對節(jié)白蠟樹葉提取物殺菌活性初步研究

吳清來，張良菊，徐慧慧，徐志紅，李俊凱

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 長江大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025)

對節(jié)白蠟樹葉提取物殺菌活性初步研究

吳清來，張良菊，徐慧慧，徐志紅，李俊凱*

(長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 長江大學(xué)農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025)

【目的】研究對節(jié)白蠟的抗病原因，探尋新的生物農(nóng)藥?！痉椒ā繉?jié)白蠟樹葉中的化合物質(zhì)進行了分離提取，并將提取物分別對小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、棉花紅腐病菌、核桃根腐病菌、馬鈴薯早疫病菌、蘋果斑點落葉病菌進行室內(nèi)生物活性測定試驗，為了進一步鎖定有效成分，對乙酸乙酯萃取物進行了柱層析初步分離，并進行了組分殺菌活性測定。【結(jié)果】在500 μg/mL濃度下，乙酸乙酯萃取物整體表現(xiàn)出較好活性，其中對蘋果斑點落葉病和棉花紅腐病的抑制率分別達到78.0 %、69.0 %。組分1和組分4整體表現(xiàn)出優(yōu)于其他組分的殺菌活性，其中組分1對棉花紅腐病、蘋果斑點落葉病的抑制率分別達到70.0 %和79.0 %，組分4蘋果斑點落葉病的抑制率也達到74.0 %。【結(jié)論】對節(jié)白蠟提取物對部分病菌具有一定的抑制效果，為研究對節(jié)白蠟的抗病原因打下了一定的基礎(chǔ)。

對節(jié)白蠟；提取物；殺菌活性；生物農(nóng)藥

【研究意義】對節(jié)白蠟鮮有病蟲害，很有可能自身能夠產(chǎn)生抗蟲、抗病的活性物質(zhì)，幫助其免于病蟲害的影響，而目前有關(guān)對節(jié)白蠟抗蟲抗病方面的研究尚屬空白?！厩叭搜芯窟M展】對節(jié)白蠟(Fraxinushupehensis)是湖北農(nóng)學(xué)院蘇丕林教授于1975年首次發(fā)現(xiàn)的白蠟屬新種[1-2]，初發(fā)現(xiàn)時僅分布于湖北省鐘祥京山大洪山南麓山丘地帶，因此又名湖北梣、湖北白蠟、對節(jié)樹、望鄉(xiāng)樹[1,3]。對節(jié)白蠟是我國二級珍稀保護植物[4-5]，具有很好的應(yīng)用價值[6]：樹皮作為中藥秦皮的來源之一，具有重要的藥用價值[7-8]；對節(jié)白蠟是世界僅存的木犀白蠟名貴樹種，是世界景點、盆景、根雕家族的極品[9]；對節(jié)白蠟盆景被譽為“活化石”或“盆景之王”[9]。

【本研究切入點】對節(jié)白蠟鮮有蟲害，蚜蟲、螨蟲、線蟲、紅蜘蛛等均不會對其造成影響。僅是剛出嫩芽時，芽梢會偶受病蟲影響，數(shù)天后芽葉老化，危害會自動消除。白粉病、立枯病等均不對其造成危害[10]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為了明確對節(jié)白蠟的抗病原因，針對對節(jié)白蠟樹葉提取物進行了室內(nèi)殺菌活性實驗，以期發(fā)現(xiàn)或開發(fā)出一種新型防治病害的生物農(nóng)藥。

1 材料與方法

1.1 供試材料

對節(jié)白蠟樹葉于2016年3月采自長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝盆景園，室溫陰干備用。

試劑：對節(jié)白蠟樹葉提取物所用的溶劑為工業(yè)用無水甲醇，提取物分離純化和不同濃度提取物配制所用的石油醚、氯仿、乙酸乙酯均為市售的化學(xué)純試劑，水為哇哈哈純凈水。

1.2 供試病原菌

小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)，水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)；棉花紅腐病菌(Fusariumrotofcotton)，核桃根腐病菌(Walnutrootrot)，馬鈴薯早疫病菌(Potatoearlyblight)，蘋果斑點落葉病菌(Alternariaalternataf.sp.mali)。以上菌種由長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物保護教研組提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取物的制備[11-12]在室溫下，將陰干的對節(jié)白蠟樹葉(1000.0 g)依次用1500 mL無水甲醇冷浸提取3 、2、1 d，充分將對節(jié)白蠟樹葉中的提取物提取出來，提取液減壓濃縮至無溶劑蒸出，得甲醇浸提物。甲醇浸提物先用蒸餾水溶解，然后采用“液-液萃取法”，先用石油醚萃取3次，再用氯仿萃取3次，最后用乙酸乙酯萃取3次，分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無溶劑蒸出，然后置于通風(fēng)櫥內(nèi)氮氣吹干備用。水層濃縮后，用無水乙醇溶解濃縮帶水3次，然后置于通風(fēng)櫥內(nèi)氮氣吹干備用，結(jié)果見表1。

1.3.2 藥液的配置 將對節(jié)白蠟樹葉不同溶劑提取得到的供試樣品用無水乙醇溶解，再用含0.1 %吐溫80的水稀釋至500 μg/mL，其中無水乙醇含量為5 %，用其進行殺菌活性測定。

1.3.3 對供試病菌的室內(nèi)活性測定 采用離體平皿法[13]，以供試病原菌為對象，對所合成的化合物進行殺菌活性測定。藥液以乙醇為溶劑，實驗終濃度為500 μg/mL。將配制好的藥液各取1 mL于已滅菌的培養(yǎng)皿中，再取冷卻到45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基9 mL倒入培養(yǎng)皿，充分混勻，置平板使凝固。然后用打孔器移接菌餅，菌面向下接于含毒培養(yǎng)基中心，每皿1塊，放于恒溫箱中，培養(yǎng)2 d后測量菌落直徑，通過以下公式計算抑制率。

抑制率 % =(對照菌落直徑-處理菌落直徑)÷ 對照菌落直徑 × 100 %

每個樣品重復(fù)3次，以加入無菌水的培養(yǎng)基為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 對節(jié)白蠟樹葉甲醇浸提物在不同極性溶劑中的分配率

采用上述提取方法，得到對節(jié)白蠟樹葉的甲醇浸提物253.0 g，提取效率為25.3 %。將對節(jié)白蠟樹葉的甲醇浸提物用蒸餾水溶解，然后選用極性從低到高的3種不同溶劑：石油醚、氯仿和乙酸乙酯依次萃取，每種溶劑用250 mL/次萃取3遍，各自合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無溶劑蒸出，置于通風(fēng)櫥內(nèi)氮氣吹干稱重，得出對節(jié)白蠟樹葉甲醇浸提物在不同極性溶劑中的分配率(表1)。

從表1可見，對節(jié)白蠟樹葉甲醇浸提物在不同極性溶劑中的分配率有明顯的差異，水層中物質(zhì)最多，占總浸提物的66.0 %，說明水溶性高極性物質(zhì)占主要成分；其次是乙酸乙酯萃取物，占總的17.8 %；石油醚萃取物和氯仿萃取物分別占總的11.5 %、4.8 %。

2.2 不同溶劑萃取物對供試病菌的活性測定

由表2可知，乙酸乙酯萃取物對供試菌有較好的活性，其中對蘋果斑點落葉病和棉花紅腐病的效果最好，抑制率分別達到78.0 %、69.0 %。其次石油醚萃取物對馬鈴薯早疫病的抑制率為55.0 %，對其他菌株的抑制活性非常低。氯仿萃取物和水層物質(zhì)對供試病菌基本沒有抑制作用。

2.3 乙酸乙酯萃取物初步分離組分對供試病菌的活性測定

表1 對節(jié)白蠟樹葉甲醇浸提物在不同極性溶劑中的分配率Table 1 The distribution rate of methanol extractive of Fraxinus hupehensis leaves in different polarity solvents

表2 不同溶劑萃取物的殺菌活性Table 2 Fungicidal activities of different solvent extractives

表3 不同組分的殺菌活性Table 3 Fungicidal activities of different components

由表3可知，組分1和組分4整體表現(xiàn)出優(yōu)于其他組分的殺菌活性，其中組分1對棉花紅腐病、蘋果斑點落葉病的抑制率分別達到70.0 %和79.0 %，組分4蘋果斑點落葉病的抑制率也達到74.0 %。為有效成分的研究和確定鎖定了范圍，為研究對節(jié)白蠟的抗病原因打下了一定的基礎(chǔ)。

3 討 論

對節(jié)白蠟樹葉甲醇浸提物中乙酸乙酯萃取物對供試菌的效果最好，其中蘋果斑點落葉病和棉花紅腐病的抑制率分別達到78.0 %和69.0 %。石油醚萃取物中，對馬鈴薯早疫病的抑制率為55.0 %，對其他的菌沒有抑制活性。氯仿萃取物和水層中物質(zhì)都沒有抑制活性。進一步對乙酸乙酯萃取物初步分離組分進行殺菌活性測定，結(jié)果表明，組分1和組分4整體表現(xiàn)出優(yōu)于其他組分的殺菌活性，其中組分1對棉花紅腐病、蘋果斑點落葉病的抑制率分別達到70.0 %和79.0 %，組分4蘋果斑點落葉病的抑制率也達到74.0 %。但是試驗中所用樣品為對節(jié)白蠟的粗提物，還應(yīng)對粗提物進一步分離提純，確定其活性物質(zhì)，為進一步的深入研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

隨著農(nóng)藥的大面積使用，病蟲對農(nóng)藥的抗性越來越高，并且由于人們對環(huán)境的重視，生物農(nóng)藥也進入人們的視野，我們期望可以從植物中找到一種新的化合物，可以有效的緩解病蟲的抗性，和減少對環(huán)境的傷害。試驗結(jié)果表明，對節(jié)白蠟提取物和初步分離組分對部分病菌具有一定的抑制效果，為有效成分的研究和確定鎖定了范圍，為研究對節(jié)白蠟的抗病原因打下了一定的基礎(chǔ)，可以作為探尋生物農(nóng)藥的新嘗試。

[1]曲式曾，向其柏，蘇丕林.白蠟樹屬一新種——對節(jié)白蠟[J].南京林產(chǎn)工業(yè)學(xué)院學(xué)報,1979,2(1):146-147.

[2]曲式曾，向其柏，蘇丕林.湖北白蠟樹屬一新種[J].植物分類學(xué)報,1980,18(3):366

[3]蘇丕林，廖卉榮，胡功強，等.對節(jié)白蠟(Fraxinushupensischiushanget Su)種質(zhì)資源的分布[J].湖北林業(yè)科技,1994,87 (1):35-41.

[4]彭輔松，李鴻鈞.湖北省第二批國家珍稀瀕危保護植物[J].武漢植物學(xué)研究,1990,18(4):383-385.

[5]蘇丕林.珍貴的對節(jié)白蠟資源[J].植物雜志,1987,11(4):10.

[6]蘇丕林，明 軍，胡功強，等.對節(jié)白蠟資源開發(fā)綜合利用價值與展望[J].湖北林業(yè)科技,1995,94(4):1-4.

[7]馬 力，嚴(yán)慧娟，曲佳佳，等.高效液相色譜法測定對節(jié)白蠟中秦皮甲素的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2010,29(4):525-527.

[8]馬 力，嚴(yán)慧娟，曲佳佳，等.對節(jié)白蠟皮中秦皮甲素和秦皮乙素的含量測定方法[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2010,30(15):1336-1337.

[9]程建如，周明芹.對節(jié)白蠟種質(zhì)資源分布現(xiàn)狀及保育策略[J].長江大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,13(3): 7-9.

[10]曾慶治.對節(jié)自蠟的樹種特性[J].花木盆景(盆景賞石),2009,8(3):35.

[11]凌 冰，王國才，軋 霽，等.苦瓜葉提取物對小菜蛾的拒食活性及有效成分研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,41(10):3116-3122.

[11]向亞林，凌 冰，王國才，等.苦瓜莖葉中葫蘆烷三萜化合物對小菜蛾幼蟲的拒食作用[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2009,30(3):13-17.

[13]陳年春.農(nóng)藥生物測定技術(shù)[M].北京：北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1991:161-162.

StudyonFungicidalActivityofFraxinushupehensisExtractedfromItsLeaves

WU Qing-lai,ZHANG Liang-ju,XU Hui-hui,XU Zhi-hong,LI Jun-kai*

(School of Agricultural,Yangtze University,Hubei Jingzhou 434025,China)

【Objective】The present paper aims to study the cause of disease resistance ofFraxinushupehensisand explore new biology pesticide.【Method】The leaves ofFraxinushupehensiswere extracted and the fungicidal activities were tested in vitro.For locked active components further,the ethyl acetate extract was preliminarily separated by column chromatography and the fungicidal activities were tested in vitro.【Result】The bioassay results indicated that the ethyl acetate extract showed better fungicidal activities than other extract.In particular,the ethyl acetate extract showed bioactivity againstFusariumrotofcottonandAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 78.0 % and 69.0 % at the concentration of 500 (g/mL).The bioassay results also indicated that component 1 and component 4 showed better fungicidal activities than other components.In particular,component 1 showed bioactivity againstFusariumrotofcottonandAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 70.0 % and 79.0 % at the concentration of 500 (g/mL,component 4 also showed bioactivity againstAlternariaalternataf.sp.maliwith the rate of 74.0 % at the concentration of 500 (g/mL).【Conclusion】The extract ofFraxinushupehensisleaves showed a certain fungicidal activities against some fungi,that lay a certain foundation for studying the cause of disease resistance ofFraxinushupehensis.

Fraxinushupehensis; Extraction; Fungicide activity; Biology pesticide

1001-4829(2017)4-0978-03

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.043

2016-06-25

國家自然科學(xué)基金(30971948);湖北自然科學(xué)基金(2014CF 105)

吳清來(1977-)，男，湖南株洲人，講師，研究方向為綠色新農(nóng)藥創(chuàng)制，Tel:15901666143，E-mail: wql106@163.com。

S792.41

A

(責(zé)任編輯 李山云)