一起菲律賓蛤仔出血病病原的鑒定

李啟蒙 朱貝貝 方 皓 劉金玉 郭志明 王雪鵬*

一起菲律賓蛤仔出血病病原的鑒定

李啟蒙①朱貝貝①方 皓①劉金玉①郭志明①王雪鵬①*

（①山東農業(yè)大學動物科技學院 山東 泰安 271018 ②山東省即墨市海洋與漁業(yè)局）

本文從山東某菲律賓蛤仔養(yǎng)殖區(qū)發(fā)病菲律賓蛤仔和養(yǎng)殖水體中分離到一株優(yōu)勢菌，人工感染試驗結果顯示，該菌能引起供試菲律賓蛤仔發(fā)病，死亡率為66.7%，且發(fā)病癥狀與原發(fā)病癥狀相同，提示該菌是引起菲律賓蛤仔死亡的主要致病菌。本研究對該菌形態(tài)、生理生化特征、16SrDNA及致病性進行了初步分析。結果顯示，該菌株為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。因此，該例菲律賓蛤仔出血病是由溶藻弧菌感染引起的。

菲律賓蛤仔 溶藻弧菌 生理生化 致病性

菲律賓蛤仔是我國沿海常見的一種重要經濟貝類，因其肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，深受國內外消費者歡迎，是出口創(chuàng)匯的重要水產品之一。但是近十幾年來，隨著菲律賓蛤仔養(yǎng)殖規(guī)模的逐年擴大，養(yǎng)殖環(huán)境惡化導致微生物疾病的流行而引發(fā)的養(yǎng)殖菲律賓蛤仔的大規(guī)模死亡屢屢發(fā)生，已造成巨大的經濟損失，而弧菌(Vibrios)是導致菲律賓蛤仔發(fā)病的主要致病菌。本研究對發(fā)病菲律賓蛤仔優(yōu)勢菌株進行分離、鑒定，并進行人工感染試驗和藥物敏感性分析，探討分析導致山東菲律賓蛤仔大規(guī)模死亡的病原，旨在為菲律賓蛤仔疾病研究提供理論依據，為菲律賓蛤仔健康養(yǎng)殖提供一些參考資料。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病菲律賓蛤仔 于2017年8月份山東菲律賓蛤仔發(fā)

病高峰期，采集瀕臨死亡、病狀特征明顯的菲律賓蛤仔?；疾》坡少e蛤仔，表面粘液較少、表皮部分脫落，解剖發(fā)現外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多。

1.2 分離方法 無菌鹽水洗凈，用70%的酒精棉球對體表擦拭消毒，無菌手術刀開啟，取肝胰臟等部位無菌勻漿器中勻漿處理，zobell 2216E平板和TCBS平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24h后，選取優(yōu)勢菌落進行重復劃線純化，純培養(yǎng)物于4℃冰箱中保存。

1.3 人工感染試驗 人工感染試驗在20L水族箱中進行，條件為溫度28℃，鹽度26.4，pH8.2，連續(xù)充氣，每組放16只2cm大小的菲律賓蛤仔。換水1次/d，試驗組調節(jié)水體中細菌濃度為108cfu/ml，每日投單胞藻1次；對照組不加入菌體，按上述方法飼養(yǎng)；連續(xù)觀察12d，紀錄死亡狀況，并進行解剖和病原的再分離以確定是否死于攻毒活菌引起的感染。

1.4 細菌生化鑒定 按一般細菌常用鑒定方法[6]進行分離菌的生物學性狀測定，包括革蘭氏染色、形態(tài)觀察、生理生化特性測定(所用試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司)。

1.5 16SrDNA克隆、測序 采用細菌16SrDNA序列擴增的通用引物對純培養(yǎng)的細菌16S rDNA序列進行PCR擴增。正向引物為5'- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，反向引物為5' AAGGAGGTGWTCCAR CC-3'。所得PCR產物經純化后送上海生物工程有限公司進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 細菌分離及其形態(tài)特征 經分離純化后，從病蛤中分離到1株優(yōu)勢菌，分離到的菌株均為革蘭氏陰性直桿菌(圖1)，菌體直或稍彎，無莢膜，靠鞭毛運動。在TCBS(硫代硫酸鈉-檸檬酸鹽-膽鹽)瓊脂平板上培養(yǎng)18h后，該分離菌株形成黃色扁平的大菌落(圖1-2)。

圖1 革蘭氏染色顯微鏡觀察(1000x)

圖2 分離菌在TCBS上的生長特性

2.2 人工感染試驗 人工感染7d后，菲律賓蛤仔開始出現死亡，9d后全部死亡，病死率為100%。于是初步判定2015年8月山東某養(yǎng)殖區(qū)菲律賓蛤仔大批死亡主要是以該分離菌為主要病原體的傳染病所造成。

2.3 分離菌株生化特性 細菌分離株在40℃以上和4℃以下不生長，無鹽不生長，其生活特性見表1，根據表1可以可以看出，這些特性與相關文獻對溶藻弧菌的描述基本一致，認為該分離菌為溶藻弧菌，命名為Crazy-1。

表1 分離菌生化特征及其與標準溶藻弧菌的比較

2.4 16SrDNA克隆、測序 對Crazy-1株16S rDNA序列進行進化樹分析PCR擴增，所得結果見圖3，進一步證實該菌為溶藻弧菌。

圖3 Crazy-1進化樹

3 討論

（1）溶藻弧菌感染海水養(yǎng)殖動物的報道比較多，但導致貝類病害發(fā)生的報道卻很少。本次樣品采集是在高水溫期，表明溶藻弧菌是容易高溫環(huán)境下生長并導致海水養(yǎng)殖動物的弧菌病，對分離出的菌株做了人工感染實驗，通過人工感染實驗可知，感染后的試驗菲律賓蛤仔出現明顯的病癥：表皮部分脫落、表面粘液較少，解剖發(fā)現外套膜萎縮，閉殼肌松弛、開合無力，有些發(fā)爛發(fā)白，軟體部消瘦，顏色淡紅，血管無色，部分病蛤腮黏液明顯增多，死亡率高達70%，從浸泡感染方式發(fā)病菲律賓蛤仔處分離到與自然發(fā)病相同的細菌，因此可以確定該分離株是菲律賓蛤仔發(fā)病的病原體。（2）菲律賓蛤仔主要養(yǎng)殖模式有淺海增殖、蝦貝混養(yǎng)等養(yǎng)殖模式，對于淺海增殖養(yǎng)殖模式，可以通過改善養(yǎng)殖環(huán)境、減小苗種密度等方式來預防該病的發(fā)生，對于蝦貝混養(yǎng)、池塘養(yǎng)殖等模式，可以在高溫季節(jié)投放二氧化氯、過硫酸氫鉀、腐植酸顆粒等消毒、改底的水環(huán)境改良劑來預防。調查發(fā)現，二氧化氯、過硫酸氫鉀、腐植酸顆粒等水環(huán)境改良劑可以降低水體中溶藻弧菌的含量，明細降低病害的發(fā)生。

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S944.4+7

A

1007-1733(2017)10-0006-02

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系貝類創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-14-07）

*通訊作者

2017–05–21）