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    一種快速分離蘋果果肉單細(xì)胞的方法

    2017-10-27 13:05:48邢文曦王永章劉成連
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年16期
    關(guān)鍵詞:單細(xì)胞蘋果

    邢文曦 王永章 劉成連

    摘要:?jiǎn)渭?xì)胞是生物體的基本單位,提取具有活性的單細(xì)胞是研究果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ)。以蘋果為材料,研究不同酶液組合和酶解時(shí)間對(duì)蘋果果肉單細(xì)胞分離的影響。結(jié)果表明,蘋果果肉在01%離析酶、暗酶解05 h時(shí),為理想的蘋果果肉單細(xì)胞分離條件。

    關(guān)鍵詞:蘋果;單細(xì)胞;離析酶;酶解濃度;酶解時(shí)間

    中圖分類號(hào): S661101文獻(xiàn)標(biāo)志碼:

    文章編號(hào):1002-1302(2017)16-0138-02

    [HJ14mm]

    收稿日期:2016-03-29

    基金項(xiàng)目:山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目。

    作者簡(jiǎn)介:邢文曦(1990—),女,山西朔州人,碩士研究生,主要從事果樹栽培與生理等研究。E-mail:kaoyanxixi@163com。

    通信作者:劉成連,教授,研究方向?yàn)楣麡湓耘嗌砼c分子生物學(xué)。E-mail:fmdb@qaueducn。

    單個(gè)活體細(xì)胞是生物生命活動(dòng)的基本單元和進(jìn)化的基本單位,對(duì)單個(gè)活體細(xì)胞的識(shí)別、分選及分析,能夠解析生命體系最深層次的異質(zhì)性和運(yùn)作機(jī)制。同時(shí),因其不依賴細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增,單細(xì)胞技術(shù)在生物發(fā)育、生物能源、氣候變化、疾病診斷、食品安全、農(nóng)業(yè)生態(tài)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。分離植物精細(xì)胞用于離體培養(yǎng),可以為通過離體有性繁殖途徑進(jìn)行植物品種改良打下基礎(chǔ);分離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體,使研究保衛(wèi)細(xì)胞本身的生理生化特性及其與氣孔功能的關(guān)系成為可能;分離維管束組織和韌皮部組織細(xì)胞,可以進(jìn)行組織特異表達(dá)基因的鑒定。利用棉纖維單細(xì)胞研究細(xì)胞壁和纖維素的形成過程,能幫助人們更好地提高棉纖維的質(zhì)量。目前,研究基因表達(dá)都是一群細(xì)胞的基因表達(dá),這種表達(dá)實(shí)際上是每個(gè)細(xì)胞特異表達(dá)的平均情況,但是單個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)分析能夠提供隱藏在群體細(xì)胞中單個(gè)細(xì)胞發(fā)育的新機(jī)制[3-4]。細(xì)胞膜上有各種離子通道,如鈣離子通道、鉀離子通道及鈉離子通道等,這些通道調(diào)節(jié)離子進(jìn)出,利用膜片鉗技術(shù)可研究單個(gè)細(xì)胞離子通道的特性等,從而深入地研究生物體信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞滲透壓、細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)及抗逆性等各種生理機(jī)制。Li等利用膜片鉗等技術(shù),發(fā)現(xiàn)了控制鉀離子通道的流向轉(zhuǎn)換機(jī)制,揭開了使同一離子通道的離子流向發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵因素[5]。果實(shí)的發(fā)育過程就是果肉細(xì)胞發(fā)育的過程,決定著果實(shí)的硬度、甜度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等,與果實(shí)貯藏時(shí)間長(zhǎng)短、病害發(fā)生等都有關(guān)系,因此研究分離活性果肉單細(xì)胞是研究果實(shí)發(fā)育的基礎(chǔ);但是目前還沒有果樹類果肉細(xì)胞分離的相關(guān)報(bào)道,本研究以蘋果為材料,研究果肉細(xì)胞的提取方法。

    1材料與方法

    11材料

    從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)實(shí)習(xí)基地,取成熟富士蘋果,貯藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    12器材與試劑

    熒光顯微鏡 (LEICA,DM2500,德國(guó))、勻漿機(jī)、低速離心機(jī)、恒溫?fù)u床、磁力攪拌器等。

    13試驗(yàn)方法

    131單細(xì)胞分離

    配制細(xì)胞和原生質(zhì)體洗滌溶液(cell and potoplast wash solution,簡(jiǎn)稱CPW):101000 mg/L KNO3,27200 mg/L KH2PO4,246000 mg/L MgSO4·7H2O,1 480000 mg/L CaCl2·2H2O,0160 mg/L KI,0025 mg/L CuSO4·5H2O,0400 mol/L 甘露醇,4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩@w維素酶、果膠酶、離析酶溶于CPW溶液中,酶液見表1。

    將蘋果表皮以下的果肉用手術(shù)刀切成邊長(zhǎng)05 cm 的小方塊,再徒手切成薄片。將切好的蘋果薄片分別置于50 mL的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ酶液中(酶液的組成見表1),于70 r/min搖床中振蕩酶解05 、10、20 h(27 ℃,黑暗條件)。靜置后,用CPW溶液清洗3次,以洗去酶液,再移到50 mL燒杯中,在磁力攪拌器上攪拌1 h后,在顯微鏡上檢測(cè),比較各個(gè)酶液在不同處理時(shí)間下獲取單細(xì)胞的結(jié)果。

    132采用VBL檢測(cè)細(xì)胞壁完整性

    采用黃祥輝等的方法,配制VBL[4,4′-bis(4-anilino-6-hydroxyethyl-amine-S-triazin-2-ylamino)-2,2′-stilbene disulfonic acid]細(xì)胞壁染色液。先配制05 mol/L甘露醇,調(diào)節(jié)pH值為70 (Tris)。再用甘露醇溶液配制VBL,使VBL終濃度為01%。避光,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    染色步驟:(1)吸取1 mL細(xì)胞懸浮液到15 mL離心管中,吸取10 μL,滴加于載玻片上,在顯微鏡下觀察。(2)吸取400 μL細(xì)胞懸浮液至新的離心管中,加20 μL 上述01% VBL,避光,染色5 min。(3)染色后,用CPW溶液重復(fù)漂洗3次,以除去背景中的熒光。(4)漂洗后,懸浮于CPW溶液中,避光,熒光顯微鏡下觀察。VBL的激發(fā)波長(zhǎng)為345 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為430 nm。

    133FDA檢測(cè)細(xì)胞活性

    FDA是一種非熒光化合物,滲入活細(xì)胞后才釋放出熒光素,在藍(lán)色光激發(fā)下顯示出綠色熒光[8]。

    配制5 mL 濃度為5 mg/L的FDA:先配065 mol/L甘露醇,再稱取25 mg雙醋酸熒光素FDA,溶于1 mL丙酮中,完全溶解之后,加入上述甘露醇溶液4 mL,避光,4 ℃ 保存。取細(xì)胞懸浮液05 mL于15 mL離心管中,加入FDA染色液,使其終濃度為001%,室溫下靜置5 min,熒光顯微鏡下觀察,F(xiàn)DA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為493 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。發(fā)綠色熒光的為活細(xì)胞,不發(fā)熒光的為死細(xì)胞。

    2結(jié)果與分析

    分離蘋果果肉單細(xì)胞過程中,在沒有酶的情況下,不能分離出果肉單細(xì)胞,用FDA染色液染色,能夠看到堆疊的有活性的細(xì)胞群(圖1-A)。當(dāng)酶液中含有01%纖維素酶或 005%果膠酶時(shí),獲得單細(xì)胞少,有碎片存在,如表2中酶液Ⅰ、酶液Ⅱ;但當(dāng)酶液中只含有01%離析酶時(shí),處理時(shí)間為05 h時(shí),單細(xì)胞產(chǎn)量多且完整(圖1-B、1-D),當(dāng)處理時(shí)間為10、20 h時(shí),雖有較多的單細(xì)胞,但有碎片存在,因此,酶液Ⅲ是分離果肉單細(xì)胞的最佳酶液,適宜酶解時(shí)間為05 h(表2)。

    VBL與植物細(xì)胞壁中的纖維素有強(qiáng)烈的親和力,在紫外光下產(chǎn)生熒光,利用這個(gè)特性,常被用于檢測(cè)細(xì)胞的完整性。離析酶分離得到的蘋果果肉單細(xì)胞經(jīng)VBL染色后,細(xì)胞周圍有明顯的熒光(圖1-C),這說明經(jīng)離析酶處理果肉可以獲得完整的果肉單細(xì)胞。FDA常用動(dòng)植物細(xì)胞生活力的鑒定染料,當(dāng)活細(xì)胞具有完整細(xì)胞膜時(shí),細(xì)胞內(nèi)的FDA經(jīng)水解產(chǎn)生的熒光素在胞內(nèi)積累,在藍(lán)光下產(chǎn)生綠色熒光,而死細(xì)胞的細(xì)胞膜失去了選擇透性,熒光素?zé)o法在胞內(nèi)積累,不產(chǎn)生熒光[8]。分離得到的單細(xì)胞經(jīng)FDA染色5 min后,細(xì)胞內(nèi)充滿了熒光物質(zhì)(圖1-E),這表明分離得到的果肉單細(xì)胞具有活性。

    3結(jié)論與討論

    單細(xì)胞水平研究越來越受到關(guān)注,已被廣泛應(yīng)用于單細(xì)胞PCR擴(kuò)增、基因測(cè)序及細(xì)胞工程研究等,因此分離單細(xì)胞是生理和分子研究的基礎(chǔ)。據(jù)筆者所知,目前分離植物單細(xì)胞以酶解法為主,即采用纖維素酶、果膠酶等破壞植物細(xì)胞壁,使細(xì)胞相互分離,從而分離出單細(xì)胞或者原生質(zhì)體。張寧等應(yīng)用酶解法分離馬鈴薯的葉片單細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)果膠酶是細(xì)胞分離的關(guān)鍵酶,但只是統(tǒng)計(jì)了細(xì)胞的分離率,酶解時(shí)間比本研究的酶解時(shí)間長(zhǎng),最少為4 h,酶解時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)破壞細(xì)胞的完整性和活性[9]。目前還有很多研究都直接提取了原生質(zhì)體,而使細(xì)胞壁破裂。陳穎等用纖維素酶酶解擬南芥葉肉細(xì)胞,獲取了葉肉細(xì)胞的原生質(zhì)體[10]。陳愛萍等用纖維素酶、果膠酶、離析酶提取了紅豆草的原生質(zhì)體[11]。

    纖維素酶和果膠酶能夠促進(jìn)細(xì)胞壁的降解,在筆者的研究中,為了保護(hù)細(xì)胞壁,只采用10%離析酶進(jìn)行酶解,從而獲得有完整細(xì)胞壁的單細(xì)胞。細(xì)胞壁的功能,細(xì)胞極性的形成,植物激素的定向運(yùn)輸,細(xì)胞骨架的極性變化,小泡的定向分布和運(yùn)輸?shù)纫幌盗屑?xì)胞發(fā)育事件都是彼此相連的。植物細(xì)胞壁在細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用,是細(xì)胞外圍的一層壁,有保護(hù)細(xì)胞的作用[12]。除此之外,細(xì)胞壁還參與了植物生長(zhǎng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞識(shí)別、抗病反應(yīng)等一系列代謝活動(dòng)。細(xì)胞極性是生物體的基本屬性,在多細(xì)胞生物里同時(shí)也控制細(xì)胞間的信息交換、模式生成、身份識(shí)別。因此獲取有細(xì)胞壁的單細(xì)胞對(duì)研究細(xì)胞的生理生化具有重要意義,也是在細(xì)胞水平研究蘋果生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)。纖維素酶和果膠酶可以分解植物細(xì)胞壁,所以在本研究中,為了避免細(xì)胞壁的降解,只用了離析酶分離果肉細(xì)胞,通過VBL檢測(cè),獲得了有完整細(xì)胞壁的果肉單細(xì)胞。Mcatee等把蘋果、梨等果實(shí)的果肉,一邊加熱煮沸,一邊通過磁力攪拌器攪拌05 h,直至看到果肉單細(xì)胞才停止加熱,但是獲得的單細(xì)胞已經(jīng)失去活性,只能用于檢測(cè)果肉細(xì)胞的大小和形狀[14]。而本研究分離得到的果肉細(xì)胞經(jīng)VBL染色,能看到完整的細(xì)胞壁,經(jīng)過FDA染色,單細(xì)胞具有明顯的活性。酶解處理的原則是利用盡可能低的酶濃度和盡可能短的酶解時(shí)間獲得大量且有活力的原生質(zhì)體[15]。本研究只用了01%離析酶,而且酶解時(shí)間只有05 h,低于酶解獲取原生質(zhì)體的時(shí)間[16-17]。

    總之,采用01%離析酶酶解蘋果果肉,再攪拌30 min,能得到細(xì)胞壁完整且具有活性的果肉單細(xì)胞。

    參考文獻(xiàn):

    Beijnum J R V,Mat R,Karolien C,et al Isolation of endothelial cells from fresh tissues[J] Nature Protocol,2008,3(6):1085-1091

    Candace H H,Lissete B,Michael R Cotton fiber:a powerful single-cell model for cell wall and cellulose research[J] Frontiers in Plant Science,2012,3(4):279-286

    [3]Narsinh K H,Ning S,Veronica S F,et al Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells[J] Journal of Clinical Investigation,2011,121(3):1217-1221

    [4]Bloch D,Yalovsky S Cell polarity signaling[J] Current Opinion in Plant Biology,2013,16(6):734-742

    [5]Li L G,Liu K,Hu Y Single mutations convert an outward K+ channel into an inward K+ channel[J] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(8):2871-2876

    [6]張寧,李威,顧釗宇,等 ‘富士蘋果花粉原生質(zhì)體分離初探[J] 園藝學(xué)報(bào),2015,42(6):1167-1174

    [7]黃祥輝,顏季瓊 應(yīng)用熒光增白劑 VBL 研究原生質(zhì)體細(xì)胞壁的再生[J] 植物生理學(xué)報(bào),1980,6(2):207-211

    [8]張先杰,李鐸,孫海晨,等 臺(tái)盼藍(lán)染色與FDA/PI雙染色對(duì)檢測(cè)肝細(xì)胞活率的評(píng)價(jià)[J] 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,21(3):258-258

    [9]張寧,司懷軍,王蒂 馬鈴薯單細(xì)胞分離技術(shù)的研究[J] 中國(guó)馬鈴薯,2004,18(4):193-197

    [10]陳穎,賈艷菊,張翠茹 擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離及影響因素[J] 河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008,28(4):423-426

    [11]陳愛萍,羅玉鵬,姜婷娜,等 不同酶液組合及酶解時(shí)間對(duì)普通紅豆草原生質(zhì)體游離的影響[J] 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,31(2):29-32

    [12]Caffall K,Mohnen D The structure,function,and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides[J] Carbohydrate Research,2009,344(14):1879-1900

    [13]Cosgrove D Growth of the plant cell wall[J] Nature Reviews Molecular Cell Biology,2005,6(11):850-861

    [14]Mcatee P A,Hallett I C,Johnston J W,et al A rapid method of fruit cell isolation for cell size and shape measurements[J] Plant Methods,2009,5(1):157

    [15]Burton R A,F(xiàn)incher G B Plant cell wall engineering:applications in biofuel production and improved human health[J] Current Opinion in Biotechnology,2014,26(7):79-84

    [16]Mazarei M,Alahmad H,Rudis M Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass,Panicum virgatum L[J] Biotechnology Journal,2008,3(3):354-359

    [17]Zhai Z,Jung H I,Vatamaniuk O K Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana[J] Journal of Visualized Experiments,2009,30(30):1149-1159

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