雄燕，李江華，等.豬鏈球菌2型昆明鼠動物病理模型的建立[J].中國獸醫(yī)學報，2008，28（7）：795-798.

[4] 劉國平，胡利群，楊小林，等.豬鏈球菌2型高免血清的制備及臨床應用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（10）：86-88.

[5] 崔 立，朱建國，華修國，等.豬鏈球菌2型四川株與江蘇株對SPF豬的致病性[J].上海交通大學學報，2006，24（1）：54-57.endprint