高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定啤酒中伏馬毒素含量

湖南省長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心（410004）汪瓊 嚴(yán)付華 文剛

伏馬毒素是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物[1][2]，由多氫醇和丙三羧酸組成結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物[2][3]。伏馬毒素類似物主要以FB1、FB2、FB3形式存在。毒理學(xué)表明：伏馬毒素可導(dǎo)致馬腦白質(zhì)軟化癥，豬肺水腫癥及食道癌等疾病，是繼黃曲霉毒素后又一食品安全研究熱點(diǎn)。由于這些真菌毒素能感染大麥、玉米等作物，且可通過(guò)這些原料最終進(jìn)入啤酒中，導(dǎo)致啤酒食品安全問(wèn)題。目前我國(guó)尚未制定相關(guān)食品中伏馬毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。因此建立一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的測(cè)定啤酒中伏馬毒素含量的方法尤為必要。

伏馬毒素的主要檢測(cè)方法有：薄層色譜法、近紅外光譜法、氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。其中薄層色譜靈敏度較低；近紅外光譜重復(fù)性較差；基于氣相色譜類的方法步驟繁瑣；液相色譜法需衍生，耗費(fèi)溶劑較多。液相色譜-質(zhì)譜法具有較高的靈敏度和選擇性，無(wú)需衍生、水解，國(guó)內(nèi)已有報(bào)道該法測(cè)定食品中的伏馬毒素，鮮有關(guān)于啤酒中伏馬毒素測(cè)定方面報(bào)道。因此本文建立免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定啤酒中的伏馬毒素FB1、FB2、FB3含量，為保障啤酒的安全和質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 H-class UPLC超高效液相-XEVO TQD串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；MultiSep? 211 Fum凈化柱；0.22μm有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾器；伏馬毒素B1、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3標(biāo)準(zhǔn)品（51.1μg/mL，ROMER公司）乙腈、甲醇、甲酸為色譜純?cè)噭ㄌ旖蚴谢瘜W(xué)試劑研究所）；鹽酸、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀為優(yōu)級(jí)純?cè)噭▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；超純水；啤酒樣品購(gòu)于超市。

附表1 梯度洗脫程序

附表2 3種伏馬毒素質(zhì)譜參考條件

附表3 各目標(biāo)化合物測(cè)定的工作曲線、定量下限和檢出限

附圖 伏馬毒素MRM圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 PBS緩沖溶液：稱取8.0g氯化鈉，0.2g氯化鉀，1.2g磷酸氫二鈉和0.2g磷酸二氫鉀溶于990mL水中，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0，加水定容至1.0L，混勻。

1.2.2 樣品前處理 稱取2g樣品于15mL聚丙烯離心管中，超聲15min，用乙腈/水溶液（50/50）定容至10mL，混勻，取上清液備用。

MultiSep? 211 Fum凈化柱先用5mL甲醇和5mL甲醇/水溶液（75/25）活化，取5mL上清液過(guò)柱，10mL PBS緩沖溶液淋洗免疫親和柱，3mL甲醇/乙酸（98/2，V/V）溶液分3次（每次1mL）洗脫免疫親和柱，收集的洗脫液于60℃下氮吹至干，準(zhǔn)確加入1.0mL甲醇/0.1%甲酸水（75/25）溶液溶解殘留物，漩渦混勻，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，待進(jìn)樣。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱：Acquity UPLC? HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm，美國(guó)Waters公司)；流速：0.30mL/min；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水溶液；B：乙腈C：甲醇。柱溫：40℃；進(jìn)樣量：10μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)附表1。

1.2.4 質(zhì)譜參考條件 電離源位電噴霧離子源，ESI+；毛細(xì)管電壓：4.0KV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：600L/H；錐孔反吹氣流量：30L/H；檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；伏馬毒素B1、B2、B3及其內(nèi)標(biāo)物的離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量見(jiàn)附表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件優(yōu)化 分別比較不同長(zhǎng)度、不同粒徑的色譜柱，當(dāng)采用Acquity UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)時(shí)，3種物質(zhì)分離好，峰形尖銳，保留時(shí)間適中，能較好滿足定量檢測(cè)要求。為使3種伏馬毒素達(dá)到基線分離，采用常用的乙腈-水、甲醇-水和乙腈-甲醇-水，在水相中添加不同濃度的甲酸，通過(guò)比較分離效果，采用乙腈-甲醇-0.1%甲酸水體系，分離度和靈敏度都能達(dá)到最佳效果。經(jīng)優(yōu)化流速和流動(dòng)相比例，選擇梯度洗脫，見(jiàn)附表1。優(yōu)化條件下的MRM圖見(jiàn)附圖。

根據(jù)伏馬毒素的分子結(jié)構(gòu)特征，選用ESI+電離模式。將3種伏馬毒素配置適當(dāng)濃度溶液直接進(jìn)質(zhì)譜，分別對(duì)毛細(xì)管電壓、脫溶劑溫度、碰撞能量等條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定3種伏馬毒素的母離子和子離子，見(jiàn)附表2。

2.2 方法的線性范圍與檢出限 試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)樣品基質(zhì)對(duì)伏馬毒素測(cè)定影響較小，因此采用單純的標(biāo)準(zhǔn)品配置標(biāo)準(zhǔn)曲線。以定性離子通道中信噪比（S/N）為3時(shí)樣品溶液中各毒素濃度為檢測(cè)限(LOD)，以定量離子通道中信噪比（S/N）為10時(shí)樣品中各毒素濃度為定量限（LOQ），見(jiàn)附表3。

2.3 方法回收率與精密度 對(duì)未檢測(cè)出伏馬毒素的啤酒樣品，分別添加5.0μg/kg、10μg/kg、50μg/kg3個(gè)低中高水平濃度的伏馬毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平進(jìn)行6 次檢測(cè)。經(jīng)測(cè)定F B1回收率在82.6%～89.1%之間，F(xiàn)B2回收率在84.7%～86.4%間，F(xiàn)B3回收率在87.2%～91.5%之間；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均＜6.1%。

2.4 樣品測(cè)定 本文測(cè)定30份啤酒，其中2份中檢測(cè)到FB1，且含量分別是0.410μg/kg、0.347μg/kg，其他2種毒素均未檢出。

3 結(jié)論

本研究建立了檢測(cè)啤酒中伏馬毒素含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，樣品經(jīng)乙腈提取，免疫親和柱凈化，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該方法具有靈敏度高，分析時(shí)間短，節(jié)省流動(dòng)相，環(huán)保高效，方法簡(jiǎn)單、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，為檢測(cè)啤酒中此類毒素提供了一種新的檢測(cè)方法，同時(shí)為其他品種酒類中伏馬毒素的檢測(cè)提供參考。