富氫水后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注后抗氧化損傷作用及機(jī)制研究*

彭本君 李艷玲

(解放軍第八十八醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 泰安 271000)

富氫水后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注后抗氧化損傷作用及機(jī)制研究*

彭本君 李艷玲

(解放軍第八十八醫(yī)院腎內(nèi)科，山東 泰安 271000)

目的 探討富氫水后處理對(duì)抗大鼠腎臟缺血再灌注(IR)后氧化應(yīng)激損傷的作用及其機(jī)制。方法 選擇健康雄性SD大鼠30只，質(zhì)量230～250 g，釆用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組(n=10)，假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)和富氫水組(HS組)。Sham組：腹正中切口開(kāi)腹，游離兩側(cè)腎臟，分離并結(jié)扎右側(cè)腎蒂，分離左側(cè)腎蒂不予結(jié)扎，暴露手術(shù)野30 min后縫合；IR組：分離左側(cè)腎蒂并用動(dòng)脈夾阻斷血流，30 min后恢復(fù)血液灌注，制備大鼠腎臟缺血再灌注模型；HS組：前期處理同IR組，再灌前即刻給與2%富氫水(10 ml·kg-1·d-1)灌腸。其余兩組同法給與同等劑量生理鹽水。造模成功后，各組分別于再灌后3 h、6 h、12 h、24 h采取血清標(biāo)本，測(cè)定各組大鼠血尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、血清丙二醛(MDA)。結(jié)果 各組大鼠BUN和SCr水平與Sham組比較均明顯升高(P<0.05)。IR組BUN和SCr水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，HS組BUN和SCr各時(shí)間段水平均降低(P<0.05)。SOD和MDA結(jié)果顯示：各組與Sham組比較，IR組大鼠SOD水平均明顯降低，MDA水平均明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，HS組SOD水平升高，MDA水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 富氫水后處理對(duì)大鼠腎臟IRI可產(chǎn)生保護(hù)作用，作用機(jī)制可能是通過(guò)選擇性抗氧化、抑制炎癥因子釋放來(lái)實(shí)現(xiàn)。

富氫水；腎臟；缺血再灌注損傷；后處理

缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)由Jennings于1960年首先提出，是指在某些條件下，造成器官和/或組織缺血，當(dāng)血液供應(yīng)恢復(fù)后，器官組織損傷反而加重，甚至發(fā)生組織功能代謝及結(jié)構(gòu)不可逆性損傷的現(xiàn)象[1]。腎臟 IRI 主要發(fā)生在創(chuàng)傷、休克、腎移植、泌尿外科手術(shù)等情況，如何有效地防治腎臟 IRI 成為學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。有報(bào)道，在器官缺血后，再灌前幾分鐘給予藥物干預(yù)可以起到減輕器官I(mǎi)RI的作用，這種干預(yù)方法被稱為藥物后處理(pharmacological postconditioning，PPoC)[2]?，F(xiàn)有的資料表明：氫氣具有選擇性抗氧化作用：即氫只與氧化作用很強(qiáng)的、造成細(xì)胞損害的自由基、如OH-和ONOO-直接相結(jié)合[3]，從而對(duì)抗缺血性再灌注產(chǎn)生的氧自由基(ROS)。另外，氫氣具有抑制器官炎癥反應(yīng)[4]、減低藥物毒性的[5]作用。本研究通過(guò)建立大鼠腎臟IR模型并給與富氫水后處理，通過(guò)觀察大鼠腎功能和血清學(xué)變化，探討富氫水后處理對(duì)腎臟IRI的保護(hù)作用，為富氫水后處理在腎臟科的臨床實(shí)踐提供依據(jù)。

1 資料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠30只，周齡6～8周，體重230～250 g，由泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。均飼養(yǎng)于恒溫(18～22 ℃)、恒濕(40%～70%)環(huán)境，保持空氣流通，分籠飼養(yǎng)一周，每籠各5只，使大鼠適應(yīng)環(huán)境。自由飲水及進(jìn)食，使用超濾去菌飲水和鈷60滅菌飼料。術(shù)前12 h禁食，自由飲水。

1.2動(dòng)物模型的建立

所有動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 ml/100 g)，固定手術(shù)臺(tái)，手術(shù)區(qū)去毛，常規(guī)碘伏消毒鋪巾，腹部正中切口，逐層切開(kāi)皮膚、腹直肌聯(lián)合腱及腹膜，打開(kāi)腹腔后暴露左、右腎臟。分離腎蒂周?chē)M織游離右側(cè)腎蒂并進(jìn)行結(jié)扎，消除其缺血代償作用。而后暴露左側(cè)腎臟，分離腎蒂周?chē)M織，暴露腎蒂結(jié)構(gòu)，分離并提起腎動(dòng)脈。經(jīng)手術(shù)處理后，各組手術(shù)方法如下：Sham組(n=10)：不做處理，暴露30 min后逐層縫合腹壁；IR組(n=10)：用動(dòng)脈夾將左側(cè)腎動(dòng)脈夾閉，腎臟由鮮紅色變?yōu)榘底仙瑠A閉30 min后再開(kāi)放動(dòng)脈，腎臟由暗紫色逐漸變?yōu)樽霞t色，造模成功；HS組(n=10)：在IR組模型的基礎(chǔ)上，于開(kāi)放動(dòng)脈再灌后即刻給予2%富氫水灌腸(10 ml·kg-1·d-1)，恢復(fù)正常血液供應(yīng)。缺血期間大鼠模型用無(wú)菌生理鹽水紗布覆蓋創(chuàng)面，以減少內(nèi)臟暴露及體液流失。各組模型制作完畢后，逐層縫合、關(guān)閉腹腔，置于手術(shù)前籠中飼養(yǎng)。

1.3標(biāo)本留取及處理

上述3組大鼠在造模成功后，每組分別隨機(jī)選取5只大鼠，于持續(xù)再灌注3 h、6 h、12 h、24 h留取血液標(biāo)本，留取血液標(biāo)本采用尾尖采血法：10%水合氯醛麻醉后固定，用45 ℃溫水浸泡大鼠尾部，見(jiàn)血管充盈后，酒精棉球消毒，滅菌手術(shù)剪剪去尾尖10 mm，血液從尾尖排出，用負(fù)壓肝素鋰抗凝采血管收集血液標(biāo)本約2 ml，室溫靜置后放入4 ℃冰箱過(guò)夜，用離心機(jī)以3000 rpm離心 10 min，吸取全部上清液、標(biāo)記、-80 ℃冰箱冷凍備檢。血尿素氮(BUN)檢測(cè)采用脲酶法，血清肌酐(SCr)檢測(cè)采用苦味酸法，超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)采用羥胺法，丙二醛(MDA)檢測(cè)采用硫代巴比妥酸法。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠BUN監(jiān)測(cè)結(jié)果

與Sham組比較，IR各組BUN水平均明顯升高，差異顯著(P<0.05)。IR各組組內(nèi)BUN水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。與IR組相比較，HS組BUN水平均降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠BUN檢測(cè)結(jié)果

注：△：與Sham組比較P<0.05；▲與IR組比較P<0.05。

2.2各組大鼠SCr檢測(cè)結(jié)果

參照Sham組，IR組SCr水平均明顯升高(P<0.05)。IR各組組內(nèi)SCr隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。與IR組相比較，HS組SCr各組水平均降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠SCr檢測(cè)結(jié)果

注：△：與Sham組比較P<0.05；▲：與IR組比較P<0.05。

2.3各組大鼠SOD結(jié)果

參照Sham組，IR各組SOD活性水平明顯降低(P<0.05)。IR各組組內(nèi)SOD水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而減低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠SOD檢測(cè)結(jié)果

注：△：與Sham組比較P<0.05；▲與IR組比較P<0.05。

2.4各組大鼠MDA監(jiān)測(cè)結(jié)果 與Sham組比較，IR各組MDA均明顯升高(P<0.05)。IR組內(nèi)MDA水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高(P<0.05)。與IR組相比較，HS組MDA總體水平均減低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(見(jiàn)表4)

表4 各組大鼠MDA檢測(cè)結(jié)果

注：△：與Sham組比較P<0.05；▲與IR組比較P<0.05。

3 討 論

1960年缺血再灌注損傷(ischemia-repeifusion injury,IRI)的概念提出之后，直到20世紀(jì)80年代，IRI才逐漸在文獻(xiàn)中見(jiàn)到。缺血性再灌注造成氧化和抗氧化水平失衡，可以產(chǎn)生大量的氧自由基(oxygen free radical,OFR)，OFR可以攻擊脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及核酸等多種組織結(jié)構(gòu)[6]，引起生物膜中不飽和脂肪酸的過(guò)氧化，引起細(xì)胞代謝及功能障礙、甚至死亡：(1)對(duì)蛋白質(zhì)、酶的損傷，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、功能喪失和酶失活；(2)對(duì)核酸和染色體的破壞，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、染色體的畸變；(3)破壞細(xì)胞外基質(zhì)，使其變得疏松、彈性下降，導(dǎo)致組織器官功能損傷[7]。在正常情況下，細(xì)胞中存在正常量的OFR，不會(huì)造成細(xì)胞損傷，并能被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)(如SOD)及時(shí)清除，從而達(dá)到氧化——抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。而自由基的代謝產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量可反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接地反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和損傷程度。氫是自然界存在最多、最簡(jiǎn)單的元素，占宇宙物質(zhì)組成的90%左右，具有無(wú)色、無(wú)味、具有一定還原性的雙原子氣體，是宇宙最基本的化學(xué)元素。氫氣是一種優(yōu)質(zhì)的抗氧化物質(zhì)，具有無(wú)毒、無(wú)殘留、制備容易，且為非興奮劑、非藥物等特點(diǎn)。日本學(xué)者采用化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞學(xué)等手段證明氫氣具有選擇性抗氧化作用[8]。國(guó)內(nèi)學(xué)者孫學(xué)軍等通過(guò)實(shí)驗(yàn)及臨床研究證實(shí)，人體只需要呼吸氫氣或飲用富氫水，就可以對(duì)諸如心、腦、肝、腎、肺、小腸等缺血再灌注損傷(I/R)與心臟器官移植后的炎癥損傷等具有顯著的抑制作用，對(duì)糖尿病、中風(fēng)、慢性氧化應(yīng)激性疾病具有明顯的治療作用[9-11]?？v覽以往研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)氫的抗氧化作用的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)集中于諸如器官缺血再灌注損傷(I/R)[8]、減輕神經(jīng)損傷[12]、抑制器官炎癥反應(yīng)[13]、減低藥物毒性[14]，治療小鼠基因缺陷[15]、帕金森病[16]以及人類(lèi)II型糖尿病[17]等慢性氧化應(yīng)激損傷與疾病。

本研究采用SD大鼠制作動(dòng)物模型，手術(shù)切口選擇腹白線切口的方式，手術(shù)野暴露充分，易于操作，手術(shù)遵守?zé)o菌操作可降低圍手術(shù)期感染率。預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，左側(cè)腎蒂更易于暴露和游離，故最終實(shí)驗(yàn)選擇了結(jié)扎右側(cè)腎蒂防止代償性作用影響血清學(xué)結(jié)果、夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈的方法造模，有異于傳統(tǒng)的腎蒂阻斷。從腎臟缺血再灌注損傷后機(jī)體抗氧化方面探討富氫水的作用。通過(guò)研究再灌注后腎臟細(xì)胞血清學(xué)(BUN、SCr、SOD、MDA)變化，探尋富氫水選擇性抗氧化的客觀依據(jù)，從而為進(jìn)一步深入研究氫對(duì)抗再灌注損傷的內(nèi)在機(jī)制以及富氫水的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

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The effects and mechanism research of post-conditioning with rich hydrogen water against oxidation of renal ischemia-reperfusion injury in rats

PENG Ben-jun LI Yan-ling

(Dept. of Nephrology, No. 88 Hospital of PLA,Taian 271000，China)

Objective:To investigate the effects of hydrogen-rich water treatment on post-oxidative stress injury in rats with renal ischemia reperfusion (IR) and its mechanism.Methods:30 healthy male SD rats, the quality of 230～250 g.With random number table method was divided into 3 groups(n=10), control group(Sham), ischemia reperfusion group(IR group) and hydrogen rich water group(HS).The ventral median incision in Sham group was opened, and the kidneys were dissociated, separated and ligated with the right kidney. The left kidney was not ligated, and the surgical field was closed after 30min.The renal ischemia-reperfusion model of rat kidney was prepared after 30 min of blood perfusion.The HS group was treated with the IR group and immediately gave 2% hydrogen rich water(10 ml·kg-1·d-1) enema before irrigation. The other two groups were given the same dose of saline.After the success of the building, each group respectively in reperfusion after 3 h, 6 h, 12 h, 24 h to serum specimens, the determination of each group rats blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine(SCr),serum superoxide dismutase(SOD),serum malondialdehyde (MDA).Results:Both the BUN and SCr levels of rats in each group were significantly higher than those in Sham group(P<0.05).The level of BUN and SCr of IR group increased gradually with time, and the difference between groups was statistically significant(P< 0.05). Compared with IR group, the levels of the HS group BUN and SCr were reduced at each time period(P<0.05).The results of SOD and MDA showed that the SOD levels of the rats in IR group were significantly lower than those in the Sham group, and the MDA level was significantly higher, and the difference was statistically significant(P<0.05).Compared with IR group, SOD level of HS group increased, MDA level decreased, and the difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion:the treatment of IRI in rats can be protected by hydrogen-rich water treatment, which may be achieved by selective antioxidation and inhibition of inflammatory cytokines.

hydrogen-rich suline;kidneys;ischemia reperfusion injury;post-processing

彭本君(1982—)，男，山東泰安人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事臨床腎內(nèi)科工作。

李艷玲(1982—)，女，主治醫(yī)師，主要從事主要從事核素診斷工作。

R692

A

1004-7115(2017)10-1101-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.007

2017-07-20)