烏梅噴霧劑對大鼠頜下腺放射性損傷的影響

陳倩怡　李碧霞　葉景云

[摘要] 目的 探討烏梅噴霧劑對大鼠頜下腺放射性損傷的影響。 方法 健康SPF級雄性6～7周Wistar大鼠30只采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組和高、中、低烏梅噴霧劑組，每組各6只。電子直線加速器一次性18 Gy局部照射建立放射性頜下腺細(xì)胞損傷模型。于用藥后第14天收集唾液，計算唾液流率，檢測唾液生化指標(biāo)。處死后摘取頜下腺組織蘇木精-伊紅染色（HE染色）鏡下觀察頜下腺腺體組織形態(tài)學(xué)變化。 結(jié)果 用藥后第14天，模型組及低、中、高濃度烏梅噴霧組大鼠體重均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。模型組及低、中、高濃度烏梅噴霧組大鼠唾液流率、Na+、K+、Na+/K+均低于正常組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。正常組大鼠腺體細(xì)胞排列規(guī)則，未見明顯病理改變；模型組發(fā)生明顯炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)中膠原纖維明顯增生，發(fā)生纖維化；各放射組大鼠頜下腺細(xì)胞均出現(xiàn)放射性損傷，與模型組比較，高濃度烏梅噴霧劑組頜下腺腺小葉細(xì)胞萎縮程度降低，腺體周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，胞漿分泌物增多，但未能恢復(fù)至正常組水平。 結(jié)論 高濃度烏梅噴霧劑可一定程度上促進(jìn)大鼠頜下腺放射性損傷細(xì)胞病理形態(tài)修復(fù)，但仍需進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制。

[關(guān)鍵詞] 烏梅噴霧劑；頜下腺；放射性損傷；大鼠

[中圖分類號] R782 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（c）-0008-04

[Abstract] Objective To observe the influence of Dark Plum Sprays on radiation-induced submandibular gland damage of rats. Methods According to the random number table， a total of 30 healthy Wistar male rats aged 6-7 weeks were divided into normal group （NG）， untreated group （UG）， high-dose Dark Plum Sprays group （HG）， medium-dose Dark Plum Sprays group （MG）， low-dose Dark Plum Sprays group （LG）， each group had 6 rats. The rats were given one-time 18 Gy irradiation locally on the submandibular glands. 14 days later， saliva was collected to calculate the salivary flow rate and detected the biochemical indexes. After that， submandibular glands were draw out. Morphology examination was assessed by HE staining. Results 14 days after administration， the average body weights in UG， HG， MG， LG groups were significantly lower than those in the NG group （P < 0.05）. The salivary flow rate， Na+， K+， Na+/K+ in UG， HG， MG， LG groups were lower than those in the NG group， but there were no statistically significant differences （P > 0.05）. The cells of the Wistar rats in the NG group were regularly arranged， and there were no obviously pathological changes. The cells in UG group presented inflammatory infiltration and the collagen fibrils demonstrated fibrosis with significant hyperplasia. The submandibular gland cells of UG， HG， MG， LG groups had radioactive damage after irradiation. However， the submandibular gland cells of HG group was less atrophy， inflammatory and more cytoplasm secretion than UG. The restoration of submandibular gland cells in HG group were better than UG， but failed to return to normal. Conclusion High-dose Dark Plum Sprays may repair the pathomorphism of submandibular gland cells after radioactive damage， but relevant mechanisms need to be further explored.

[Key words] Dark Plum Sprays； Submandibular gland； Radioactive damage； Ratendprint

頭頸部腫瘤是我國華南地區(qū)的高發(fā)病，尤其是鼻咽癌。放射治療是頭頸部腫瘤主要治療方法之一，鼻咽癌首選治療方案是放療。放射性口干癥是頭頸腫瘤放療患者難以避免的放療并發(fā)癥。放射性口干癥患者常主訴口腔干燥灼熱、唇舌疼痛、舌腭粘連、嗅味覺遲鈍甚至喪失、吞咽咀嚼困難等，且觀察發(fā)現(xiàn)，放射性口干癥患者極易發(fā)生潰瘍、口腔真菌感染、口腔上皮萎縮等問題，并常繼發(fā)或伴有猛性齲齒、繼發(fā)性唾液腺炎、牙周炎等一系列的口腔疾病，對于頭頸部腫瘤患者來說，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量[1-2]。近年來，由于頭頸部腫瘤放療后患者生存率的提高，患者放療后的生存質(zhì)量也日益受重視。放療時頜下腺一般包被在放射野內(nèi)，無可避免受到損傷[3]。因此，研究保護(hù)和減輕頜下腺損傷，防治放射性口干癥的方法和技術(shù)備受重視。尋求簡單方便、價廉低毒、療效確切的防治放射性口干癥的方法更是刻不容緩。從中醫(yī)基礎(chǔ)理論來看，放射性口干癥屬火熱傷津，從全身治療角度分析，腫瘤患者本身有肝腎虧虛，放射線屬火毒之邪，最易耗氣傷陰，因此中醫(yī)學(xué)整體辨證多以酸甘養(yǎng)陰、清熱生津為主要治則治療放射性口干癥，頗有療效。烏梅是酸味藥的主要藥物之一，甘草是甘味的主要藥物之一，烏梅與甘草是酸甘化陰法常用組方藥物[4]。烏梅噴霧劑是采用烏梅、甘草配方顆粒研制出的一種新型噴霧劑，根據(jù)文獻(xiàn)報道，由烏梅與甘草配伍的烏梅噴霧劑不僅能促進(jìn)正常人唾液分泌，還能緩解胃腸道術(shù)后口干癥，改善放射性口干癥患者主觀口干感，具有刺激唾液分泌的作用[5-10]。為進(jìn)一步觀察烏梅噴霧劑對頜下腺的影響，本研究建立大鼠頜下腺放射性損傷模型，給予不同劑量烏梅噴霧劑，觀察其對放射性頜下腺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

選取健康SPF級雄性6～7周Wistar大鼠30只，體重180～220 g，動物合格證號：CXK（粵）2013-0034，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)環(huán)境3 d后開始實驗。本研究已通過廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查。

1.1.2 藥物

烏梅噴霧劑由烏梅顆粒劑（廣東省一方制藥有限公司生產(chǎn)，1.4 g/包，相當(dāng)于飲片10 g/包）與甘草顆粒劑（0.5 g/包，相當(dāng)飲片3 g/包）按飲片比例15∶3 g、30∶6 g、60∶12 g分別用20 mL溫開水溶解，倒入噴霧小瓶，對應(yīng)配制成低、中、高濃度的烏梅噴霧劑。每次用前新鮮配制。

1.1.3 試劑與儀器

水合氯醛，毛果蕓香堿（大連美侖生物技術(shù)公司，貨號MB5259），4%多聚甲醛，Eppendrof管（永津生物科技有限公司），移液器槍頭，可調(diào)式移液器（德國艾本德），美國醫(yī)用Varian23EX直線加速器，Na+、K+試劑盒（南京建成生物公司），分光光度計（上海天美公司，型號UV1100II），自制手術(shù)臺，手術(shù)器械。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，低、中、高濃度烏梅噴霧組，每組各6只。分組后進(jìn)行放射造模。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，手術(shù)架上固定，僅頜下腺區(qū)暴露在照射野（圖1），余部位用鉛磚防護(hù)，予一次性給予18 Gy放射線照射（能量為9 MV，劑量率為3 Gy/min，廣東省中醫(yī)院大學(xué)城分院放療科技術(shù)提供）。正常組只麻醉不照射。

1.2.2 給藥方法

正常組正常飲食；模型組照射后正常飲食；低、中、高濃度烏梅噴霧組正常飲食外，輻射當(dāng)天開始給予低、中、高濃度烏梅噴霧劑口腔噴霧。給藥均在餐前進(jìn)行，每天3次（8∶00、12∶00、16∶00），一人抓取大鼠，一人口腔噴霧給藥，均在吸氣時候噴藥，每次噴兩下（0.1 mL）。給藥至造模后14 d取材。

1.2.3 指標(biāo)檢測

1.2.3.1 一般情況 觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、體重。

1.2.3.2 唾液流率及生化指標(biāo) 采用移液器收集大鼠刺激性唾液（圖2）。方法：腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后將大鼠固定于自制手術(shù)架，頸部皮下注射0.2%毛果蕓香堿（2 mg/kg）刺激唾液分泌，注射毛果蕓香堿后開始計時，將唾液收集在已稱重的Eppendorf管內(nèi)，收集20 min。假設(shè)唾液比重是1.0 g/mL，以重量代表體積計算唾液流率。將已收集的唾液于-20℃凍存，待全部標(biāo)本收集完全后采用比色法檢測K+、Na+含量。

1.2.3.3 病理切片 收集唾液后脫臼法處死大鼠，取頜下腺組織，4%多聚甲醛溶液室溫固定，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

各組大鼠均成活于整個實驗周期。放射后，大鼠精神狀態(tài)較差，毛發(fā)欠光澤。照射當(dāng)天各組大鼠體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），至照射后14 d，即實驗周期結(jié)束，模型組及低、中、高濃度烏梅噴霧組大鼠體重均低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），但三個用藥組與模型組大鼠體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 唾液流率及生化指標(biāo)

模型組及各濃度烏梅噴霧組大鼠唾液流率、Na+、K+、鈉鉀比均低于正常組，但經(jīng)方差分析，各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

2.3 頜下腺病理組織學(xué)變化

正常組HE染色切片鏡下可見腺體結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，腺泡細(xì)胞呈立方形，頂部胞質(zhì)中有較多嗜酸性分泌物，核位于基底部。模型組大鼠腺體被間質(zhì)結(jié)締組織分割成小葉，腺泡細(xì)胞明顯萎縮，可見核固縮，胞漿中分泌物明顯減少，有明顯炎癥浸潤，間質(zhì)中膠原纖維明顯增生發(fā)生纖維化。與模型組比較，低、中、高濃度烏梅噴霧組大鼠隨著濃度的遞增，頜下腺細(xì)胞萎縮及浸潤程度均減少，胞漿分泌物增多。見圖3。endprint

3 討論

放射線會破壞唾液腺組織，使其血管和腺泡出現(xiàn)損傷，唾液分泌減少，進(jìn)而使患者放療后出現(xiàn)嚴(yán)重口干癥狀。一次性單一劑量放射要比相同劑量分割放射所致的唾液腺損傷嚴(yán)重，因此現(xiàn)在關(guān)于唾液腺治療的研究多采用一次性放射性照射。本研究采用一次性18 Gy電子線放射建立大鼠頜下腺損傷模型[11]，通過腺體病理組織學(xué)觀察烏梅噴霧劑是否對腺泡細(xì)胞起保護(hù)作用[12]。烏梅噴霧劑干預(yù)14 d，病理切片顯示，相對于模型組，高濃度烏梅噴霧劑組的頜下腺腺小葉細(xì)胞萎縮程度降低，腺體周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，胞漿分泌物相對較多，提示高濃度烏梅噴霧劑能促進(jìn)大鼠放射性損傷頜下腺細(xì)胞形態(tài)修復(fù)，但具體作用機(jī)制仍需探究。

放射損傷后腺泡細(xì)胞合成分泌唾液的能力下降，導(dǎo)致唾液流率下降。邢紅艷[13]實驗表明，照射后小鼠唾液流率明顯下降。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠唾液流率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與國外放射后致腺體唾液流率減少的研究結(jié)果不符[14-15]。推測可能原因：①烏梅噴霧劑可刺激正常無損傷腺體[7，10]，但對促進(jìn)放射性頜下腺損傷唾液分泌效果不明顯，可進(jìn)一步比較烏梅噴霧劑對正常和各種損傷唾液腺的刺激作用。②唾液收集方法不嚴(yán)謹(jǐn)，基于唾液量收集誤差極易影響唾液流率分析。然而，大鼠唾液腺導(dǎo)管較小，經(jīng)口內(nèi)頜下腺導(dǎo)管口直接插管法收集大鼠頜下腺唾液可行性不高，不易掌握[16]。

放射性口干癥患者唾液分泌量、性質(zhì)和成分發(fā)生改變。本研究中大鼠放射性損傷后唾液Na+、K+含量降低，但放射后第14天，各組唾液Na+、K+含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。唾液腺小葉內(nèi)導(dǎo)管是皮質(zhì)激素的作用部位，在該處激素可促進(jìn)Na+吸收和K+排出，因此伴有唾液Na+/K+比值的相應(yīng)變化。國內(nèi)外研究認(rèn)為，Na+/K+比值不僅可以作為醛固酮分泌的指標(biāo)，還能反映整個腎上腺皮質(zhì)功能的改變[17-18]。本研究顯示烏梅噴霧劑對大鼠頜下腺放射性損傷后早期唾液成分無影響，后續(xù)研究可增加烏梅噴霧劑對大鼠頜下腺放射性損傷不同時期的觀察，以分析其有效作用時間。

烏梅噴霧劑居家方便，價廉低毒，臨床效果顯著，但其防治放射性口干癥機(jī)制研究不足，難以推廣，極大局限了其使用范圍。若烏梅噴霧劑能促進(jìn)大鼠頜下腺放射性損傷細(xì)胞形態(tài)修復(fù)，則可為其防治放射性口干癥提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果提示高濃度烏梅噴霧劑可一定程度上促進(jìn)大鼠頜下腺放射性損傷細(xì)胞病理形態(tài)修復(fù)，但機(jī)制仍需進(jìn)一步明確，亟需加強(qiáng)基礎(chǔ)研究，以闡明作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供充分依據(jù)。

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（收稿日期：2017-06-25 本文編輯：程 銘）endprint