三葉青黃酮對(duì)荷Lewis肺癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞PGE2、COX-2表達(dá)的影響

張祺箐 馮正權(quán)

三葉青黃酮對(duì)荷Lewis肺癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞PGE2、COX-2表達(dá)的影響

張祺箐 馮正權(quán)

目的 研究三葉青黃酮對(duì)荷Lewis肺癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞前列腺素E2（PGE2）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）表達(dá)的影響。方法 皮下接種法建立Lewis肺癌小鼠動(dòng)物模型，接種14天后取脾臟，分離單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）刺激為模型組，塞來(lái)昔布（SC58635）為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)三葉青黃酮低、中、高濃度組，無(wú)TGF-β1及藥物為空白對(duì)照組。ELISA法測(cè)定單個(gè)核細(xì)胞分泌 PGE2、COX-2 濃度。結(jié)果 TGF-β1 刺激 24h 后，與空白對(duì)照組 PGE2（99.31±3.82）pg/mL、COX-2（290.49±5.37）pg/mL 比較，其余五組 PGE2、COX-2 均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。模型組脾臟單個(gè)核細(xì)胞體外分泌PGE2[（138.18±4.00）pg/mL]、COX-2[（331.58±5.78）pg/mL]含量最高。與模型組比較，給藥組PGE2、COX-2含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。PGE2含量依次為塞來(lái)昔布組（110.13±2.38）pg/mL＜三葉青黃酮高劑量組（118.18±1.96）pg/mL＜中劑量組（121.62±4.44）pg/mL＜低劑量組（128.90±4.24）pg/mL。COX-2含量依次為塞來(lái)昔布組（309.51±2.85）pg/mL＜三葉青黃酮高劑量組（319.64±2.29）pg/mL＜中劑量組（323.92±2.61）pg/mL＜低劑量組（327.07±4.53）pg/mL。給藥組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論 三葉青黃酮在體外可能通過(guò)影響PGE2、COX-2表達(dá)水平，改善腫瘤微環(huán)境，起到抗腫瘤作用，其作用與劑量呈正比。

荷Lewis肺癌小鼠；三葉青黃酮；單個(gè)核細(xì)胞；環(huán)氧化酶-2；前列腺素E2

1979年Lord正式提出了“腫瘤微環(huán)境”，指腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、微淋巴管、組織液、眾多細(xì)胞因子及少量浸潤(rùn)細(xì)胞等共同構(gòu)成[1]。腫瘤微環(huán)境中炎癥因子、腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子、腫瘤間質(zhì)細(xì)胞分泌Toll樣受體、補(bǔ)體等通過(guò)不同信號(hào)通路眾多途徑發(fā)揮負(fù)向免疫作用。其中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factors-β，TGF-β）和程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1） 通過(guò)抑制 T細(xì)胞免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近年研究發(fā)現(xiàn)異常炎性反應(yīng)（PGE2/COX2通路）和腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制（TGF-β誘導(dǎo)Treg）存在一定的關(guān)聯(lián)性[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，PGE2均能在體內(nèi)外刺激Treg生成，而腫瘤衍生的環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）能促進(jìn)Treg表型的生成。筆者前期研究顯示，三葉青黃酮通過(guò)抑制荷瘤小鼠Treg細(xì)胞表達(dá)，降低外周血中PGE2、COX-2的含量[5]。本次實(shí)驗(yàn)以塞來(lái)昔布為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)三葉青黃酮體外干預(yù)，觀察其對(duì)肺癌小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2、COX-2的影響，進(jìn)一步研究其在調(diào)節(jié)腫瘤免疫的效應(yīng)及機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠5只，5 周齡，體質(zhì)量（16.80±0.60）g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證：SCXK（滬）2013-0016。Lewis肺癌細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心對(duì)Lewis細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 三葉青購(gòu)于浙江省中醫(yī)院中藥房，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定，質(zhì)量均符合實(shí)驗(yàn)使用要求。Celecoxib（SC58635）購(gòu)自 Selleck Chemicals公司。

1.3 主要試劑和儀器 小鼠組織單個(gè)核細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锕荆?；RPMI1640培養(yǎng)液（雙抗）、PBS、二甲基亞砜（DMSO）（吉諾生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（浙江省立同德醫(yī)院）；Recombinant Human TGF-β1（PeproTech公司）；重組細(xì)胞因子溶解稀釋液套裝（聯(lián)科生物公司）；小鼠PGE2 ELISA試劑盒和小鼠COX-2 ELISA試劑盒（R&D公司）；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)寶特公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 荷Lewis肺癌小鼠模型建立 皮下接種法[6]：待Lewis細(xì)胞數(shù)目及質(zhì)量滿足接種要求后，將細(xì)胞離心分離，然后用PBS液稀釋?zhuān)靹蛑瞥杉?xì)胞混懸液（1.0×107/mL）備用。將細(xì)胞混懸液接種于已消毒的5只C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮膚，每只0.2mL。觀察接種小鼠成瘤情況。接種后第8天，在小鼠右側(cè)腋窩皮膚下能觸及腫瘤，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其最短直徑≥8mm，即算造模成功。

2.2 分離脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng) 造模成功后，接種后14天，頸椎脫臼處死小鼠，用75%酒精浸泡5min，在無(wú)菌條件下摘取脾臟，經(jīng)200目的篩網(wǎng)研碎過(guò)濾，1000轉(zhuǎn)/分，離心5min，收集細(xì)胞，用密度梯度離心法分離脾臟單個(gè)核細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用RPMI1640（雙抗）+10%胎牛血清稀釋?zhuān){(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/mL。

2.3 制備三葉青黃酮 根據(jù)文獻(xiàn)[7]方法提取三葉青黃酮，再依據(jù)馮正權(quán)等[8]研究，使三葉青黃酮粉末溶于二甲基亞砜中，旋渦震蕩，全部溶解過(guò)濾除菌，用RPMI1640培養(yǎng)液（雙抗）稀釋?zhuān)郎u震蕩混勻后放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。以三葉青粉末最大溶解度為高劑量，設(shè)高、中、低終濃度分別為 12.5、6.25、3.125μg/mL。設(shè)塞來(lái)昔布（SC58635）為陽(yáng)性對(duì)照組，終濃度為12.5μg/mL。

2.4 三葉青黃酮對(duì)單個(gè)核細(xì)胞的干預(yù)作用 目前未有類(lèi)似三葉青黃酮體外干預(yù)在TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2、COX-2含量的相關(guān)研究。為摸索合適的TGF-β1刺激濃度和觀察時(shí)間點(diǎn)，進(jìn)行了一組預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別用 0、5、10、20ng/mL 的 TGF-β1刺激，觀察 24、48、72h，顯示 5ng/mL TGF-β1 刺激24h，單個(gè)核細(xì)胞分泌的PGE2含量最高。因此設(shè)5ng/mL為T(mén)GF-β1刺激濃度。用含10%胎牛血清的1640（雙抗）培養(yǎng)液培養(yǎng)的小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞以9.0×105/孔接種于24孔板，模型組加入終濃度為5ng/mL的TGF-β1刺激，三葉青黃酮低、中、高濃度組分別加 入 12.5、6.25、3.125μg/mL 的 三 葉 青 黃 酮 溶 液75μL，陽(yáng)性對(duì)照組加 12.5μg/mL 塞來(lái)昔布（SC58635）溶液75μL，不加TGF-β1及藥物者為空白對(duì)照組。每劑量組3孔，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察時(shí)間為12、24、36h。收集細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)細(xì)胞上清液PGE2和COX-2，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS Statistics 17.0軟件包處理，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），多組間比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性時(shí)多組間兩兩比較用最小極差法（LSD法），方差不齊時(shí)多組間兩兩比較用Dunnett's T3法。以P＜0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2含量比較 各組PGE2分泌量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12h與 36h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各給藥組PGE2含量均高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。塞來(lái)昔布組與三葉青黃酮各劑量組PGE2均低于模型組（P＜0.01）。三葉青黃酮各劑量組PGE2含量高于塞來(lái)昔布組（P＜0.01）。三葉青黃酮高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，高劑量組與中、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表 1。

3.2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌COX-2含量比較 各組COX-2分泌含量均呈先高后低，24h含量高于12h和36h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），12h與36h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各給藥組COX-2含量均高于空白對(duì)照組（P＜0.01）。塞來(lái)昔布組與三葉青黃酮高、中劑量組的COX-2均低于模型組（P＜0.01）。三葉青黃酮各劑量組COX-2含量均高于塞來(lái)昔布組高（P＜0.01）。三葉青黃酮高劑量組＜中劑量組＜低劑量組，高劑量組與低劑量組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

4 討論

TGF-β1是一種多功能的多肽類(lèi)細(xì)胞因子，它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有雙重作用。在正常細(xì)胞中，TGF-β1通過(guò)阻斷細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化或誘發(fā)凋亡。因此，在腫瘤發(fā)生的早期階段，可阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。但在腫瘤發(fā)展后期，該信號(hào)通路發(fā)生異常改變或功能缺陷，導(dǎo)致細(xì)胞不受細(xì)胞增殖的調(diào)控。

前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）是細(xì)胞膜磷脂代謝產(chǎn)物花生四烯酸（AA）在環(huán)氧化酶COX-1、COX-2和PGE2合成酶的作用下產(chǎn)生的脂質(zhì)小分子，它促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移。它還對(duì)免疫細(xì)胞有明顯的抑制作用，如下調(diào)炎癥趨化因子和Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的分化，抑制T細(xì)胞的增殖，抑制效應(yīng)性T細(xì)胞抗腫瘤的作用[9]。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是可誘生型酶，靜息細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不出，其表達(dá)高度受限。但可以被細(xì)胞內(nèi)外廣泛的刺激因素所誘導(dǎo)，這些刺激因素包括胃泌素、生長(zhǎng)因子、IL-8、表皮生長(zhǎng)因子、TNF-α及腫瘤誘導(dǎo)劑或紫外線照射等。COX-2的具體功能目前尚不清楚，在正常生理情況下，它可能參與生殖和分娩等過(guò)程；在病理情況下，COX-2可能參與炎癥及腫瘤的形成[10]。

表1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2含量比較

表1 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2含量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與塞來(lái)昔布組比較，#P＜0.01；與 12h、36h 比較，▲P＜0.05；與三葉青黃酮高劑量組比較，□P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組塞來(lái)昔布組三葉青黃酮高劑量組三葉青黃酮中劑量組三葉青黃酮低劑量組孔數(shù)333333 12h 94.61±4.63 125.66±4.27*107.91±2.75*△113.13±2.07*△#116.50±4.50*△#□119.21±2.04*△#□24h 99.31±3.82 138.18±4.00*▲110.13±2.38*△▲118.18±1.96*△#▲121.62±4.44*△#▲□128.90±4.24*△#▲□36h 94.41±2.78 126.01±4.04*107.22±2.53*△115.17±1.86*△#118.67±4.67*△#□121.59±6.21*#□

表2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌COX-2含量比較

表2 各組荷瘤小鼠TGF-β1刺激后脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌COX-2含量比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與塞來(lái)昔布組比較，#P＜0.01；與三葉青黃酮高劑量組比較，□P＜0.05；與 12h、36h 比較，▲P＜0.05

組別空白對(duì)照組模型組塞來(lái)昔布組三葉青黃酮高劑量組三葉青黃酮中劑量組三葉青黃酮低劑量組孔數(shù)333333 12h 283.59±5.34 322.63±6.22*305.46±2.69*△314.67±1.82*△#317.53±2.62*△#319.11±4.46*#□24h 290.49±5.37 331.58±5.78*▲309.51±2.85*△▲319.64±2.29*△#▲323.92±2.61*△#▲327.07±4.53*#□▲36h 285.79±5.53 326.51±5.78*303.60±2.24*△316.07±2.52*△#321.31±2.70*△#323.19±2.95*#□

三葉青，學(xué)名三葉崖爬藤，拉丁名tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg，為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國(guó)特有的植物[11]。具有清熱解毒、祛風(fēng)化痰、活血止痛的功能，在民間三葉青還被用于治療腫瘤，被許多民間驗(yàn)方收載[12]。丁鋼強(qiáng)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，三葉青可以使小鼠體內(nèi)TNF-α、IFN-γ含量增高，還能增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能。TNF-α具有明確的體內(nèi)外殺傷腫瘤細(xì)胞的作用[13-14]，TNF-α誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用是通過(guò)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。馬丹丹等[15]研究顯示，三葉青多糖有明顯的抗肝損傷效果。利用有機(jī)溶劑萃取的方式提取三葉青后，黃酮類(lèi)是應(yīng)用價(jià)值最高的有效成分，其次還有多糖類(lèi)物質(zhì)、甾類(lèi)化合物、有機(jī)酸、酯類(lèi)化合物等。郝皖蓉[16]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量（100mg/mL）的三葉青黃酮通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)芟抡{(diào)荷肺癌鼠外周血及脾臟單個(gè)核細(xì)胞中的Treg細(xì)胞比例。

為進(jìn)一步研究三葉青黃酮對(duì)脾臟單個(gè)核細(xì)胞的體外作用，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞也會(huì)分泌PGE2，且24、48、72h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)無(wú)明顯差異，含量較平穩(wěn)。TGF-β1作為腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子，在一定濃度下（5ng/mL）能刺激脾臟單個(gè)核細(xì)胞分泌PGE2增多，但以24h PGE2含量最高。本研究結(jié)果顯示，荷Lewis肺癌小鼠因腫瘤發(fā)生微環(huán)境變化，使TGF-β1增多，推測(cè)其濃度增大到達(dá)一定程度時(shí)激發(fā)炎癥通路，使PGE2、COX-2含量明顯較空白對(duì)照組增高（P＜0.01）。

各藥物干預(yù)組PGE2、COX-2與模型組相比均有下降（P＜0.01），三葉青黃酮各組中以三葉青黃酮高劑量組PGE2、COX-2下降最顯著，說(shuō)明作用與其濃度呈正相關(guān)。推測(cè)三葉青作為清熱解毒的代表中藥，能減少腫瘤相關(guān)炎癥因子的含量，逆轉(zhuǎn)PGE2/COX-2通路，改善腫瘤微環(huán)境，為逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Flavonoid Extract from Radix Tetrastigme on PGE2 and COX-2 in Spleen Mononuclear Cells of Lewis Lung Carcinoma Mice

ZHANG Qiqing,FENG Zhengquan.

Department of Oncology,Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the effect of flavonoid extract of Radix Tetrastigme on the Expression of prostaglandin 2（PGE2） and cyclooxygenase-2（COX-2） in spleen mononuclear cells of mice with lung cancer.MethodsLewis lung carcinoma model was established with subcutaneous inoculation and the spleen was obtained after 14 days to isolate mononuclear cells,than were divided into model group（with TGF-β1 stimulation）,positive group（with celebrex）,low-,medium-,and high-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups,and blank group.ELISA was used to determine the contents of PGE2 and COX-2.ResultsAfter 24-h TGF-β1 stimulation,compared to blank group（PGE2:99.31±3.82pg/mL,COX-2:290.49±5.37pg/mL）,the contents of PGE2 and COX-2 in other 5 groups increased with a significant difference（P＜0.01）.The highest level of PGE2 and COX-2 was in model group（138.18±4.00pg/mL and 331.58±5.78pg/mL,respectively）.Compared with model group,the contents of PGE2 and COX-2 in drug groups were significantly reduced（P＜0.01）.The PGE2 level in celebrex group and high-,medium-,and low-dose flavonoid extract of Radix Tetrastigme groups were as follows:110.13±2.38pg/mL,118.18±1.96pg/mL,121.62±4.44pg/mL,and 128.90±4.24pg/mL;the COX-2 level were the following:309.51±2.85pg/mL,319.64±2.29pg/mL,323.92±2.61pg/mL and 327.07±4.53pg/mL;siginifcant difference was found among drug groups（P＜0.05 or P＜0.01）.ConclusionFlavonoid extract of Radix Tetrastigme can improve the tumor microenvironment by regulating the expression of PGE2 and COX-2 to against the tumor in a dose-dependent manner.

Lewis lung cancer mice;flavonoid extract of Radix Tetrastigme;mononuclear cell;cyclooxygenase-2;prostaglandin 2

項(xiàng)目來(lái)源：浙江省自然科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目（No.Y12H270055）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.JDZX2015251）

浙江省立同德醫(yī)院腫瘤科（杭州 310012）

馮正權(quán)，E-mail：fzhq213@163.com

（收稿：2017-04-26 修回：2017-06-20）