許 楊，王德良*，李 紅，閆寅卓，宋 濤

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

響應(yīng)面優(yōu)化HS-SPME-GC/MS檢測啤酒微量酯類物質(zhì)條件

許 楊，王德良*，李 紅，閆寅卓，宋 濤

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京 100015）

該研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設(shè)計，對頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（HS-SPME-GC/MS）檢測啤酒中6種低含量酯類物質(zhì)（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取條件進行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)萃取溫度、萃取時間和平衡溫度為主要影響因素，通過響應(yīng)面法分析得出最佳萃取條件為：萃取溫度42℃、萃取時間30 min和平衡溫度48℃；在該條件下，結(jié)合內(nèi)標(biāo)法定量，該方法的相關(guān)系數(shù)R2為0.990 0～0.999 9，回收率為93.43%～103.37%，檢測限為0.01～0.05 μg/L，相對標(biāo)準偏差（RSD）為1.75%～8.24%，表明該方法準確可靠，可應(yīng)用于啤酒中微量酯類物質(zhì)的檢測。

啤酒；微量酯類物質(zhì)；頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法；響應(yīng)面法；檢測分析

啤酒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分包括醇類、酯類、醛類、酮類、硫化物等[1]。其中，高級醇和酯類對啤酒質(zhì)量至關(guān)重要。啤酒中酯類含量遠不及高級醇，但是酯類物質(zhì)具有更高的風(fēng)味貢獻度[2]。啤酒中的酯類，按其揮發(fā)性又可分為揮發(fā)性酯和非揮發(fā)性酯。酯類通常具有很強的“果香味”[3]，適量的酯能使酒體豐滿，香味協(xié)調(diào)[4-5]。酯類含量過高賦予啤酒不舒適的苦味和果味，過低則使啤酒淡寡[6]，影響啤酒風(fēng)味的協(xié)調(diào)性[7-8]。另外，DAAN S等[9]發(fā)現(xiàn)酯類對老化物質(zhì)有掩蔽作用，向比利時貯藏啤酒中添加乙酸異戊酯，可以提高2-甲基丁醛、甲硫基丙醛、苯乙醛等老化物質(zhì)的閾值，因此可以有效掩蓋啤酒中老化物質(zhì)帶來的不愉悅的氣味。

現(xiàn)在關(guān)于啤酒中酯類風(fēng)味貢獻度的研究主要集中在乙酸乙酯、乙酸異戊酯等幾個主要酯類物質(zhì)[10-11]，其他閾值低、啤酒中含量也低的某些特征酯類物質(zhì)有待進一步研究分析。前期采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-結(jié)合氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜法（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GCO-MS）[12-14]對市售不同品牌貯藏啤酒進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯等6種酯香氣較愉悅。這些酯類因其含量較少，無法一次性全面對其定性定量檢測分析，對深入研究啤酒中含量較低的酯類物質(zhì)的風(fēng)味貢獻度造成了困難。

采用固相微萃取對目的物進行富集過程中，影響萃取效率的因素很多，如萃取柱極性、萃取溫度、萃取時間、解吸時間等[15-16]。響應(yīng)面法可反映自變量變化對響應(yīng)值的影響，并且可以分析自變量之間的相互作用，得到最優(yōu)檢測條件[17-18]。本研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化檢測啤酒中酯類物質(zhì)的萃取條件。在獲得的最優(yōu)萃取條件下，結(jié)合內(nèi)標(biāo)法，建立了同時測定辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯6種酯類風(fēng)味化合物的方法。在這些酯類中，如辛酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸苯乙酯具有較愉悅的香氣特征[19]，以期提升啤酒的香氣，可用于啤酒風(fēng)味、新產(chǎn)品研發(fā)等多個領(lǐng)域，對實際生產(chǎn)有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售啤酒A：產(chǎn)地武漢；啤酒B、啤酒C：產(chǎn)地北京。

NaCl（分析純）、無水乙醇（色譜純）：北京化工廠；2-壬醇（純度≥98%）：美國Fluka公司；辛酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯（純度均≥98%）：比利時Acros Organics公司；乙酸苯乙酯（純度≥98%）：美國Sigma公司；苯甲酸乙酯（純度≥98%）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；3-苯基丙酸乙酯（純度≥98%）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 600型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國PerkinElmer公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄：美國Supelco公司；AUX 320分析天平：日本島津公司；Xutemp恒溫水浴鍋：杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準試劑的制備

標(biāo)準溶液的配制：準確配制質(zhì)量濃度為10 mg/L的辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯標(biāo)準儲備液，然后再用無水乙醇配分別配制成0.25 mg/L，0.50 mg/L，1.00 mg/L，2.00 mg/L的混合標(biāo)準工作液，4℃避光處保存待用。

內(nèi)標(biāo)儲備液的配制：準確移取2-壬醇，用無水乙醇配制成10 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，然后再用無水乙醇配制成2.00 mg/L標(biāo)準工作液，4℃避光處保存待用。

1.3.2 樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取

啤酒預(yù)先在4℃冰箱冷藏24 h，取10 mL樣品瓶依次加入3.0 g NaCl、5.0 mL啤酒樣品、0.3 mL 2-壬醇內(nèi)標(biāo)溶液，放入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，加墊密封，樣品在一定溫度下平衡。平衡結(jié)束后，插入SPME萃取頭，萃取頭暴露于樣品瓶頂空部分，萃取一定時間。萃取結(jié)束后，將SPME萃取頭迅速插入GC進樣口中，在250℃不分流模式下解吸。

1.3.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：WAX ETR毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.50 mm）；進樣口溫度220℃；載氣為氦氣，恒定流速1.2 mL/min；不分流進樣；柱箱升溫程序為：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至215℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；溶劑延遲3 min；質(zhì)譜掃描范圍40～600 u。

將實驗譜圖與美國國家標(biāo)準及技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比較和標(biāo)樣定性兩種方法結(jié)合進行組分定性。在優(yōu)化的萃取條件下，采取內(nèi)標(biāo)法對6種特征酯類物質(zhì)進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計

選取進樣量（X1）、解吸時間（X2）、攪拌速率（X3）、平衡溫度（X4）、平衡時間（X5）、萃取溫度（X6）、萃取時間（X7）和NaCl添加量（X8）8個因素作為自變量，每個因素選取高低（1和-1）2個水平，采用Plackett-Burman設(shè)計找出對風(fēng)味物質(zhì)峰面積（主要包括酯和醇）有顯著影響的因子，其因素與水平設(shè)計見表1。響應(yīng)值為風(fēng)味物質(zhì)（酯和醇）色譜峰面積（Y），Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0.6對試驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3可知，萃取溫度、萃取時間、平衡溫度3個因素經(jīng)過分析確定為極顯著（P＜0.01），而NaCl添加量顯著性分析為對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。因此，選取萃取溫度、萃取時間和平衡溫度作為主要影響因素進行響應(yīng)面分析。

表3 Plackett-Burman試驗結(jié)果顯著性分析Table 3 Significance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 Box-Behnken試驗設(shè)計優(yōu)化參數(shù)水平

通過Plackett-Burman試驗設(shè)計獲得萃取溫度（A）、萃取時間（B）、平衡溫度（C）為主要影響因素。以酯類物質(zhì)總峰面積（Z）為響應(yīng)值，進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設(shè)計，因素與水平見表4，試驗設(shè)計及結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 Box-Behnken試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

利用Design Expert對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到回歸擬合方程如下：

Z=47.23-1.39A-11.39B+1.05C+7.26AB+0.28AC+2.25BC-5.41 A2-8.24B2-2.50C2

由表6可知，萃取時間對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），且萃取時間的二次項、A和B的交互作用對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明所建立的模型可用于啤酒中酯類物質(zhì)總峰面積的分析。

根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，以確認萃取溫度、萃取時間和平衡溫度對啤酒中酯類檢測的影響，響應(yīng)面曲線和等高線如圖1所示。

由圖1可知，萃取溫度與萃取時間交互作用顯著，與表6中交互項P值的分析結(jié)果一致。響應(yīng)面的坡度較為陡峭，表明酯類物質(zhì)的響應(yīng)值對萃取時間和萃取溫度的變化較為敏感。在萃取溫度不變的條件下，隨著萃取時間的延長，酯類物質(zhì)響應(yīng)值降低；在萃取時間不變的條件下，隨著萃取溫度的升高，酯類物質(zhì)響應(yīng)值呈現(xiàn)先略微上升然后下降的變化趨勢。

采用Designer Expert軟件分析，酯類物質(zhì)固相微萃取最佳萃取條件為萃取溫度41.95℃、萃取時間30 min、平衡溫度47.12℃，在此條件下，酯類物質(zhì)總峰面積的預(yù)測值為54.05×107?？紤]到實際操作方便性，本試驗所得固相微萃取最佳檢測條件為萃取溫度42℃、萃取時間30 min、平衡溫度48℃。

為了檢測所得結(jié)果的可靠性，在上述優(yōu)化的條件下進行3次平行試驗，即萃取溫度42℃、萃取時間30 min、平衡溫度48℃，實際檢測平均酯類物質(zhì)總峰面積為53.79×107，理論值與實驗值的相對偏差為0.48%，表明應(yīng)用響應(yīng)面法 優(yōu)化固相微萃取條件檢測啤酒中酯類物質(zhì)是可行的。

圖1 萃取溫度、萃取時間和平衡溫度交互作用對酯類物質(zhì)總峰面積影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature on the total peaks area of esters

2.3 模型方法學(xué)考察

本研究采用內(nèi)標(biāo)法對6種酯類物質(zhì)進行定量，同時進行精密度和準確度試驗。

由表7可知，6種酯類物質(zhì)的回收率為93.43%～103.37%，相對標(biāo)準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.75%～8.24%，滿足檢測分析要求，并且重現(xiàn)性良好。以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)濃度為分析物的最低檢測濃度進行檢測限研究，檢測限在0.01～0.05 μg/L內(nèi)。依次取1.3.1中不同稀釋倍數(shù)標(biāo)準溶液，以標(biāo)準溶液的質(zhì)量濃度與峰面積響應(yīng)值進行線性擬合，相關(guān)系數(shù)R2為0.990 0～0.999 9，表明6種分析物的線性回歸方程在所測質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性。

表7 啤酒中6種酯類物質(zhì)的回收率、檢測限和回歸方程Table 7 Recovery rate,detection limit and regression equation of six esters in beer

2.4 市售啤酒中6種特征酯類物質(zhì)的檢測

按照本研究所建立的方法，對3種市售啤酒中6種特征酯類物質(zhì)的含量進行3次檢測，結(jié)果見表8。

表8 3種市售啤酒中6種酯類物質(zhì)含量Table 8 Contents of six esters in three kinds of commercial beer

由表8可知，5種酯類檢測結(jié)果相對標(biāo)準偏差≤10%，因苯甲酸乙酯含量較低，所以檢測誤差會相對偏高，但整體檢測誤差仍在合理范圍內(nèi)，說明優(yōu)化萃取條件后的檢測方法準確可靠，可以應(yīng)用于啤酒中6種低含量酯類物質(zhì)定性定量檢測。不同品牌啤酒的特征酯類物質(zhì)的含量不同，這可能與酵母品種、釀造工藝以及貯存條件有關(guān)[20]。

3 結(jié)論

本研究采用響應(yīng)面法對頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法檢測啤酒中6種酯類物質(zhì)（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取條件進行優(yōu)化，通過響應(yīng)面分析得較佳的萃取條件為：萃取溫度42℃、萃取時間30min和平衡溫度48℃。同時采用標(biāo)準加入法定量，6種分析物的線性回歸方程在所測濃度范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.9900～0.9999，回收率為93.43%～103.37%，檢測限在0.01～0.05 μg/L，滿足檢測分析要求。對實際啤酒生產(chǎn)中酯類物質(zhì)的檢測具有重要的指導(dǎo)意義。

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Optimization of HS-SPME-GC/MS conditions for determination of trace esters in beer by response surface method

XU Yang,WANG Deliang*,LI Hong,YAN Yinzhuo,SONG Tao
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

The six low-content esters(including ethyl caprylate,ethyl butyrate,isobutyl acetate,phenylethyl acetate,ethyl benzoate and ethyl 3-phenylpropion)were extracted and determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC/MS).The extraction conditions were optimized by Plackett-Burman and Box-Behnken experiments.The result showed that extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature were identified as the main factors.Through response surface methodology analysis,the optimum extraction conditions were temperature 42℃,time 30 min and equilibrium temperature 48℃.Under the conditions,combined with the internal standard method to quantify,the R2of the method was 0.990 0-0.999 9,the recovery rate was 93.43%-103.37%.The limit of detection was 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviation(RSD)was 1.75%-8.24%,which indicated that the method was accurate and reliable,and could be applied to the determination of trace esters in beer.

beer;trace esters;HS-SPME-GC/MS;response surface methodology;detection and analysis

TS261.7；O657.63；O658.2

0254-5071（2017）09-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.035

2017-05-15

國家自然科學(xué)基金（31401680）

許 楊（1993-），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：王德良（1972-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為發(fā)酵工程。