銀杏葉提取物對(duì)大鼠內(nèi)耳組織及蝸神經(jīng)核線粒體DNA4834bp缺失突變的影響

黃海林劉 俊

·論 著·

銀杏葉提取物對(duì)大鼠內(nèi)耳組織及蝸神經(jīng)核線粒體DNA4834bp缺失突變的影響

黃海林1劉 俊2

目的 觀察銀杏葉提取物對(duì)大鼠內(nèi)耳組織及蝸神經(jīng)核線粒體（mt）DNA4834bp缺失突變的影響。方法 取24月齡SD大鼠20只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，各10只，分別用銀杏葉提取物100mg/（kg·d）、等體積生理鹽水灌胃，3個(gè)月后處死。干預(yù)前后分別測(cè)試兩組大鼠ABR，熒光定量PCR檢測(cè)線粒體DNA4834bp缺失率，并觀察其與老年聽力損失的關(guān)系。結(jié)果 干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組ABR 閾移（3.91±3.73）dB peSPL，對(duì)照組 ABR 閾移（9.64±2.59）dB peSPL，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組蝸神經(jīng)核、內(nèi)耳組織線粒體DNA4834bp缺失率降低（0.2466±0.1335 比 1.0461±0.3423，0.3507±0.158 比 1.0202±0.2269，P＜0.05）。結(jié)論 銀杏葉提取物能抑制大鼠聽覺器官線粒體DNA4834bp缺失突變，減少mtDNA的氧化損傷，改善線粒體功能，改善聽力，從而延緩大鼠老年性耳聾進(jìn)展。

大鼠；老年性耳聾；銀杏葉提取物；氧化損傷；線粒體DNA4834bp；內(nèi)耳；耳蝸核

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD老齡大鼠20只（24月齡），平均體質(zhì)量（647.83±10.35）g，所有動(dòng)物均無噪聲暴露史及其它藥物使用史，無中耳炎。大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，醫(yī)學(xué)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016，全封閉SPF級(jí)狀態(tài)下標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑 銀杏葉提取物（商品名：金納多滴劑；規(guī)格：30mL/支）：德國(guó)威瑪舒培藥廠提供；PCR引物合成：上海生工生物有限公司；PBS緩沖液：上海永葉生物科技有限公司；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（RR420A）：TaKaRa生物科技公司；10%水合氯醛：浙江省中醫(yī)院提供；Taq酶、蛋白酶k、瓊脂糖：TaKaRa生物科技公司。

1.3 主要儀器 GSI Audera腦干誘發(fā)電位儀：美國(guó)GSI公司；電子天平：上海天平儀器廠；臺(tái)式離心機(jī)：THERMO Electron（美國(guó)）公司；Model DK-8D 恒溫水?。荷虾Ｉ艑?shí)驗(yàn)儀器有限公司；BIO-RAD iQ5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀凝膠成像：BIO-RAD公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司；玻璃勻漿器：江蘇海門健康實(shí)驗(yàn)器材有限公司；體視顯微鏡：南京南派有限公司；眼科手術(shù)器械：江蘇康華醫(yī)療器械廠；紫外線核酸檢測(cè)儀：Thermo（美國(guó)）公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 20只老齡SD大鼠（24月齡）隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組10只，銀杏葉提取物100mg/（kg·d）灌胃。對(duì)照組10只，等量體積生理鹽水灌胃。SPF條件下飼養(yǎng)，常溫（22±2℃）、常濕（50%～60%）下標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由飲水，連續(xù)飼養(yǎng)90天后處死。

2.2 大鼠ABR反應(yīng)閾測(cè)定 實(shí)驗(yàn)開始前1天及實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1天分別進(jìn)行ABR反應(yīng)閾測(cè)試，測(cè)定方法參照孔維佳建立方法進(jìn)行[10]。測(cè)試前兩組大鼠用10%水合氯醛按照0.4mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，使用GSI Audera腦干誘發(fā)電位儀測(cè)試，測(cè)試電極采用直徑0.38mm，長(zhǎng)13mm針灸針。電極安放位置：記錄電極置于待測(cè)耳乳突部皮下，參考電極置于對(duì)側(cè)耳乳突皮下，地極置于顱頂皮下，耳機(jī)置于測(cè)試耳外耳道。參數(shù)設(shè)置：刺激聲為Click聲，刺激重復(fù)頻率為11.1/s，疊加 300 次，掃描時(shí)間 10ms，間期 100μs。聲刺激強(qiáng)度以100dB peSPL開始，開始強(qiáng)度按10dB peSPL遞減，觀察Ⅲ波波形變化，接近閾值時(shí)按5dBpeSPL遞減。閾值以Ⅲ波波形消失，成重復(fù)出現(xiàn)時(shí)的刺激聲強(qiáng)為該測(cè)試耳閾值，刺激聲強(qiáng)單位：dB peSPL。ABR測(cè)試采用單盲法，即測(cè)試者不知大鼠用藥情況及分組。ABR閾移為治療前后閾值差。

2.3 內(nèi)耳組織及蝸神經(jīng)核mtDNA提取

2.3.1 內(nèi)耳組織mtDNA提取 兩組大鼠ABR測(cè)試結(jié)束后立即麻醉斷頭處死，提取雙側(cè)聽泡，置于4℃預(yù)冷的充氧無鈣鎂細(xì)胞外液中（0.1mol/L PBS，pH 7.4），體視顯微鏡下剝?nèi)ス切晕仛ぃ馄食龆丆orti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)等內(nèi)耳組織。分別置入勻漿管中加入 100μL勻漿液（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.1Mmol/L，0.01mol/L蔗糖），在檢測(cè) mtDNA 缺失率時(shí)兩側(cè)內(nèi)耳耳蝸Corti器、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)可以作為同一個(gè)樣本勻漿后提取總DNA，步驟如下：（1）在勻漿管中加入 1000μL RIPA 裂解液（強(qiáng)）；（2）加入蛋白酶K，至終濃度10mg/mL，搖勻混合，55℃水浴過夜消化；（3）加入等體積飽和酚，溫和振蕩10min，12 000g 0℃離心 10min；（4）留取水相，加入等體積酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），劇烈震蕩，抽提1～2次；（5）留取水相，加入等體積氯仿，顛倒混勻，抽提1次；（6）留取水相，加入兩倍體積預(yù)冷的無水乙醇和1/10體積3M醋酸鈉，-20℃保存1h；（7）離心12 000g，0℃，10min；（8）加入 75%乙醇 1mL 洗滌 1次，12 000g，0℃，離心 5min，棄上清，空氣干燥；（9）所得DNA溶于50μL TE溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 蝸神經(jīng)核mtDNA提取 兩組大鼠麻醉立即斷頭，于中線處剪開顱骨，將腦組織輕輕從顱骨中取出，注意保留雙側(cè)小腦旁絨球以定位蝸神經(jīng)核。蝸神經(jīng)核定位：根據(jù)Georage Paxinos and Charles Watson[11]制定的定位方法，蝸神經(jīng)核位于延髓嘴側(cè)端的背外側(cè)面，包括背側(cè)核和腹側(cè)核。解剖中以小腦旁絨球?yàn)槎ㄎ粯?biāo)志，如圖1（封二）。取腦組織（蝸神經(jīng)核）100mg，同一只大鼠兩側(cè)蝸神經(jīng)核混合到一起作為一個(gè)樣本，置入勻漿器中，加入2mL勻漿液（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.1mmol/L，0.01mol/L 蔗糖）勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。勻漿液4℃離心1000g 10min，取上清0℃離心12 000g 15min，棄去上清，沉淀物即為腦組織線粒體。腦線粒體DNA提取步驟同內(nèi)耳組織。取2μL DNA樣本溶液稀釋至50μL，用紫外線核酸檢測(cè)儀器檢測(cè)A260/A280純度值并測(cè)定其濃度大小。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) PCR引物設(shè)計(jì)：根據(jù)大鼠線粒體基因序列，利用Primer premier 5.0分析設(shè)計(jì)，由大連寶生生物工程有限公司（TaKaRa）幫助合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

實(shí)時(shí)定量熒光 PCR反應(yīng)體系為 25μL，DNA 3μL，每個(gè)引物 0.5μL（10μm/L），SYBR 12.5μL，無菌蒸餾水 8.5μL。反應(yīng)條件:首次94℃預(yù)變性 2min，然后94℃變性30s，68℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)，根據(jù)溶解曲線檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物特異型，根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線確定CT值，保存數(shù)據(jù)及圖片。

表1 引物設(shè)計(jì)

表1 引物設(shè)計(jì)

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2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS17.0。使用相對(duì)定量法（2-△△Ct）對(duì)mtDNA4834進(jìn)行定量分析，以β-actin為內(nèi)參基因，目的基因的表達(dá)量即mtDNA4834bp普遍缺失量?！鳌鰿t值=實(shí)驗(yàn)組△Ct值-對(duì)照組△Ct，2-△△Ct值，表示實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)量與對(duì)照組目的基因表達(dá)量比值，即目的基因mtDNA4834bp 缺失率。計(jì)量資料以（x±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 用藥前后ABR反應(yīng)閾改變 用藥后實(shí)驗(yàn)組ABR 反應(yīng)閾閾移為（3.91±3.73）dB peSPL，對(duì)照組ABR 反應(yīng)閾閾移為（9.64±2.59）dB peSPL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖 2（封二）；ABR 閾移圖形見圖3（封二）。

3.2 蝸神經(jīng)核和內(nèi)耳組織mtDNA4834bp缺失率實(shí)驗(yàn)組大鼠蝸神經(jīng)核與內(nèi)耳組織mtDNA4834bp缺失率分別為（0.2466±0.1335）、（0.3507±0.1588）；對(duì)照組大鼠蝸神經(jīng)核與內(nèi)耳組織mtDNA4834bp缺失率分別為（1.0461±0.3423）、（1.0202±0.2269），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 4（封二）。

3.3 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 RT-PCR后，取擴(kuò)增產(chǎn)物10μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以溴化乙錠染色，電壓100V，電泳30min后行凝膠成像掃描結(jié)果，見圖 5（封二）。

4 討論

4.1 線粒體DNA缺失突變和聽力損失關(guān)系 老年性聾是機(jī)體衰老過程在聽覺器官的表現(xiàn)。研究[12]發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA突變與老年性聾的發(fā)生關(guān)系密切。人類mtDNA在8483～13459bp之間存在著13bp的重復(fù)序列，在氧化應(yīng)激刺激下，容易發(fā)生斷裂，在修復(fù)時(shí)由于兩端重復(fù)序列，產(chǎn)生DNA兩條鏈下游環(huán)，該堿基環(huán)富含鳥嘌呤堿基，對(duì)自由基極其敏感，一旦受到ROS攻擊，該環(huán)降解即容易導(dǎo)致“誤認(rèn)”，發(fā)生4977bp片段缺失，此機(jī)制被稱為線粒體重組滑行錯(cuò)配學(xué)說[13]。大鼠 mtDNA8103～12937bp之間也存在16bp的直接重復(fù)序列，故大鼠也存在類似缺失突變（mtDNA4834bp）的常見缺失（common deletion，CD）。該缺失突變編碼包括 ND3、ND4、NDS、COⅢ、ATPaseB、ATPase6等[14]基因，影響呼吸鏈有關(guān)亞單位蛋白的合成，從而形成有缺陷的呼吸鏈，ATP產(chǎn)生不足導(dǎo)致蝸內(nèi)離子失平衡，內(nèi)環(huán)境紊亂，最終導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞非特異性損害，引起聽力下降[15]。Bai等[16]報(bào)道，在老年聾患者的顳骨中發(fā)現(xiàn)mtDNA4977缺失發(fā)生率為82.4%（14/17），而正常聽力對(duì)照組的顳骨mtDNA4977缺失率為47.1%（8/17），兩組間差異顯著，提示mtDNA4977缺失與老年聾的可能關(guān)系。戴樸等[17]檢測(cè)了老年人顳骨mtDNA4977缺失，發(fā)現(xiàn)老年聾患者的mtDNA4977缺失發(fā)生率高于老年對(duì)照組。大量研究發(fā)現(xiàn)老年性聾患者線粒體DNA4977bp缺失突變發(fā)生率比相同年齡的正常人高。劉紅[18]在檢測(cè)老年性耳聾患者毛干中mtDNA4977bp突變率時(shí)發(fā)現(xiàn)，重度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（33.68±10.30）%，輕度耳聾患者線粒體DNA缺失量為（11.97±4.12）%。劉俊等[19]在研究大鼠腦內(nèi)耳組織mtDNA時(shí)發(fā)現(xiàn)mtDNA4834片段缺失率為60%，在青年組大鼠未發(fā)現(xiàn)mtDNA4834的缺失。

4.2 銀杏葉提取物作用機(jī)制探討 中藥銀杏（ginkgo biloba）屬銀杏科，是我國(guó)的特產(chǎn)植物。早在1975年，人們就將銀杏葉提取物（EGB761）應(yīng)用于臨床。在衰老過程中，因抗氧化物酶活性下降以及自身DNA 堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）的衰退，導(dǎo)致大量ROS不能完全被清除而在機(jī)體中積累下來[20]。不斷累積的ROS破壞生物膜產(chǎn)生丙二醛（malonaldehyde，MDA），同時(shí)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）活性隨著年齡增長(zhǎng)而降低，所以一般用MDA、SOD、GPX作為反映老化的指標(biāo)，反映機(jī)體氧化損傷的程度[21]。研究證實(shí)，銀杏葉提取物治療后血清SOD、GSH顯著升高，MDA明顯下降，提示該藥物能清除體內(nèi)過多的自由基，抑制細(xì)胞膜的脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生過氧化反應(yīng)作用[22]。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)耳耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)退變是老年性耳聾的關(guān)鍵。其具體病理變化主要包括四個(gè)方面[23]：（1）耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)纖維退變及變性；（2）耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞萎縮消失，同時(shí)伴隨支持細(xì)胞的減少；（3）血管紋基底膜增厚、鈣化、變性導(dǎo)致彈性減退引起能量傳導(dǎo)減少且ATP產(chǎn)生不足；（4）聽覺中樞相對(duì)應(yīng)的核團(tuán)細(xì)胞萎縮，減少及神經(jīng)纖維變性。銀杏葉提取物對(duì)耳鳴和耳聾的藥理作用主要包括：（1）降低血液黏稠度，增加內(nèi)耳血流，改善耳蝸血流變情況，降低毛細(xì)胞損傷程度，從而保護(hù)內(nèi)耳毛細(xì)胞，改善聽力[24]；（2）具有抗氧化作用，清除過多自由基，保護(hù)細(xì)胞膜，從而保護(hù)線粒體功能[25]；（3）具有增加缺血組織對(duì)氧氣和葡萄糖的供應(yīng)量，促進(jìn)其對(duì)氧的利用率[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)組大鼠蝸神經(jīng)核、內(nèi)耳組織mtDNA4834b缺失率較對(duì)照組降低（P＜0.05），表明銀杏葉提取物能夠顯著減低mtDNA4834bp缺失率，且實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組ABR聽閾閾值明顯減?。≒＜0.01），表明銀杏葉提取物能延緩老齡大鼠聽功能下降，提示銀杏葉提取物可以改善線粒體功能，延緩衰老。

綜上所述，銀杏葉提取物能夠清除自由基，減少線粒體DNA缺失突變，保護(hù)線粒體功能，改善聽力，延緩老年聾的發(fā)生發(fā)展損傷，從而達(dá)到治未病目的。因此，研究銀杏葉提取物對(duì)聽覺器官線粒體DNA缺失突變的影響，對(duì)老年聾的防治有重要的意義，且與治未病的理念相一致。

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Effect of Ginkgo Biloba Extract on Mitochondrial DNA4834bp Deletion in the Inner Ear and Cochlear Nucleus of the Brain of Rats

HUANG Hailin1,LIU Jun2

1 Department of Ear-Nose-Throat,Jinhua Central Hospital,Jinhua(321000),China;2 Department of Ear-Nose-Throat,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310000),China.

ObjectiveTo investigate the effect of Ginkgo Biloba（EGB761） extract on mitochondrial DNA4834bp deletion in inner ear tissue and cochlear nucleus of the brain.MethodsTwenty SD rats at 24 months of age were randomly divided into two group:experimental group（EGB761 group,n=10）,which were

gastric infusion of EGB761 at the concentration of 100mg（/kg·d）for 12 weeks and control group（saline group,n=10）,which were infused the same volume saline.All rats were sacrificed at the end of treatment.Auditory brainstem response（ABR） was detected before and after the treatment.The deletion of mitochondrial DNA4834bp in the inner ear and cochlear nucleus of the brain was respectively identified by real-time PCR and its relationship with the ABR threshold shift was observedResultsA significant difference in ABR threshold shift was found between the experimental groupand control group （3.91±3.73dB peSPL vs 9.64±2.59dB peSPL,P＜0.05）.The mitochondrial DNA 4834bp common deletion mutation in cochlear nucleus and the inner ear of experimental group was both lower than those in the control group（0.2466±0.1335 vs 1.0461±0.3432;0.3507±0.158 vs 1.0202±0.2269;P＜0.05）.ConclusionEGB761 can inhibit the increaseof mitochondrial DNA deletion in the inner ear and cochlear nucleus of the brain to retard presbycusis in the aged rats by protecting mitochondrial DNA from oxidative damage.

rats;presbycusis;EGB761;oxidative damage;mitochondrial DNA4834bp;inner ear;cochlear nucleus

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009CB017）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009B120）

1浙江省金華市中心醫(yī)院耳鼻喉科（金華 321000）；2浙江省中醫(yī)院耳鼻喉科（杭州310000）

劉俊，E-mail：liujunmn18@sina.com

（收稿：2017-03-09 修回：2017-04-26）

老年性耳聾（presbycusis）是指隨著年齡的增長(zhǎng)，雙耳逐漸出現(xiàn)的感音神經(jīng)性耳聾，主要是以高頻聽力下降為主的聽力損失，又稱為年齡相關(guān)性聽力損失（age-related hearing loss，AHL）[1]。隨著人口老齡化，老年性聾已成為當(dāng)今世界共同面臨的問題，是成人聽力障礙的最常見原因。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，美國(guó)70歲以上的老年人中60%伴有聽力障礙，而超過80歲老人中聽力障礙達(dá)到80%以上[2]，這使老年人的生活質(zhì)量明顯下降，因此，對(duì)老年聾的防治工作具有重要意義。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為老年聾的發(fā)生機(jī)制主要包括遺傳因素和環(huán)境因素[3]，但具體病因迄今尚未闡明。線粒體（mt）作為細(xì)胞的能量工廠，在產(chǎn)生能量同時(shí)可產(chǎn)生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[4]。大量的ROS堆積使mtDNA受到氧化損害，發(fā)生大片段缺失突變，最終導(dǎo)致內(nèi)耳ATP產(chǎn)生不足，線粒體功能紊亂，造成不可逆聽力損失[5]。雖然生物體衰老過程無法避免，但我們可以通過干預(yù)措施減少ROS對(duì)線粒體的氧化損傷，從而減少和預(yù)防DNA突變的發(fā)生，延緩衰老[6]。研究[7]表明，銀杏葉提取物具有多種生理活性，其中主要成分銀杏內(nèi)酯類具有拮抗血小板活化因子（PAF）、改善血流動(dòng)力學(xué)與血液流變學(xué)作用；而銀杏黃酮主要作用是直接捕捉和清除超氧陰離子、氧自由基等活性氧，阻斷和終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，發(fā)揮抗脂質(zhì)過氧化，并能抑制自由基的產(chǎn)生[8]。研究[9]表明，銀杏葉提取物（EGb761）能減少老齡大鼠內(nèi)耳血管紋損傷，保護(hù)聽力，延長(zhǎng)衰老進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)觀察銀杏葉提取物對(duì)老年大鼠線粒體DNA缺失突變的影響及作用機(jī)制。