禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測

鄧小紅，梁靜真，黎姍梅，呂小麗，韋慕蘭，韓書煜，蒙蘭麗，黃 鈞*，蔣經(jīng)運(yùn)

(1.廣西水生動物病害診斷實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530005；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530022；4.陸川縣水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣站，廣西 陸川 537700；5.全州縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 全州 541500；6.都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 都安 530700；7.田東縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 田東 531500)

禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定、耐藥性及毒力基因檢測

鄧小紅1，5，梁靜真1，2，黎姍梅3，呂小麗4，韋慕蘭6，韓書煜3，蒙蘭麗7，黃 鈞1，2*，蔣經(jīng)運(yùn)5

(1.廣西水生動物病害診斷實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530005；2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；3.廣西水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣西 南寧 530022；4.陸川縣水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)推廣站，廣西 陸川 537700；5.全州縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 全州 541500；6.都安瑤族自治縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 都安 530700；7.田東縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站，廣西 田東 531500)

【目的】對廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場患病禾花鯉進(jìn)行病原菌的分離鑒定，并對其致病性、耐藥特性及6種毒力基因進(jìn)行檢測，為細(xì)菌引起的禾花鯉疾病及防控技術(shù)研究提供理論參考?！痉椒ā繌幕疾『袒幍母闻K、心臟和腎臟等部位取樣分離細(xì)菌，人工感染確定菌株的致病性，API生化鑒定和16S rRNA分子鑒定相結(jié)合進(jìn)行細(xì)菌鑒定，細(xì)菌的耐藥特性試驗(yàn)為K-B紙片擴(kuò)散法，毒力基因以PCR擴(kuò)增法檢測?！窘Y(jié)果】從患病禾花鯉中分離到2株致病力很強(qiáng)的病原菌株TH1和TH3，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %；經(jīng)生化和分子鑒定，2株分離菌株均為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的親緣關(guān)系最近，同源相似度99.80 %；2株菌株對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感；TH1攜帶所檢測的hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6種毒力基因，TH3只攜帶hly、Aer、Alt、Act、ahal5種基因。【結(jié)論】引起廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %，對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感。

禾花鯉；嗜水氣單胞菌；耐藥性；毒力基因

【研究意義】原產(chǎn)于廣西桂北地區(qū)的禾花鯉(Procyprismerus)是鯉(Cyprinuscarpio)的變種，體型短肥，個(gè)體重多在250 g以下，屬小型經(jīng)濟(jì)魚類。禾花鯉因含肉率高、肌肉中富含人體所需的必需氨基酸，營養(yǎng)價(jià)值高[1]而深受消費(fèi)者的喜愛，被列入廣西桂林市農(nóng)產(chǎn)品的十大名牌行列，廣西全州縣也將其作為特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種大力發(fā)展。禾花鯉的稻田養(yǎng)殖在廣西桂北地區(qū)具有悠久歷史，養(yǎng)殖區(qū)域主要集中在興安、全州、灌陽、三江和融安等縣[2]，近年來，禾花鯉的稻田養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，在養(yǎng)殖過程中的病害問題也越來越常見，尤其是細(xì)菌性疾病造成的損失有逐年增加的趨勢，在廣西全州縣各養(yǎng)殖場的禾花鯉經(jīng)常出現(xiàn)暴發(fā)性死亡現(xiàn)象，造成損失嚴(yán)重，對當(dāng)?shù)睾袒庰B(yǎng)殖業(yè)已構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因此，研究患病禾花鯉的病原菌及其藥敏特性顯得尤為迫切和重要。【前人研究進(jìn)展】有關(guān)鯉的細(xì)菌性疾病已有不少報(bào)道，主要有鯉魚的出血病、細(xì)菌性敗血癥、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)病、鰻利斯頓氏菌(Listonellaanguillarum)病、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)病和殺鮭氣單胞菌(Aeromonassalmonicida)病[3-10]，錦鯉的吉氏庫特菌(Kurthiagibsonii)病、潰瘍病和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)病[11-13]，有色鯉魚的遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[14]等。在禾花鯉中，由細(xì)菌引起的疾病目前僅見龍?zhí)K等[15-16]報(bào)道的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)病和暴發(fā)性死亡征，而有關(guān)禾花鯉致病性嗜水氣單胞菌分離鑒定以及禾花鯉病原菌毒力基因型的研究報(bào)道鮮見。【本研究切入點(diǎn)】對引起廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌嗜水氣單胞菌進(jìn)行分離鑒定，研究患病禾花鯉的病原菌及其藥敏特性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)對廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場患病禾花鯉進(jìn)行了病原菌的分離鑒定，并對病原菌的致病性、耐藥特性以及hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp6種毒力基因進(jìn)行檢測，以期為嗜水氣單胞菌引起的禾花鯉疾病及防控技術(shù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

禾花鯉病樣采自廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場，個(gè)體重30.6～38.3 g。健康禾花鯉購自廣西大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場，體長約10 cm，個(gè)體重35 g左右，肉眼未見病癥，購回后先經(jīng)15 d的檢疫暫養(yǎng)，在人工感染試驗(yàn)前，隨機(jī)抽取5尾按常規(guī)進(jìn)行病檢，并取每尾魚的心、肝、脾、腎、腦等組織進(jìn)行細(xì)菌的分離接種，確認(rèn)試驗(yàn)魚健康。

API全自動細(xì)菌鑒定儀及相關(guān)試劑為法國梅里埃公司生產(chǎn)，培養(yǎng)基和細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒分別購自鄭州安圖生物工程股份有限公司和天根生化科技(北京)有限公司，TaqDNA 酶等PCR擴(kuò)增試劑購自寶生物工程(大連)有限公司，瓊脂糖購自Invitrogen(美國)公司，PCR擴(kuò)增的細(xì)菌通用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 病魚的剖檢及細(xì)菌分離

在實(shí)驗(yàn)室中對病魚進(jìn)行常規(guī)剖檢，先后對體表、鰓和內(nèi)臟器官的病癥進(jìn)行肉眼觀察，對體表粘液、鰓組織和腸道內(nèi)膜取樣鏡檢，進(jìn)行寄生蟲檢查。

從病魚的心臟、肝臟等組織取樣進(jìn)行細(xì)菌分離接種，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取優(yōu)勢菌落純化后置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 無菌濾液的人工感染

無菌濾液是參照黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法，取病魚的內(nèi)臟器官勻漿，10 ℃條件下高速離心0.5 h后取上清液，經(jīng)微孔細(xì)菌濾器過濾后獲得，并以平板涂布培養(yǎng)法檢測其無菌性。將健康禾花鯉隨機(jī)分成30尾/組的試驗(yàn)和對照2組，通過胸鰭基部腹腔注射分別注射無菌濾液和無菌生理鹽水(0.2 mL/尾)，注射后連續(xù)飼養(yǎng)觀察18 d。期間正常飼養(yǎng)管理，連續(xù)充氣增氧，每天上午和下午各1次對受試魚的發(fā)病及死亡等情況進(jìn)行記錄。

1.4 分離菌株的人工感染

以無菌生理鹽水將經(jīng)過3次復(fù)壯培養(yǎng)的備用菌株新鮮培養(yǎng)物制成菌懸液，菌懸液的細(xì)菌濃度以WGZ-2-XJ細(xì)菌濁度儀進(jìn)行調(diào)整。按無菌濾液的人工感染方法進(jìn)行第1次人工感染試驗(yàn)，從第1次人工感染試驗(yàn)中取發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀相似的瀕死個(gè)體分離細(xì)菌后，按同樣的方法再進(jìn)行第2次人工感染試驗(yàn)。試驗(yàn)期間的日平均水溫為(25.5±1.3) ℃。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 菌株基本形態(tài)及溶血性觀察 革蘭氏染色觀察菌株的形態(tài)和染色特性，將分離菌株接種于兔血培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察其溶血性。

1.5.2 生化鑒定 以API全自動細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。

1.5.3 分子鑒定 按黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法，將分離菌株在28 ℃震蕩(200 r/min)培養(yǎng)16 h后，配成濃度約0.5 MCF的菌懸液，經(jīng)離心收集菌體，細(xì)菌DNA提取后-20 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物為fD1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。反應(yīng)體系(25 μl)及擴(kuò)增條件除DNA模板調(diào)為2 μl和退火溫度調(diào)為58 ℃外，其余均按黃鈞等[18]的方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后以1.5 %瓊脂糖凝膠電泳法(100 V電壓下電泳35 min)進(jìn)行鑒定，凝膠成像分析系統(tǒng)觀察，根據(jù)電泳條帶確定和記錄結(jié)果，PCR產(chǎn)物送華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。多重序列比對分析以CLUSTAL X軟件完成，系統(tǒng)發(fā)育樹以MEGA6.1軟件構(gòu)建。

1.6 菌株的耐藥性試驗(yàn)

K-B紙片擴(kuò)散法，藥敏紙片從杭州天和微生物試劑有限公司購得，試驗(yàn)及結(jié)果判定按黃鈞等[18]的方法進(jìn)行。

1.7 菌株的毒力基因型檢測

先按黃艷華等[17]、黃鈞等[18]的方法提取細(xì)菌基因組DNA后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。各選1對特異性引物對菌株的毒力基因hly、Aer、Alt、Act、ahal和ahp進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物序列、退火溫度、基因片段大小、目的基因的鑒定等均按黃艷華等[17]和黃鈞等[18]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚的主要癥狀及細(xì)菌分離結(jié)果

肉眼觀察到的自然發(fā)病禾花鯉主要癥狀為：體表發(fā)紅有大量粘液、無肉眼可見寄生蟲，腹部腫大，肛門發(fā)紅，鰓腫脹，鰓絲末端溶解，體腔中有大量腹水，膽囊腫大，脾臟腫大。對體表粘液、鰓組織和腸道內(nèi)膜的鏡檢結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)寄生蟲。從兩口發(fā)病池塘患病禾花鯉肝臟組織中共分離到2株β-溶血的優(yōu)勢菌株TH1和TH3，均為革蘭氏陰性短桿菌，2株菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形，邊緣完整光滑，中央微隆起，白色或淡黃色，半透明，直徑1.25～2.06 mm。

2.2 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

涂布于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的無菌濾液經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h無菌落，將無菌濾液人工感染禾花鯉18 d后，試驗(yàn)組、對照組的禾花鯉均無病癥出現(xiàn)，也無死亡現(xiàn)象。據(jù)此認(rèn)為廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場禾花鯉發(fā)病死亡由病毒引起的可能性不大。

2次菌懸液人工感染結(jié)果，TH1和TH3對禾花鯉均有很強(qiáng)的致病力，試驗(yàn)組在注射菌懸液后8～24 h出現(xiàn)死亡，3～5 d為死亡高峰期，6～7 d全部死亡(表1)，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對照組的成活率為100.00 %，且活動和攝食均正常，無肉眼可見的病癥。注射菌懸液后開始出現(xiàn)死亡的試驗(yàn)魚發(fā)病癥狀不明顯，2 d后發(fā)病死亡的個(gè)體均出現(xiàn)鰓腫脹，鰓絲末端溶解，體表發(fā)紅粘液多，腹部膨大，肛門發(fā)紅，體腔中有大量腹水，膽囊和脾臟腫大等與自然發(fā)病魚很相似的癥狀。表明TH1和TH3菌株都是引起廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場禾花鯉發(fā)病死亡的病原菌。

2.3 API生化鑒定結(jié)果

TH1、TH3均為氧化酶試驗(yàn)陽性，在API生化試驗(yàn)中，2株病原菌的硝酸鉀、色氨精、葡萄糖、精氨酸、七葉靈、明膠、對硝基-β-D甲基半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、麥芽糖、葡萄糖酸鹽、癸酸、蘋果酸、檸檬酸和四甲基-對一苯二胺試驗(yàn)呈陽性，脲素和苯乙酸試驗(yàn)呈陰性；已二酸試驗(yàn)TH1呈陰性，TH2呈陽性。API鑒定結(jié)果，2株病原菌均為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。

表1 分離菌株的人工感染結(jié)果Table 1 Results of artificial infection of isolated strains

表2 病原菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑，mm)Table 2 Antibiotic sensitivity test results of the tested strains (Diameter of inhibition zone，mm)

2.4 分子鑒定結(jié)果

16S rRNA基因片段的PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，病原菌TH1和TH3的16S rRNA基因序列長度均為1373 bp(圖1)，GenBank登錄號分別為KU143917和KT961634。將菌株的序列與Genbank中已有序列進(jìn)行BLAST比對結(jié)果，TH1和TH3與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株AeromonashydrophilaATCC 7966(NR 118944)的親緣關(guān)系最近，同源相似度均為99.80 %。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

2.5 菌株的耐藥特性

對2株病原菌都高度敏感的藥物有多粘菌素B、左氧氟沙星、頭孢他啶鈉、依諾沙星和硫酸新霉素5種，都不敏感的藥物有青霉素G、氨芐青霉素、氟苯尼考和磺胺對甲氧嘧啶4種。對其他藥物的敏感性在2株病原菌株之間存在較大差異(表2)。

2.6 毒力基因檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，病原菌TH1和TH3擴(kuò)增到的毒力基因片段均與預(yù)期片段大小相符，檢測結(jié)果，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-。

圖1 TH1和TH3的16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of 16S rRNA genes of strain TH1 and TH3

3 討 論

引起廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場大批禾花鯉發(fā)病死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，與眾多學(xué)者對鯉的細(xì)菌性疾病研究結(jié)果[5-9,11-14]不同，與龍?zhí)K等[15-16]從患病禾花鯉中分離到病原菌也不一致。綜合前人和本試驗(yàn)的研究結(jié)果可以看出，禾花鯉等多種鯉魚細(xì)菌性疾病的病原菌種類表現(xiàn)為多樣性，均可造成嚴(yán)重危害，尤其是嗜水氣單胞菌，是鯉魚養(yǎng)殖過程中危害特別嚴(yán)重的常見病原菌，一些如鰻利斯頓氏菌、肺炎克雷伯氏菌、吉氏庫特菌、熒光假單胞菌、簡達(dá)氣單胞菌和銅綠假單胞菌等是近年來在多種鯉魚中新發(fā)現(xiàn)的病原菌，應(yīng)引起廣大魚病工作者和養(yǎng)殖人員的共同關(guān)注。

本試驗(yàn)從患病禾花鯉中分離到的2株嗜水氣單胞菌TH1和TH3對禾花鯉的致死率均為100.00 %，與該菌對其他水生動物人工感染試驗(yàn)的致死率結(jié)果[19-21,22-24]一致。另外，本試驗(yàn)中，2株菌株雖然都是嗜水氣單胞菌，但在API鑒定中發(fā)現(xiàn)兩者的生化特性稍有不同，這一差異主要與2株菌株對已二酸的分解結(jié)果不同有關(guān)。

在本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果中，2株病原菌TH1、TH3對藥物的敏感性存在較大差異。都高度敏感的藥物只有5種，都不敏感的藥物有4種，對其他藥物的敏感性2株菌株之間存在較大差異(表2)。已知嗜水氣單胞菌因毒力基因型不同，其致病力也不同[23]，2株病原菌株TH1和TH3對藥物敏感性存在差異，是否與菌株所攜帶的耐藥基因不同有關(guān)，有待進(jìn)行更深入的研究。很多情況下，防治由嗜水氣單胞菌等細(xì)菌引起的水生動物疾病常以含氯消毒劑作為外用藥[20]。

圖2 TH1和TH3的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences of strain TH1 and TH3

據(jù)已有的檢測結(jié)果，黃沙鱉源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的基因型分別有10和6種，均以hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+為主，分別占檢測菌株數(shù)的55.74 %和50.00 %[23-24]；胡子鯰源氣單胞菌的毒力基因型也各有不同，其中，嗜水氣單胞菌的毒力基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+2種，而溫和氣單胞菌為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-和hly-Aer+Alt-Act+ahal-ahp-2種[25]。本試驗(yàn)中，TH1的毒力基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+，與黃沙鱉源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的主要毒力基因型一致，這一基因型在胡子鯰源嗜水氣單胞菌中也檢測到，但在胡子鯰源溫和氣單胞菌中未檢測到[27]，可能與檢測樣本量有關(guān)；TH3的基因型為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，這一基因型在胡子鯰源嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌中均檢測到[27]，但在黃沙鱉源嗜水氣單胞菌(61株)和溫和氣單胞菌(14株)中均未檢測到[17-18，23-24]，這種差異是否與菌株的動物源性不同有關(guān)，尚須更多的深入研究結(jié)果予以證明。TH1和TH3攜帶所檢6種毒力基因中包含hly和Act在內(nèi)的5到6種，對禾花鯉的致死率均為100.00 %，均屬強(qiáng)毒株，此結(jié)果與劉杰等[23]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

引起廣西全州縣飛機(jī)坪魚種場禾花鯉大批死亡的病原菌是嗜水氣單胞菌，2株菌株TH1和TH3的毒力基因型分別為hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+和hly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-，對健康禾花鯉的致死率均為100.00 %，對硫酸新霉素等5種藥物高度敏感，對青霉素G等4種藥物不敏感。

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[19]劉 杰,龍宜楠,黃 鈞,等.黃顙魚暴發(fā)性流行病病原的分離鑒定及其3種毒力基因檢測[J].淡水漁業(yè),2015,45(2)：59-61.

[20]梁正生,黃 鈞,施金谷,等.黃顙魚腹水病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,43(9)：1400-1404.

[21]黃 鈞,溫華成,施金谷,等.黃顙魚體表潰瘍病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,43(1)：107-112.

[22]鄧小紅,牛志偉,龍 蘇,等.羅非魚套腸病病原菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)[J].廣西畜牧獸醫(yī),2015,31(3)：152-154.

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[25]龍 蘇,韓書煜,牛志偉,等.胡子鯰致病性氣單胞菌的分離鑒定及其致病力與毒力基因型相關(guān)性[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2016,40(3)：308-317.

Isolation,Identification,AntibioticResistanceandVirulenceGenesDetectionofPathogenicAeromonashydrophilainCyprinuscarpio

DENG Xiao-hong1，5，LIANG Jing-zhen1，2，LI Shan-mei3，LV Xiao-li4，WEI Mu-lan6，HAN Shu-yu3，MENG Lan-li7，HUANG Jun1，2*，JIANG Jing-yun5

(1.Guangxi Aquatic Animal Diseases Diagnosis Laboratory,Guangxi Nanning 530005,China; 2.College of Animal Science and Technology,Guangxi University,Guangxi Nanning 530004,China; 3.Guangxi General Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Nanning 530022,China; 4.Luchuan Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Luchuan 537700,China; 5.Quanzhou Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Quanzhou 541500,China; 6.Du’an Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Du’an 530700,China; 7.Tiandong Station of Aquaculture Technology Extension,Guangxi Tiandong 531500,China)

【Objective】In order to providea reference for effective prevention and control of bacterial disease ofProcyprismerus,the study was conducted to isolate and identify the pathogen of bacterial disease inProcyprismerus in the Feijiping fingerling farm in Quanzhou Guangxi,the pathogenicity,antibiotic resistance and six kinds of virulence genes of the pathogen were tested.【Method】The pathogen was isolated from parts such as the liver,heart and spleen tissues in the diseasedProcyprismerus in this study.An artificial infection was measured on the pathogenicity of the isolated strains.Bacterial identification was finished by API biochemical analysis combined with 16S rRNA gene sequencing.The K-B paper diffusion method was used to test antibiotic resistance of the pathogen,presence of virulence genes was determined by using the PCR method.【Result】Two virulent pathogenic strains TH1 and TH3 were isolated from diseasedProcyprismerus.The two strains both contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus carps.Moreover,the strains were both identified asAeromonashydrophila,and had the closest genetic relationship relatives with the standard strain ATCC 7966 (NR 118944) ofA.hydrophila,sharing homology of 99.80 %.The two strains were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.Strain TH1 carried six kinds of virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahalandahp.Whereas strain TH3 carried five virulence genes includinghly,Aer,Alt,Act,ahal.【Conclusion】The pathogens causing fulminant death ofProcyprismerus wereA.hydrophilain the Feijiping fingerling farm in Quanzhou,Guangxi.The genotypes of the pathogenic strain TH1 and TH3 werehly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp+andhly+Aer+Alt+Act+ahal+ahp-,respectively,and the pathogens contributed a fatality rate of 100.00 % to healthyProcyprismerus.The pathogens were highly sensitive to five kinds of antibiotics including neomycin sulphate,however,they were insensitive to four kinds of antibiotics including penicillin G.

Procyprismerus;Aeromonashydrophila; Antibiotic resistance; Virulence genes

1001-4829(2017)4-0952-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.4.038

2016-12-10

廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局專項(xiàng)項(xiàng)目(桂漁牧財(cái)[2013]35號，桂漁牧財(cái)[2014] 52號，桂漁牧財(cái)[2015] 97號)

鄧小紅(1976-)，女，廣西全州人，工程師，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖及病害防控技術(shù)的研究和推廣，E-mail：574875004 @qq.com，*為通訊作者，E-mail：hj1351@163.com。

S965.116

A

(責(zé)任編輯 王冠玉)