液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食用動(dòng)物血液中伊維菌素殘留

李光滿(mǎn), 夏明星, 唐 璜，陳宗祥, 李應(yīng)國(guó)

（1.萬(wàn)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶404020；2.涪陵出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶408008；3.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶 400020）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食用動(dòng)物血液中伊維菌素殘留

李光滿(mǎn)1, 夏明星1, 唐 璜2，陳宗祥1, 李應(yīng)國(guó)3*

（1.萬(wàn)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶404020；2.涪陵出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶408008；3.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶 400020）

本試驗(yàn)旨在建立一種檢驗(yàn)食用動(dòng)物血液中伊維菌素獸藥殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙腈提取，采用液質(zhì)聯(lián)用儀電噴霧離子源（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)峰面積法定量。進(jìn)行回收率、精密度和檢出限等技術(shù)要素評(píng)價(jià)。本方法在15 min內(nèi)完成目標(biāo)化合物分析；伊維菌素在10.0～50.0 μg/L濃度范圍內(nèi)均呈良好線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，添加3個(gè)濃度水平（10、20、40 μg/kg）伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，豬血、羊血、牛血、兔血、雞血、鴨血的平均回收率為75.6%～95.5%，RSD為1.44%～8.57%，本方法檢出限（LOQ）為10 μg/kg。該方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，可適用于食用動(dòng)物血液樣品中伊維菌素含量檢測(cè)。

伊維菌素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；食用動(dòng)物血液；獸藥殘留

伊維菌素是新型的廣譜、高效、低毒抗生素類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲(chóng)特別是線(xiàn)蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺作用。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用于豬、馬、牛、羊、家畜等多種動(dòng)物，具有廣譜、高效、安全等優(yōu)點(diǎn)。超劑量使用可引起中毒，無(wú)特效解毒藥。肌內(nèi)注射會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的局部反應(yīng)。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于伊維菌素檢測(cè)的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法比較多，常見(jiàn)方法有液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法等[1-5]，檢測(cè)對(duì)象主要為牛奶、奶粉、河豚魚(yú)、鰻魚(yú)和烤鰻、水產(chǎn)品、飼料、牛肉、牛肝等[6-14]?，F(xiàn)行有效的國(guó)家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)伊維菌素藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法僅適用于河豚魚(yú)、鰻魚(yú)和烤鰻、牛奶、奶粉、牛肉、牛肝、動(dòng)物源性食品[11-14]，還沒(méi)有針對(duì)食用動(dòng)物血液的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。當(dāng)有機(jī)溶劑乙腈與食用動(dòng)物血液接觸時(shí)，產(chǎn)生團(tuán)狀不溶解沉淀，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道[2-5]均采用高速離心方法將血清與血槳分離，其伊維菌素的分析結(jié)果準(zhǔn)確性會(huì)受影響。本試驗(yàn)采用食用動(dòng)物全血檢測(cè)；提取采用內(nèi)標(biāo)法定量，不再需要通過(guò)固相萃取柱凈化，方法操作簡(jiǎn)單，定性定量準(zhǔn)確，靈敏度等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)滿(mǎn)足殘留檢測(cè)要求，以期為伊維菌素的檢測(cè)研究提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：伊維菌素（Ivermetine，CAS號(hào)：70288-86-7），純度均大于96%、伊維菌素同位素內(nèi)標(biāo)（Ivermetin-d2），純度大于98%。試驗(yàn)所用試劑包括乙腈、甲酸、乙酸銨、氯化鈉、吸附劑PSA、微孔濾膜。試驗(yàn)用水均為超純水，豬血、羊血、牛血、兔血、雞血、鴨血均為外購(gòu)，用抗凝采血管收集，采集數(shù)量不得少于20 mL，密封，并標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。待檢血液試樣于4℃保存，留存血液試樣于-18℃冷凍保存。

1.2 儀器與設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)AB公司 4000Qtrap）：配電噴霧離子源（ESI）；天平（瑞士梅特勒-托利多公司XS204）；離心機(jī)（Sigma公司）；旋渦混勻器；超聲清洗器；氮吹儀。1.3 方法

1.3.1 溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱(chēng)取伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確到0.0001g），用乙腈充分溶解，稀釋定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，將伊維菌素同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈充分溶解，稀釋定容于10 mL容量瓶中，配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，最后分別將定容后的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液倒入棕色試劑瓶中，-18℃以下避光保存。根據(jù)需要用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成合適的濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)溶液，參考線(xiàn)性濃度范圍為10～50 ng/mL，伊維菌素同位素內(nèi)標(biāo)濃度為20 ng/mL，臨用時(shí)現(xiàn)配。

5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液：稱(chēng)取0.385 g乙酸銨于燒杯中，用水溶解，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，用水洗滌燒杯至少3次，直至洗凈，并將洗液全部轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，再加入1 mL甲酸于1 000 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.2 樣品前處理 ①采樣和試樣制備：動(dòng)物血液用抗凝采血管收集，采集數(shù)量不得少于20 mL，密封，并標(biāo)記，備用。②提?。悍Q(chēng)取2.0 g（精確到0.01 g）試樣和0.5 g氯化鈉于50 mL離心管中，加入40 μL的1 mg/mL伊維菌素同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液、3 mL水和 10 mL乙腈，旋渦混勻2 min，振蕩提取30 min，以8 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液5 mL氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL乙腈，加入30 mg吸附劑PSA，超聲溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 mm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定和確證。

1.3.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件 ①液相色譜條件。色譜柱：Kinetex 2.6μ C18100A，New Column 100 mm×4.6mm；流動(dòng)相：5 mmol/L乙酸銨+0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；流速: 0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30℃；液相色譜梯度洗 脫 程 序：0～1.0 min，50%A～50% B；1.0～12.0 min，5%A～95% B；12.0～12.1 min，50%A～50%B；12.0～13.0 min，5%A～95% B；12.1～15.0 min，50%A～50% B。伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖見(jiàn)圖1。在上述色譜條件下，伊維菌素的參考保留時(shí)間分別約為7.60 min。②質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離ESI（+），電噴霧電壓：5.5 kV，霧化氣壓力：50 Psi及干燥氣：20 L/min；碰撞氣壓力：Medium。離子源溫度：600℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化 分別將伊維菌素及內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成20 μg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，不接色譜柱，使用兩通連接液相色譜與質(zhì)譜，首先在正離子模式下進(jìn)行全掃描，確定化合物的分子離子，將分子離子作為母離子，給予一定的碰撞能量和碰撞氣體，全掃描二級(jí)離子，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的2個(gè)子離子分別作為定性及定量離子，并優(yōu)化母離子電壓和碰撞電壓，伊維菌素及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表1。

圖 1 伊維菌素（10 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液和伊維菌素同位素內(nèi)標(biāo)（20 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖

表1 伊維菌素及內(nèi)標(biāo)藥物質(zhì)譜參數(shù)

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 提取條件優(yōu)化 血液中蛋白質(zhì)與乙腈混合產(chǎn)生團(tuán)狀不可逆溶沉淀，對(duì)伊維菌素不能進(jìn)行有效提取，為了改善沉淀程度，采取血液中先加入水，后加入乙腈的方式；同時(shí)，為了讓乙腈有機(jī)相與水相有效分離，再加入適量氯化鈉。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，0.5 g氯化鈉，3 mL水和10 mL乙腈的比例最佳。

2.2.2 提取方式的選擇 QuEChERS方法凈化樣品時(shí)，常用PSA去除糖、有機(jī)酸和脂肪酸等干擾物，GCB去除葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素等色素化合物，C18去除脂肪和脂類(lèi)等非極性有機(jī)化合物。以豬血為樣品，比較了 PSA、C18、PCX、GCB、NH2吸附劑用量均為10 mg時(shí)對(duì)樣品的凈化效果。結(jié)果表明，PSA凈化時(shí)，樣品的回收率較其他吸附劑高。故本研究最終選擇PSA吸附劑凈化樣品。試驗(yàn)比較了PSA吸附劑用量為10、20、30、50 mg時(shí)回收率和基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，PSA吸附劑用量為10 mg凈化時(shí)，用量過(guò)少，回收率較低，基質(zhì)干擾較大；PSA吸附劑用量為30、50 mg凈化時(shí)，回收率和基質(zhì)效應(yīng)無(wú)太大差別，考慮經(jīng)濟(jì)成本，最終選擇30 mg PSA吸附劑凈化樣品。

2.3 方法的線(xiàn)性范圍及檢出限 伊維菌素在10.0～50.0 μg/L濃度范圍均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為y=0.0443x+0.225及相關(guān)系數(shù)為r=0.9999，伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2。

圖2 采用LC-MS/MS法測(cè)定時(shí)伊維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

食用動(dòng)物如豬、牛、羊、兔、雞、鴨血液中添加濃度為10 μg/kg時(shí)，其信噪比（S/N）滿(mǎn)足信噪比≥3和信噪比≥10的定性定量要求，同時(shí)根據(jù)資料，中國(guó)沒(méi)有伊維菌素的限量，歐盟對(duì)所有哺乳動(dòng)物食品生產(chǎn)品種中肌肉、腎臟的伊維菌素殘留量限值為30 μg/kg，供港豬的伊維菌素殘留量限值為15 μg/kg，因此選擇10 μg/kg濃度作為方法的檢出限可以滿(mǎn)足要求。因此，選擇10 μg/kg濃度作為方法的檢出限可以滿(mǎn)足要求。

表2 采用LC-MS/MS法測(cè)定動(dòng)物血液樣品中的加標(biāo)回收率結(jié)果 （n=6）

2.4 回收率及精密度實(shí)驗(yàn) 通過(guò)LC-MS/MS方法檢測(cè)添加伊維菌素的血液樣品的含量，通過(guò)計(jì)算回收率驗(yàn)證方法的技術(shù)要素，伊維菌素在豬血、牛血、羊血、雞血、鴨血中的平均回收率為75.6%～95.5%，處于60%～120%，滿(mǎn)足方法技術(shù)要素對(duì)回收率的要求，精密度值為1.44%～8.57%，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定 用本方法對(duì)豬血、牛血、羊血、兔血、雞血、鴨血樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果都低于檢出限。

3 結(jié) 論

本方法選擇水:乙腈（3:10）作為提取溶劑提取伊維菌素，PSA吸附劑較大程度去除了基質(zhì)所帶來(lái)的干擾。此方法在10.0～50.0 μg/L濃度范圍均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，而且靈敏度高，最低檢出限為10 μg/kg，伊維菌素回收率在75.6%～95.5%，RSD為1.44%～8.57%。此方法穩(wěn)定性高，重現(xiàn)性好。因此，本方法適用于動(dòng)物食品中伊維菌素殘留量的常規(guī)檢測(cè)。

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Determination of Ivermectin Residue in the blood of the Food-animals by Liquid Chromatography-Mass spectrometry

LI Guang-Man1, XIA Ming-Xing1, TANG Huang2, CHEN Zong-Xiang1, LI Ying-Guo3*

(1. Wanzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 404020, China;2. Fuling Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 408008, China;3. Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 400020, China)

To determination of the blood samples of the food-animals by liquid chromatography - mass spectrometric (LCMS/MS). the blood samples of the food-animals were extracted with acetonitrile. Using LC-MS/MS (ESI+) with multiple reactions monitoring (MRM), the internal standard peak area method. Evaluation of recovery, precision and detection limit,etc. The method completes the analysis of the target compounds within 15 min. The concentration range of 10.0～50.0 μg/L Ivermectin are in a good linear relationship, the correlation coefficient for R2= 0.9999, The recoveries were ranged from 75.6% to 95.5% for the pigs blood, sheep blood, cattle blood, rabbit blood, chicken blood, duck blood with 3 spiked levels of 10, 20 and 40 μg/kg. The relative standard deviations (RSDs) were 1.44%～8.57% (n=6), and the limits of quantitation(LOQ) for pigs blood, sheep blood, cattle blood, rabbit blood, chicken blood, duck blood were 10 μg/kg. The proposed method is fast, accurate and sensitive, which is suitable for detecting Ivermectin residues in the blood samples of the foodanimals.

Ivermectin; Liquid chromatography-mass spectrometry; The blood of the food-animals; Residues of veterinary drug

S859.84

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-106

2017-05-22；

2017-06-15

重慶市應(yīng)用開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014yykfB80016）；國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)2014年第三批出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃項(xiàng)目（2014B371）

李光滿(mǎn)（1986-），女，重慶人，碩士，主要從事食品理化檢測(cè)，E-mail: 348144432@qq.com

* 通訊作者：李應(yīng)國(guó)，E-mail: 389586108@qq.com