丁香等29種植物提取物抑菌活性的篩選1)

姚翰文 葛康康 潘佳亮 劉偉璐 馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

丁香等29種植物提取物抑菌活性的篩選1)

姚翰文 葛康康 潘佳亮 劉偉璐 馬玲

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

采用生長速率法測定了29種植物乙醇提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑制作用，篩選出抑菌效果較好的植物提取物，并對(duì)2種病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，得出抑菌效果最優(yōu)的植物提取物，使用光學(xué)顯微鏡觀察植物提取物處理后的油茶炭疽病菌菌絲形態(tài)變化。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，丁香和牡丹提取物對(duì)2種病原菌抑制效果明顯高于其他植物提取物，丁香提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑菌率均為100%，牡丹提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病的抑菌率分別為(93.81±0.51)%和100%；室內(nèi)毒力試驗(yàn)中，丁香和牡丹提取物對(duì)山核桃干腐病的抑菌中濃度值(CE50)分別為2.566和10.268 g/L，對(duì)油茶炭疽病的CE50值分別為1.005和10.988 g/L，由它們的抑菌中濃度值可知，相同質(zhì)量濃度時(shí)，丁香對(duì)2種病原菌抑菌效果更好；顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，丁香提取物處理后油茶炭疽病菌菌絲出現(xiàn)菌絲隔的數(shù)目增多，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體減少，液泡增多等形態(tài)變化。

植物源農(nóng)藥；植物提取物；丁香；山核桃干腐??；油茶炭疽??；抑菌活性；室內(nèi)毒力

在人類的生產(chǎn)生活中，自古就有利用植物源物質(zhì)作為農(nóng)藥的歷史[1]。長期持續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)對(duì)環(huán)境和生物產(chǎn)生危害，而且由于耐藥性的產(chǎn)生效果逐漸減弱，農(nóng)藥的殘留也給生態(tài)環(huán)境帶來許多負(fù)面影響。由于農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)和危害，法律政策的限制也越來越嚴(yán)格[2]。因此，植物源農(nóng)藥作為一種具有選擇性高、對(duì)非靶標(biāo)生物安全、低毒環(huán)保、綠色健康、易于降解、不易產(chǎn)生抗性、促進(jìn)提高抗病性等優(yōu)點(diǎn)的新型農(nóng)藥，逐漸為人們重視和青睞，成為了農(nóng)藥領(lǐng)域的“新寵”[3-5]。

植物體內(nèi)有超過40萬種的活性成分，如生物堿類、酚類、黃酮類、糖苷類、蛋白質(zhì)類、有機(jī)酸類、醌類、甾類、菇烯類及植物揮發(fā)油等，這些化合物的靶標(biāo)具有廣譜性，其中許多具有殺蟲或抑菌活性。據(jù)報(bào)道，約有2 400種植物可作為植物源農(nóng)藥的研究材料，其中有超過1 300種植物具有抑菌活性，從豐富的植物資源中篩選開發(fā)更優(yōu)的抑菌植物成為植物源農(nóng)藥領(lǐng)域的主要發(fā)展趨勢[6]。

山核桃干腐病是由以弱寄生菌(Botryosphaeriadothidea)為代表的葡萄座腔菌屬的真菌引起的一種重要病害，在山核桃大面積栽植中會(huì)造成枯枝枯樹、削弱樹勢等現(xiàn)象，從而降低山核桃的產(chǎn)量，對(duì)山核桃的栽培威脅很大，目前對(duì)于山核桃干腐病的防治主要依靠化學(xué)殺菌劑，如愛苗乳油、402抗菌劑乳油、乙蒜素乳油和硫酸銅晶體等[7-8]。油茶炭疽病的主要病原菌為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，會(huì)引起油茶的落花、落果、枯枝等，在油茶種植地區(qū)危害很大，是油茶的主要病害之一[9-10]。目前油茶炭疽病的防治主要采用化學(xué)藥劑防治，如多菌靈、波爾多液和茶枯水等[11]。有研究報(bào)道，撲菌清、葉斑凈、寶寧、百菌清、百菌通和甲基托布津等化學(xué)藥劑也可有效防治油茶炭疽病[12-13]。這2種真菌病害在我國林業(yè)生產(chǎn)中造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)它們的防治方法均以化學(xué)農(nóng)藥為主，使用植物源農(nóng)藥進(jìn)行生物防治的技術(shù)仍處于起步階段。

本研究根據(jù)查閱相關(guān)文獻(xiàn)篩選出29種抑菌植物作為試驗(yàn)對(duì)象，使用植物乙醇提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病2種病原菌進(jìn)行抑菌活性篩選，旨在發(fā)現(xiàn)抑菌效果較好的抑菌植物，為新型植物源農(nóng)藥的研發(fā)提供一定的線索及理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)所用植物樣品詳見表1。表1中植物樣品均采購于中藥店，置于烘箱中60 ℃烘干，粉碎，過40目(孔徑0.37 mm)篩，裝袋標(biāo)記，冰箱4 ℃低溫保存，備用[14]。

供試病原真菌為山核桃干腐病病原菌(Botryosphaeriadothidea)和油茶炭疽病病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)，均由東北林業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供。

無水乙醇為市售分析純。

1.1 植物提取物的制備

取每種植物材料10 g于500 mL錐形瓶中，每瓶加入200 mL預(yù)先配制好的90%乙醇溶液，超聲波提取60 min，避光靜置，減壓抽濾收集所得濾液，將剩余植物殘?jiān)侔凑丈鲜霾僮髦貜?fù)提取2次，合并3次超聲提取所得濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸干，用10%乙醇溶液溶解旋干物，并定容至20 mL，此時(shí)干物質(zhì)質(zhì)量濃度為0.05 g/L，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆肹15]。

1.2 植物提取物的提取率測定

將上述所得干物質(zhì)質(zhì)量濃度為0.05 g/L的植物提取物，各取出500 μL置于預(yù)先測定質(zhì)量的葡萄糖瓶中，將小瓶置于冰箱中-80 ℃冷凍，再用冷凍干燥儀將瓶中溶液干燥至恒質(zhì)量，取出各瓶，再次測量各葡萄糖瓶質(zhì)量，計(jì)算每個(gè)葡萄糖瓶前后的質(zhì)量差即為500 μL提取液中提取物的質(zhì)量，從而得到每種植物樣品的提取率。

1.3 抑菌活性篩選測定

采用菌絲的生長速率法[16]測定29種供試植物乙醇提取物對(duì)兩種病原菌菌絲生長的抑制活性：在無菌的超凈工作臺(tái)中，使用移液器取植物提物液2 mL，加入到48 mL已經(jīng)融化好的PDA培養(yǎng)基中，搖晃均勻，制成質(zhì)量濃度為20 g/L的帶藥培養(yǎng)基，將帶藥培養(yǎng)基趁熱倒入直徑為8.5 cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入15 mL，制備帶藥平板，自然冷卻，使用直徑為0.6 cm打孔器在供試病原菌平板的菌落邊緣制備菌餅，用接種針將菌餅菌絲面朝下放入帶藥平板中央，封好后置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每種處理組3個(gè)重復(fù)。待對(duì)照組菌絲生長到培養(yǎng)皿底部2/3時(shí)測量數(shù)據(jù)。陰性對(duì)照組是將等量溶劑加入至48 mL融化的PDA培養(yǎng)基中，陽性對(duì)照組為等量無菌水加入至48 mL融化的PDA培養(yǎng)基中，制備平板，接菌。采用十字交叉法測量菌落直徑，使用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件處理得到抑菌率。

抑菌率=((陰性對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(陰性對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑))×100%

1.4丁香和牡丹提取物對(duì)兩種病原菌的室內(nèi)毒力測定

將不同量的丁香提取液和牡丹提取液加入PDA培養(yǎng)基中制成系列質(zhì)量濃度梯度的帶藥平板，接種病原菌菌餅，培養(yǎng)。陰性對(duì)照組為加入對(duì)應(yīng)等量溶劑的平板，質(zhì)量濃度分別對(duì)應(yīng)各帶藥平板質(zhì)量濃度。十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率，使用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件得到兩種植物提取物分別對(duì)2種病原菌的毒力回歸方程和CE50值[17]。

1.5丁香提取物處理后對(duì)油茶炭疽病菌絲顯微鏡觀察

根據(jù)丁香植物提取物對(duì)2種病原真菌的CE50值，由于油茶炭疽病的CE50值較小，以油茶炭疽病為例，將丁香提取液制成質(zhì)量濃度為CE50值的帶藥平板，對(duì)照組為加入等量溶劑的PDA平板，接菌培養(yǎng)。將菌絲固定制成臨時(shí)玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

2 結(jié)果與分析

2.1供試植物提取物對(duì)兩種病原菌菌絲的抑制作用

采用生長速率法測定了29種植物提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病兩種林業(yè)病害真菌的抑制作用(表1)。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)，各供試植物提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病均有一定的抑制作用。其中，丁香、牡丹、甘草、黃芩、羌活、升麻、川芎、桑和黃連等9種植物提取物對(duì)山核桃干腐病有較好的抑制作用，抑菌率均在60%以上。丁香提取物對(duì)山核桃干腐病病原菌的抑菌率達(dá)到100%，提取率為27.41%；牡丹提取物抑菌率為(93.81±0.51)%，提取率為20.24%，這兩種植物提取物對(duì)山核桃干腐病病原菌有著明顯優(yōu)于其他供試植物提取物的抑菌效果。此外，甘草和黃芩兩種植物提取物對(duì)山核桃干腐病抑菌效果也較好，分別為(82.91±1.35)%和(80.46±0.21)%；八角、決明、薄荷、肉桂和蒼耳等5種植物提取物抑菌效果較差，均低于20%，肉桂和蒼耳提取物的抑菌率僅為(9.24±3.58)%和(2.17±3.67)%。

對(duì)油茶炭疽病病原菌的抑制效果中，丁香、牡丹、黃連、石榴皮、黃芩、八角、藿香、知母、苦參和升麻等10種植物提取物抑菌效果較好，抑菌率均在60%以上。丁香和牡丹兩種植物提取物的抑菌率都高達(dá)100%，黃連和石榴皮抑菌率分別為(96.67±0.21)%和(92.31±2.23)%，黃芩提取物的抑菌率也可達(dá)(80.13±1.77)%，白頭翁和蘆葦?shù)囊志Ч^差，分別為(19.37±1.35)%和(9.92±3.69)%。綜合兩種病原菌抑菌率結(jié)果，可以得出丁香和牡丹提取物對(duì)兩種病原真菌的抑菌效果均明顯優(yōu)于其他供試植物，黃芩、黃連和升麻的抑菌效果也相對(duì)較好。

表1 不同植物提取物對(duì)2種病原菌的抑制作用及提取率 %

注：表中數(shù)據(jù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列不同小寫字母表示不同植物提取物處理組之間在0.05水平存在顯著差異(n=3)。

2.2 丁香和牡丹提取物對(duì)兩種病原菌的室內(nèi)毒力

丁香和牡丹提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病兩種病原菌的毒力回歸方程和CE50值見表2。對(duì)山核桃干腐病病原菌的室內(nèi)毒力結(jié)果顯示，丁香和牡丹的CE50值分別為2.566和10.268 g/L，丁香的CE50值低于牡丹，所以相同質(zhì)量濃度條件下，丁香提取物比牡丹提取物抑菌毒力強(qiáng)。同樣的，對(duì)于油茶炭疽病病原菌的室內(nèi)毒力結(jié)果顯示，丁香CE50值1.005 g/L，低于牡丹CE50值10.988 g/L，相同質(zhì)量濃度條件下，丁香提取物抑菌效果也比牡丹提取物好。綜合兩種病原真菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果，丁香比牡丹抑菌效果更好，更有潛力開發(fā)為植物源殺菌劑(圖1)。

表2丁香和牡丹兩種植物提取物對(duì)兩種病原菌的室內(nèi)毒力測定

病原真菌植物提取物毒力回歸方程CE50值/g·L-1相關(guān)系數(shù)山核桃干腐病丁香y=-1.627+0.634x2.5660.980山核桃干腐病牡丹y=-1.317+0.128x10.2680.982油茶炭疽病丁香y=-0.970+0.965x1.0050.973油茶炭疽病牡丹y=-0.509+0.46x10.9880.971

2.3 丁香提取物處理后油茶炭疽病菌絲形態(tài)變化

抑菌中濃度(CE50)條件下，丁香提取物對(duì)油茶炭疽病病原菌菌絲的影響見圖2。由圖2對(duì)比顯示，相比于油茶炭疽病的正常菌絲形態(tài)，經(jīng)丁香提取物處理后，菌絲形態(tài)發(fā)生變化，呈現(xiàn)菌絲隔的數(shù)目增多，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體減少，液泡增多等。由此推斷丁香提取物對(duì)油茶炭疽病的抑菌效果會(huì)在病原菌菌絲形態(tài)變化上有所體現(xiàn)，但具體更深層次的觀察包括掃描電鏡，透射電鏡等，會(huì)在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)行，并驗(yàn)證。

①為丁香提取物處理山核桃干腐病；②為牡丹提取物處理山核桃干腐病；③為丁香提取物處理油茶炭疽病；④為牡丹提取物處理油茶炭疽??；A—E為提取物質(zhì)量濃度從高到低順序，CK為對(duì)照組。

圖1不同質(zhì)量濃度丁香和丹皮提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病的病原菌菌絲抑制效果

①為正常形態(tài)菌絲形態(tài)；②為處理后菌絲形態(tài)。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)測定了29種植物提取物對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病這兩種病原菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)丁香和牡丹2種提取物對(duì)兩種病原菌的抑制效果明顯高于其他供試植物提取物，使用丁香和牡丹提取物對(duì)2種病原真菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明相同質(zhì)量濃度時(shí)，丁香提取物抑菌效果優(yōu)于牡丹提取物，認(rèn)為本研究的29種植物提取物抑菌初篩中最優(yōu)的植物提取物為丁香提取物。通過光學(xué)顯微鏡觀察丁香處理后油茶炭疽病菌絲形態(tài)，呈現(xiàn)菌絲隔的數(shù)目增多，細(xì)胞內(nèi)原生質(zhì)體減少，液泡增多等變化，推測其抑菌作用在菌絲形態(tài)上有所體現(xiàn)，更深入的研究，如掃描電鏡、透射電鏡等，會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果表明，丁香提取物和牡丹提取物對(duì)山核桃干腐病菌和油茶炭疽病菌均有較好的抑制作用，且這兩種植物提取物的提取率也較高，其中丁香提取物對(duì)兩種病原菌的毒力更強(qiáng)。郭新春等[18]研究發(fā)現(xiàn)，公丁香對(duì)棉花枯萎病、楊樹潰瘍病、油菜菌核病和小麥赤霉病這4種病原菌均有很高的抑制作用，結(jié)合本研究結(jié)果，丁香植物提取物具有一定的抑菌廣譜性。周建宏等[19]研究表明，丁香枝和黃芩莖的水提取物對(duì)油茶炭疽病和油茶軟腐病均有較強(qiáng)抑制效果，這與本研究結(jié)果相符合，但抑菌率低于本研究抑菌率。對(duì)山核桃干腐病防治的研究多集中在化學(xué)農(nóng)藥方面，張傳清等[20]研究測定了7種化學(xué)殺菌劑對(duì)山核桃干腐病的抑制活性，結(jié)果由高到低依次為苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、腐霉利、甲基硫菌靈、百菌清、醚菌酯、啶酰菌胺，利用植物源農(nóng)藥防治山核桃干腐病的報(bào)道較少。

本研究對(duì)29種植物乙醇提取物的抑菌效果測定會(huì)存在一定的漏篩現(xiàn)象，可能是以下幾個(gè)原因：①供試植物樣品在60 ℃條件下烘干，可能導(dǎo)致植物中某些有效抑菌成分因揮發(fā)而遺失，或發(fā)生破壞。②由于供試植物樣品為市售中藥材，研究中只使用了植物的藥用部位，而不是整株植物，故會(huì)出現(xiàn)供試部位的漏篩。③由于考慮操作方便性，成本節(jié)約等，篩選試驗(yàn)中，只使用90%乙醇溶液這一種溶劑作為提取溶劑，且只用20 g/L這一個(gè)質(zhì)量濃度，可能導(dǎo)致部分有效抑菌物質(zhì)不能提取出來，或活性成分較少，在本供試質(zhì)量濃度下不能表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。④本研究針對(duì)兩種病原真菌進(jìn)行了測定，不能篩選出供試植物樣品中對(duì)其他病原真菌有較好抑制活性的植物，從而出現(xiàn)某種植物的漏篩。⑤本研究只是測定了植物提取物對(duì)兩種病原真菌菌絲生長的抑制作用，而未進(jìn)行對(duì)孢子萌發(fā)的測定和活體試驗(yàn)以及田間試驗(yàn)。

本研究篩選出了對(duì)山核桃干腐病和油茶炭疽病均有較好抑菌作用的植物提取物，雖只針對(duì)其中抑菌效果最優(yōu)的丁香提取物做了更深入的研究，但其他植物，例如牡丹，黃芩，黃連，升麻等，仍然也有深入研究并發(fā)展為有效植物源農(nóng)藥的潛力。本研究為山核桃和油茶的真菌病害防治提供了一定的線索，同時(shí)發(fā)掘了可能具有廣譜抑菌效果的丁香提取物，為丁香提取物抑菌的研究提供了理論依據(jù)。對(duì)丁香提取物主要抑菌活性成分以及其抑菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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ScreeningAntifungalActivityof29PlantExtractsincludingSyzygiumaromaticum

//Yao Hanwen, Ge Kangkang, Pan Jialiang, Liu Weilu, Ma Ling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)

The inhibitory effects of ethanol extracts of 29 plants onBotryosphaeriadothideaandColletotrichumgloeosporioideswere determined by the growth rate method. Two plant extracts with good antifungal effect were screened out and the laboratory toxicity of the two pathogens was tested to find out the better plant extract. After using the plant extract, the hyphae morphological changes ofC.gloeosporioideswere observed by optical microscopy. The inhibitory effects ofSyzygiumaromaticumextract andPaeoniasuffruticosaextract on the two pathogens were higher than that of other plant extracts at the concentration of 20 g/L. The inhibitory rates ofS.aromaticumextract on the two pathogens were both 100%, and the inhibitory rates ofPaeoniasuffruticosaextract onB.dothideaandC.gloeosporioideswere, respectively, (93.81±0.51)% and 100%. In the study of laboratory toxicity, theCE50of the extracts ofSyzygiumaromaticumandP.suffruticosaonB.dothideawere 2.566 and 10.268 g/L, and onC.gloeosporioideswere 1.005 and 10.988 g/L, respectively. Compared with the values ofCE50, at the same content, the inhibitory effect ofS.aromaticumextract on the two pathogens was better. By microscopic observation, there were changes in the morphology of hyphae ofC.gloeosporioides, involving the increased number of the septum of hyphae, the reduction of intracellular protoplast, and the increased vacuoles.

Botanical pesticides； Plant extracts；Syzygiumaromaticum；Botryosphaeriadothidea；Colletotrichumgloeosporioides； Antifungal activity； Laboratory toxicity

S482.2+92

1)林業(yè)公益行業(yè)專項(xiàng)(No.201304403-4)。

姚翰文，男，1993年8月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail：1040361540@qq.com。

馬玲，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail：Maling63@163.com。

2017年4月19日。

責(zé)任編輯：潘 華。

//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(10)：35-39.