浮床栽培魚腥草對吉富羅非魚血清免疫因子的影響

鄭 堯， 胡庚東， 裘麗萍， 趙志祥， 宋 超， 范立民， 孟順龍， 徐 跑①, 陳家長,3②

(1.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心/ 農業(yè)部長江下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心/農業(yè)部水產品質量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)， 江蘇 無錫 214081； 2.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院， 江蘇 無錫 214081； 3.農業(yè)部水產品質量安全控制重點實驗室， 北京 100141)

浮床栽培魚腥草對吉富羅非魚血清免疫因子的影響

鄭 堯1,2， 胡庚東1， 裘麗萍1， 趙志祥2， 宋 超1， 范立民1， 孟順龍1， 徐 跑1,2①, 陳家長1,2,3②

(1.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心/ 農業(yè)部長江下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心/農業(yè)部水產品質量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)， 江蘇 無錫 214081； 2.南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院， 江蘇 無錫 214081； 3.農業(yè)部水產品質量安全控制重點實驗室， 北京 100141)

為探究構建魚腥草-羅非魚共生體系能否對羅非魚(Oreochromisniloticus)產生免疫增強效應，研究池塘中浮床栽培魚腥草(Houttuyniacordata)(種植面積分別為0、5%、10%和15%)對不同免疫反應階段吉富羅非魚血清免疫因子的影響，測定免疫識別階段免疫球蛋白(IgM)和表皮生長因子(EGF)，炎癥反應階段相關因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-8(IL-8)，以及效應階段金屬硫蛋白(MT)和轉鐵蛋白(TRF)等指標。結果表明，10%魚腥草處理組吉富羅非魚血清EGF、IL-8、IL-10、TNF-α和TRF含量顯著高于其他處理組和對照組，5%魚腥草處理組吉富羅非魚血清IgM、IFN-γ含量顯著高于其他處理組和對照組，且沒有造成血清MT含量的降低。吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘種植魚腥草(5%)能顯著提高其不同免疫反應階段血清免疫因子的活性。

生物浮床； 魚腥草； 免疫因子； 吉富羅非魚

吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)是1993年后在菲律賓利用尼羅羅非魚的4個非洲品系和4個亞洲品系等廣泛的優(yōu)良種質資源選育而成的新品種,目前該品種已在海南、廣東、廣西、云南及蘇北地區(qū)大量養(yǎng)殖,已被諸多學者作為試驗魚類使用[1]。水體富營養(yǎng)化指水體中N、P等營養(yǎng)鹽含量過多而引起的水質污染現象[2],池塘養(yǎng)殖水體富營養(yǎng)化尤為嚴重,采用循環(huán)水和種植水上植物是水質凈化最常見的方式之一[3-4]。近幾年來,水上種植中草藥已被廣泛用于調控池塘水質和增強魚類免疫能力,優(yōu)點主要在于中草藥能治療(或預防)魚類的單殖吸蟲等疾病[5],且種植獲得的中草藥重金屬污染小。魚腥草(Houttuyniacordata)生長于陰濕處或山澗邊,在中國中部、東南至西南部各省區(qū)有大量種植,研究表明浮床栽培魚腥草不僅可以改善羅非魚池塘水質指標,還可明顯提高吉富羅非魚非特異免疫能力。

在魚類免疫反應中,胸腺和血液分別主要用于產生和運輸淋巴細胞,其增殖過程會產生免疫因子介導免疫反應。免疫反應可分為免疫識別、細胞因子增殖和效應階段。在免疫識別中,免疫球蛋白(immunoglobulin M,IgM)是魚類適應性體液免疫應答中最主要的介質[6];表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)刺激胸腺再生,加快淋巴T/B及吞噬細胞的生成(吞噬病毒病菌和癌細胞),提高機體免疫功能[7]。炎癥反應實質上是機體與促炎因子進行抗爭的反映,炎癥相關因子包括促炎因子(proinflammatory cytokines)和抗炎因子(antiinflammatory cytokines)。在炎癥細胞因子增殖階段,抗炎因子干擾素-γ(interferon γ,IFN-γ)和白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)分別在抗病毒感染、皮膚免疫和免疫功能調節(jié)中發(fā)揮重要作用[8],且后者是前者的抑制子[9]。促炎癥因子中,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)是一種能殺傷某些腫瘤細胞并使體內腫瘤組織發(fā)生壞死的因子[10],而白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)嗜中性粒細胞因子,是炎癥性疾病的重要介質,在抗感染、免疫反應調節(jié)以及抗腫瘤方面有重要作用。研究表明虹鱒腸黏膜組織中存在能夠合成IL-8、TNF-α和IFN-γ的功能細胞[11],用于抗菌、抗病毒等免疫反應中。在炎癥反應效應階段的諸多抗菌免疫因子中,金屬硫蛋白(metallothionein,MT)能夠調節(jié)機體必需重金屬的穩(wěn)態(tài)及對有害重金屬進行解毒,并起氧化應激防護作用[12];轉鐵蛋白(transferrin,TRF)負責機體中Fe3+在吸收、儲存和利用部位間的傳遞[13]。

針對魚腥草-羅非魚共生這一實例,探究種植魚腥草后其對吉富羅非魚血清不同免疫應答階段幾種免疫因子的影響,旨在從增強魚類免疫角度為魚腥草-羅非魚共生體系的應用前景及推廣提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗基地為中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭養(yǎng)殖基地。每口試驗用池塘面積為1 333 m2,水深1.5 m,并配備微孔增氧系統(tǒng)。養(yǎng)殖品種為“新吉富”羅非魚越冬種,平均投放規(guī)格為(42±2.1) g·尾-1,養(yǎng)殖密度為1 750尾·(667 m2)-1,同時搭配少量濾食性鰱(20尾·塘-1)、鳙(30尾·塘-1)。浮床植物選用魚腥草,試驗分4口塘進行種植,浮床面積占池塘面積比例分別為0、5%、10%和15%(圖1)。試驗于2015年5月開始,至10月結束。每天8:00定量投喂1次,飼料為天邦羅非魚膨化料(編號5532、5533、5534、5536),飼料投喂量為魚體質量的3%。養(yǎng)殖期間的病害防控及日常管理基本一致,除池塘水分滲漏、蒸發(fā)補水外,養(yǎng)殖過程中池塘不換水。

試驗選用PVC管材料(φ=50 mm)制作浮床,規(guī)格為2 m×2 m。浮床兩面分別用網孔為30 mm(便于魚腥草扦插)的網片包裹。試驗開始前,將預先培育好的魚腥草苗(株高20 cm),按株距30 cm×行距20 cm進行扦插,種植前根莖和葉總質量在43～129 g·m-2之間,收割后根莖和葉總質量在173～519 g·m-2之間,浮床集中固定在池塘中排列整齊,每3個浮床用尼龍繩連接成組。

1.2 不同階段幾種免疫因子測定

試驗結束后,從每個處理組中隨機挑選30 尾魚〔體質量(772.6±6.7) g,體長(316.0±4.6) mm〕,采集吉富羅非魚血液,冰箱中靜置24 h,3 000 r·min-1離心5 min(離心半徑為3 cm)后得到血清上清。免疫應答不同階段幾種免疫指標包括:(1)免疫識別:免疫球蛋白(IgM,檢測范圍0.05～10 mg·mL-1)、表皮生長因子(EGF,檢測范圍5～2 000 ng·L-1);(2)炎癥反應:干擾素-γ(IFN-γ,檢測范圍 5～1 000 ng·L-1)、白細胞介素-10(IL-10,檢測范圍2～600 ng·L-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α,檢測范圍3～900 ng·L-1)、白細胞介素-8(IL-8,檢測范圍0.5～200 ng·L-1);(3)效應階段:金屬硫蛋白(MT,檢測范圍0.05～20 ng·mL-1)和轉鐵蛋白(TRF,檢測范圍5～2 000 mg·L-1),其測定方法均按酶聯免疫試劑盒說明書進行,試劑盒購自于南京建成生物工程研究所。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

與對照組相比，5%、10%和15%魚腥草處理組吉富羅非魚血清IgM含量顯著提高(圖1,P<0.05)。5%、10%和15%處理組吉富羅非魚血清EGF含量均顯著高于對照組,5%處理組EGF含量顯著低于10%處理組,但顯著高于15%處理組(P<0.05)。

與對照組相比,5%、10%處理組吉富羅非魚血清IFN-γ含量顯著提高(圖2),且5%處理組顯著高于10%處理組。魚腥草處理組吉富羅非魚血清IL-10含量均顯著高于對照組,且5%處理組顯著低于10%處理組,顯著高于15%處理組。與對照組相比,5%、15%處理組吉富羅非魚血清TNF-α含量均顯著降低,但10%處理組吉富羅非魚血清TNF-α含量顯著高于對照組。魚腥草處理組吉富羅非魚血清IL-8含量均顯著提高,且5%處理組顯著低于10%處理組,顯著高于15%處理組。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理組間某指標差異顯著(P<0.05)。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理組間某指標差異顯著(P<0.05)。

與對照組相比，10%和15%處理組吉富羅非魚血清MT含量顯著降低(圖3),5%處理組與對照組沒有顯著差異。魚腥草處理組均顯著提高吉富羅非魚血清TRF含量,且5%處理組TRF含量顯著低于10%處理組,并顯著高于15%處理組。

同一幅圖中直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理組間某指標差異顯著(P<0.05)。

3 討論

魚類參加免疫應答的細胞主要有巨噬細胞和淋巴細胞,這些免疫細胞產生的細胞因子包括免疫識別階段的IgM(免疫應答)、EGF(促免疫細胞分化);炎癥反應相關的因子,如白細胞介素(參與免疫和炎癥過程)、IFN-γ(參與免疫調節(jié))和TNF-α(參與機體免疫調節(jié),巨噬細胞活化)等。炎癥反應相關的免疫因子之間能相互作用(如彼此間提供胞內信號)[14],如IFN-γ、TNF-α和白細胞介素共同參與促或抗炎癥反應。研究表明魚體在受到毒物(草甘膦)污染時,草魚IFN-γ、IL-1β(IL-1亞型)和TNF-α含量改變進而破壞魚類非特異性免疫能力[15]。該研究中,5%魚腥草處理組吉富羅非魚血清IgM、IFN-γ含量顯著高于其他處理組和對照組;10%魚腥草組血清EGF、IL-8、IL-10、TNF-α和TRF含量顯著高于其他處理組和對照組,這與之前的結果[15]相類似,與虹鱒受到病原菌(黃桿菌，Flavobacteriumpsychrophilum)感染時免疫器官中MT、IL1β和TNF-β基因表達量顯著改變的結果[16]相類似,一方面表明魚腥草種植后改變了吉富羅非魚血清中免疫因子含量,此外,這些均說明魚類免疫系統(tǒng)雖不如其他高等動物健全,但魚體在自身健康受到威脅時,不同階段的免疫因子可能會呈現不同的響應。至于促炎和抗炎因子之間如何平衡和調控[9，17],尚需要進一步研究。

吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘中種植魚腥草起到增強魚類免疫作用，可能主要是通過改善水質、釋放抗菌物質和根部被羅非魚啃食增強魚類免疫能力來實現。在水質改善方面,課題組的早期研究結果表明,吉富羅非魚在低濃度氨氮和亞硝酸鹽氮脅迫下,魚自身機體采取一種主動調節(jié)措施;但隨著氨氮和亞硝酸鹽氮濃度的升高,一些免疫相關酶活性(以氧化應激等為主)則呈下降趨勢[18]。大菱鲆在氨氮脅迫下MT、促炎癥因子(TNF-α和IL-1β)基因表達量顯著上升,但IgM和IGF-1基因表達量顯著下降[19]。10%魚腥草處理組促炎癥因子(TNF-α和IL-10)含量最高,且10%魚腥草處理組炎癥抑制因子(IFN-γ)顯著低于5%魚腥草處理組,說明較低種植面積的魚腥草(5%)就能刺激魚體巨噬細胞產生細胞因子,介導各種免疫反應。此外,5%魚腥草處理組血清IgM、EGF、TRF含量升高,MT含量沒有顯著降低,且TNF-α含量顯著降低(圖2)。這說明5%魚腥草種植能在不激發(fā)炎癥反應的同時,在免疫識別和效應階段增強魚類的免疫能力。

魚腥草根部釋放的化感物質如何提高吉富羅非魚的免疫能力？如何與免疫因子進行互作？在吞食魚腥草根系的情況下,吉富羅非魚如何提高其自身免疫能力?這些都是值得進行進一步研究的課題,這些研究將為開發(fā)池塘綜合種養(yǎng)技術提供新的思路。

4 結論

10%魚腥草處理組吉富羅非魚血清EGF、IL-8、IL-10、TNF-α和TRF含量顯著高于其他處理組和對照組,5%魚腥草處理組吉富羅非魚血清IgM、IFN-γ含量顯著高于其他處理組和對照組。吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘5%魚腥草種植面積能顯著提高不同免疫階段血清免疫因子活性的含量。

[1] 鄭堯,邴旭文,裘麗萍,等.浮床栽培魚腥草對吉富羅非魚膽汁液中八種免疫因子的影響[J].農業(yè)環(huán)境科學學報,2016,35(9):1680-1685.[ZHENG Yao,BING Xu-wen,QIU Li-ping,etal.Changes of Eight Biliary Immune Factors of GIFT Tilapia After Floating-Bed Cultivation ofHouttuyniacordataThunb[J].Journal of Agro-Environment Science,2016,35(9):1680-1685.]

[2] 胡庚東,宋超,陳家長,等.池塘循環(huán)水養(yǎng)殖模式的構建及其對氮磷的去除效果[J].生態(tài)與農村環(huán)境學報,2011,27(3):82-86.[HU Geng-dong,SONG Chao,CHEN Jia-zhang,etal.Modeling of Water Circulating Pond Aquaculture System and Its N&P Removal Effect[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2011,27(3):82-86.]

[3] 羅思亭,張飲江,李娟英,等.沉水植物與生態(tài)浮床組合對水產養(yǎng)殖污染控制的研究[J].生態(tài)與農村環(huán)境學報,2011,27(2):87-94.[LUO Si-ting,ZHANG Yin-jiang,LI Juan-ying,etal.Effect of Combination of Submerged Macrophyte With Ecological Floating Bed on Aquacultural Pollution Controlling[J].Journal of Ecology and Rural Environment,2011,27(2):87-94.]

[4] 王高學,徐鈺,王建華,等.29種天然植物提取物對指環(huán)蟲殺滅作用的研究[J].淡水漁業(yè),2006,36(3):3-8.[WANG Gao-xue,XU Yu,WANG Jian-hua,etal.Study on the Killing of the 29 Species of Plants Extraction to theDactylogyrus[J].Freshwater Fisheries,2006,36(3):3-8.]

[5] 肖凡書,聶品.魚類免疫球蛋白重鏈基因與基因座的研究進展[J].水產學報,2010,34(10):1617-1627.[XIAO Fan-shu,NIE Pin.Immunoglobulin Heavy Chain Genes and Their Loci in Fish:Progress and Perspectives[J].Journal of Fisheries of China,2010,34(10):1617-1627.]

[6] 朱文杰,黃桂菊,張東玲,等.合浦珠母貝表皮生長因子樣(EGF-like)基因的克隆與表達分析[J].水產學報,2015,39(5):648-657.[ZHU Wen-jie,HUANG Gui-ju,ZHANG Dong-ling,etal.Cloning and Expression of an Novel EGF-like Gene FromPinctadamartensii[J].Journal of Fisheries of China,2015,39(5):648-657.]

[7] 黃貝,陳善楠,黃文樹,等.斜帶石斑魚IFN-γ基因的克隆與表達分析[J].中國水產科學,2013,20(2):269-275.[HUANG Bei,CHEN Shan-nan,HUANG Wen-shu,etal.Molecular Characterization and Expression of Interferon Gamma (IFN-γ) in Orange-Spotted Grouper (Epinepheluscoioides)[J].Journal of Fishery Sciences of China,2013,20(2):269-275.]

[8] SCHINAGL A,THIELE M,DOUILLARD P,etal.Oxidized Macrophage Migration Inhibitory Factor is a Potential New Tissue Marker and Drug Target in Cancer[J].Oncotarget,2016,7(45):73486-73496.

[9] 蔡中華,宋林生,ZOU Jun,等.虹鱒腫瘤壞死因子(TNFα)基因體外表達與純化的研究[J].水生生物學報,2003,27(6):596-601.[CAI Zhong-hua,SONG Lin-sheng,ZOU Jun,etal.InvitroExpression and Purification of Rainbow Trout (Oncorhynchusmykiss)TNFα[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2003,27(6):596-601.]

[10] MULDER I E,WADSWORTH S,SECOMBES C J.Cytokine Expression in the Intestine of Rainbow Trout (Oncorhynchusmykiss) During Infection WithAeromonassalmonicida[J].Fish and Shellfish Immunology,2007,23(4):747-759.

[11] 馮仁勇,周小秋.魚類金屬硫蛋白基因的表達與調控[J].水產學報,2005,24(9):52-54.[FENG Ren-yong,ZHOU Xiao-qiu.The Expression and Control of Metallothionein Gene in Fish[J].Fisheries Science,2005,24(9):52-54.]

[12] CAIPANG C M,LAZADO C C,BRINCHMANN M F,etal.Infection-Induced Changes in Expression of Antibacterial and Cytokine Genes in the Gill Epithelial Cells of Atlantic Cod,Gadus Morhua During Incubation With Bacterial Pathogens[J].Comparative Biochemistry and Physiology B,2010,156(4):319-325.

[13] BISWAS G,KORENAGA H,NAGAMINE R,etal.Cytokine Mediated Immune Responses in the Japanese Pufferfish (Takifugurubripes) Administered With Heat-KilledLactobacillusparacaseispp.paracasei(06TCa22) Isolated From the Mongolian Dairy Product[J].International Immunopharmacology,2013,17(2):358-365.

[14] MA J G,LI X Y.Alteration in the Cytokine Levels and Histopathological Damage in Common Carp Induced by Glyphosate[J].Chemosphere,2015,128:293-298.

[15] ORIEUX N,DOUET D G,LE HéNAFF M,etal.Prevalence ofFlavobacteriumpsychrophilumBacterial Cells in Farmed Rainbow Trout:Characterization of Metallothionein A and Interleukin1-β Genes as Markers Overexpressed in Spleen and Kidney of Diseased Fish[J].Veterinary Microbiology,2013,162(1):127-135.

[16] ATWELL D M,GRICHNIK K P,NEWMAN M F,etal.Balance of Proinflammatory and Antiinflammatory Cytokines at Thoracic Cancer Operation[J].The Annals of Thoracic Surgery,1998,66(4):1145-1150.

[17] 臧學磊.三種環(huán)境因子脅迫下羅非魚(GIFTOreochromisniloticus)機體免疫力的變化及其對海豚鏈球菌易感性的影響[D].南京:南京農業(yè)大學,2010:43-44.[ZANG Xue-lei.The Immune Response of GIFTOreochromisniloticusand Its Susceptibility toStreptococcusiniaeUnder Stress in Three Environmental Factors[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2010:43-44.]

[18] JIA R,LIU B L,HAN C,etal.The Physiological Performance and Immune Response of Juvenile Turbot (Scophthalmusmaximus) to Nitrite Exposure[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Toxicology & Pharmacology,2016,181/182:40-46.

EffectsofCultivationofHouttuyniacordataonFloatingBedsonSerumalImmuneFactorsofGIFTTilapia.

ZHENG Yao1,2, HU Geng-dong1, QIU Li-ping1, ZHAO Zhi-xiang2, SONG Chao1, FAN Li-min1, MENG Shun-long1, XU Pao1,2, CHEN Jia-zhang1,2,3

[1.Freshwater Fisheries Research Center, Chinese Academy of Fishery Sciences/ Fishery Eco-Evironment Monitoring Center of Lower Reaches of Yangtze River, Ministry of Agriculture/ Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products on Environmental Factors(Wuxi), Ministry of Agriculture, Wuxi 214081, China; 2.Wuxi Fishery College of Nanjing Agricultural University, Wuxi 214081, China; 3.Key Laboratory of Quality and Safety Control for Aquatic Products, Ministry of Agriculture, Beijing 100141, China]

To explore whether the symbiont ofHouttuyniacordata(0, 5%, 10% and 15% in plant area) and GIFT tilapia may enhance immunological effects of serumal immune factors of the fish at different phases via pond cultivation of the plants on floating beds, immunoglobulin M (IgM), epidermal growth factor (EGF); iterferon-γ (IFN-γ), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-8 (IL-8); metallothionein (MT) and transferrin (TRF) of the fish was measured. Results show that the fish in the 10% group were significantly higher than those in any other groups in serumal EGF, IL-8, IL-10, TNF-α and TRF, and that the fish in the 5% group were significantly higher than those in any other groups in IgM and IFN-γ without showing any adverse effect on MT in the fish. Apparently, plantingHouttuyniacordataup to 5% in area in the fish pond of GIFT tilapia can significantly enhance activities of serumal immune factors at different phases of the immune reaction.

biological floating bed;Houttuyniacordata; immune factor;Oreochromisniloticus

2016-09-06

國家科技支撐計劃(2015BAD13B03); 現代農業(yè)產業(yè)技術體系專項(CARS-46); 中央級科研院所基本科研業(yè)務費(2015JBFR03)

① 通信作者E-mail: xup@ffrc.cn

② 共同通信作者E-mail: chenjz@ffrc.cn

X954

A

1673-4831(2017)10-0950-05

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.10.012

鄭堯(1986—),男,安徽安慶人,助理研究員,博士,研究方向為漁業(yè)生態(tài)環(huán)境保護。E-mail: zhengy@ffrc.cn

責任編輯： 陳 昕)