延邊黃牛ANGPTL4基因組織表達(dá)規(guī)律與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)性研究

徐 暢，宋霽軒，龐 吉吉，王冰冰，張 帥，夏廣軍

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

延邊黃牛ANGPTL4基因組織表達(dá)規(guī)律與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)性研究

徐 暢，宋霽軒，龐 吉吉，王冰冰，張 帥，夏廣軍*

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉133002）

為分析ANGPTL4基因在延邊黃牛各組織中的表達(dá)差異，進(jìn)一步探討該基因在肌內(nèi)脂肪沉積中的作用，本實(shí)驗(yàn)利用qRT-PCR法比較分析了ANGPTL4基因在延邊黃牛7個(gè)組織（心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和后腿?。┲械谋磉_(dá)水平及其與肌內(nèi)脂肪沉積的相關(guān)性。結(jié)果表明：ANGPTL4基因在7個(gè)組織中表達(dá)水平從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長(zhǎng)肌和后腿肌，肝中表達(dá)量極顯著高于心、脾、肺、腎、后腿肌和背最長(zhǎng)肌組織（P<0.01），肺中表達(dá)量顯著高于心、脾、腎、后腿肌和背最長(zhǎng)肌組織（P<0.05）；背最長(zhǎng)肌中ANGPTL4基因的表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.924；ANGPTL4基因在后腿肌的表達(dá)量與后腿肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.998。結(jié)果顯示，ANGPTL4基因影響延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積。

延邊黃牛；ANGPTL4基因；組織表達(dá)譜；肌內(nèi)脂肪沉積

血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-like Protein 4，ANGPTL4），也稱(chēng)禁食誘導(dǎo)脂肪因子，屬于類(lèi)血管生成素家族成員之一[1]。ANGPTL4是與血管生成、脂類(lèi)代謝、葡萄糖代謝、胰島素敏感性密切相關(guān)的分泌性蛋白質(zhì)因子[2]。研究表明，ANGPTL4可以促進(jìn)脂肪酸氧化，并通過(guò)抑制脂蛋白酯酶（Lipoprotein Lipase，LPL）的活性和促進(jìn)脂肪水解而直接影響脂類(lèi)代謝，促進(jìn)脂肪沉積[3]。大量研究表明，ANGPTL4 基因是過(guò)氧化物增殖物激活體受體（Peroxisome Prolifer Atoractivated Receptors，PPARs）γ 的下游靶基因，ANGPTL4基因的表達(dá)受PPAR 所有配體的激活，PPAR是調(diào)控脂類(lèi)分化和葡萄糖代謝動(dòng)態(tài)平衡的核受體，因此認(rèn)為ANGPTL4 基因可能在脂類(lèi)代謝和葡萄糖代謝動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)控方面發(fā)揮作用[4-5]。Legry 等研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4 基因的rs4076317 多態(tài)位點(diǎn)與青少年高脂肪率顯著相關(guān)[6]。馬云[7]克隆了牛ANGPTL4基因序列，發(fā)現(xiàn)了該基因的遺傳變異與牛育肥后肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)。ANGPTL4基因在牛肝臟和脂肪組織中表達(dá)量較高[8]。目前，在人和鼠上對(duì) ANGPTL4 基因的研究報(bào)道較多，而在家畜上的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)以我國(guó)五大地方良種牛之一的延邊黃牛為研究對(duì)象，利用qRT-PCR檢測(cè)ANGPTL4基因在延邊黃牛7個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)分析其在肌肉組織中的表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪沉積的關(guān)系，為揭示延邊黃牛ANGPTL4基因的表達(dá)特點(diǎn)，并進(jìn)一步探討ANGPTL4基因在牛的肉質(zhì)調(diào)控中的作用及其分子機(jī)制提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 選取吉林省琿春吉興牧業(yè)有限公司6月齡延邊黃牛公牛70頭，在相同飼養(yǎng)條件育肥至36月齡屠宰。從宰前活重相近的個(gè)體中隨機(jī)選擇3頭，分別采集心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和后腿肌7個(gè)組織樣品，每個(gè)組織采集3 g，并分割成0.3 cm3的小組織塊裝入凍存管，然后立即放入液氮低溫保存，以備提取總RNA。同時(shí)采取第12～13肋間背最長(zhǎng)肌和后腿肌，-20℃保存，用于IMF含量測(cè)定。

1.1.2 主要分子生物學(xué)軟件及數(shù)據(jù)庫(kù) 引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier5.0、Oligo6.0；GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 本實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參基因。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛的ANGPTL4基因序列，利用Primer5.0和Oligo6.0設(shè)計(jì)引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.2.2 總RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè) 每個(gè)樣品取0.5 g放入無(wú)RNAase處理過(guò)的研缽中加入液氮充分研磨，按 Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取總 RNA。利用超微量分光光度計(jì)ND-2000和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄 冰上操作反轉(zhuǎn)錄整個(gè)過(guò)程，建立反轉(zhuǎn)錄混合液體系：dNTP混合液（10 mmol/L）1 μL，寡dT引物（2.5 μmol/L） 1 μL，RNA 2 μL，無(wú)RNA酶雙蒸水 6 μL，總體積 10 μL。在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)，65℃ 5 min；4℃保存。瞬時(shí)離心，使混合液聚集于反應(yīng)管的底部。建立反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述反應(yīng)液 10 μL，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑（40 U/μL） 0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，無(wú)RNA酶雙蒸水5 μL，總體積20 μL。反應(yīng)程序：42℃ 30 min；95℃ 5 min；4℃保存。

1.2.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)操作方法 按照SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。冰上配制qRT-PCR反應(yīng)液：SYBR預(yù)混液（2×） 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，cDNA模板 2 μL，無(wú)RNA酶雙蒸水6.4 μL，總體積 20 μL。反應(yīng)程序：①預(yù)變性：95℃ 30 s（升溫速率4.4℃/s）。②PCR（分析模式：定量分析）：95℃ 5 s （升溫速率4.4 ℃/s）；60℃ 30 s（升溫速率 2.2℃ /s，Acquisition Mode：Single）循環(huán)40次。③熔解（分析模式：熔解曲線(xiàn)）：95℃ 5 s（升溫速率4.4℃ /s）；60℃ 1 min（升溫速率2.2℃/s）；95℃（升溫速率0.11℃/s，Acquisition Mode：Continuous，Acquisitions：5 per℃）。④降溫：50℃ 30 s（升溫速率2.2℃/s）。

1.2.5 IMF含量測(cè)定 稱(chēng)取背最長(zhǎng)肌和后腿肌樣本各10 g左右，利用索氏抽提法進(jìn)行IMF含量測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用2－ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt目的基因= Ct目的基因－ Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt =ΔCt試驗(yàn)組－ ΔCt對(duì)照組。采用 SPSS 19.0 進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A280在1.9～2.1，表明RNA質(zhì)量較好。1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，18S和28S條帶清晰，無(wú)條帶彌散現(xiàn)象（圖1）。符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的要求。

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.2 qRT-PCR的產(chǎn)物特異性 從ANGPTL4基因qRT-PCR 擴(kuò)增和熔解曲線(xiàn)（圖2）可以看出，ANGPTL4 基因的PCR 產(chǎn)物只有1 個(gè)特異峰，無(wú)引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，可用于進(jìn)一步的熒光定量檢測(cè)分析。

2.3 ANGPTL4基因組織表達(dá)譜分析 根據(jù)表2可知，ANGPTL4基因在延邊黃牛7個(gè)組織中均有表達(dá)，其中，肝中表達(dá)量極顯著高于心、脾、肺、腎、后腿肌和背最長(zhǎng)肌組織（P<0.01），肺中表達(dá)量顯著高于心、脾、腎、后腿肌和背最長(zhǎng)肌組織（P<0.05）。ANGPTL4基因表達(dá)水平在7個(gè)組織中從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長(zhǎng)肌、后腿肌。

表1 qRT-PCR引物

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4 ANGPTL4基因在肌肉組織中的表達(dá)與IMF含量的相關(guān)性分析 根據(jù)表3可知，背最長(zhǎng)肌中ANGPTL4基因的表達(dá)量與背最長(zhǎng)肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05），相關(guān)系數(shù)為0.924；ANGPTL4基因在后腿肌的表達(dá)量與后腿肌的IMF含量呈顯著正相關(guān)（P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.998。

表3 ANGPTL4 mRNA表達(dá)量與IMF含量的相關(guān)性分析

3 討 論

哺乳動(dòng)物的脂類(lèi)代謝、糖代謝、血管生成都受ANGPTL4基因調(diào)控[9]，ANGPTL4基因是一種具有廣泛生理功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[10-11]，與代謝、脂類(lèi)代謝以及血管生成都密切相關(guān)[1]，ANGPTL4基因的適量表達(dá)或過(guò)量表達(dá)都可能不同程度引起血漿不飽和脂肪酸濃度的升高[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取延邊黃牛的不同組織，利用qRT-PCR檢測(cè)ANGPTL4基因在延邊黃牛7個(gè)組織中的相對(duì)表達(dá)量，分析延邊黃牛ANGPTL4基因不同組織的表達(dá)情況及其與肌內(nèi)脂肪的相關(guān)性。

基因在組織中表達(dá)受多因素的影響，不同組織的基因表達(dá)量存在差異。Mandard等[13]研究發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在牛的肝臟和脂肪組織中高表達(dá)，同時(shí)在心臟、腎臟、胰臟、骨骼肌中也有表達(dá)。豐勝求等[14]對(duì)豬ANGPTL4基因表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織、肝臟、腎臟中高表達(dá)，心臟、脾臟、肌肉等其他組織少量表達(dá)。Dutton等[15]對(duì)小鼠的ANGPTL4基因表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，ANGPTL4基因在其研究的5個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在肝臟表達(dá)量最高。以上3個(gè)研究與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)牛7個(gè)組織研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在肝臟的表達(dá)量最多，在后腿肌部分表達(dá)量最少。

Feng等[16]研究了ANGPTL4基因在瘦肉型豬和脂肪型豬組織中的表達(dá)差異， ANGPTL4基因?qū)ν晃锓N不同類(lèi)型或不同部位的脂肪沉積都發(fā)揮著不同的作用，ANGPTL4基因在肥胖型豬的表達(dá)量較高，瘦肉型豬的表達(dá)量略低，脂肪型豬對(duì)脂肪沉積有增加作用，說(shuō)明ANGPTL4可能與脂肪沉積有關(guān)。這與本實(shí)驗(yàn)中牛ANGPTL4基因的研究結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4基因在延邊黃牛背最長(zhǎng)肌和后腿肌表達(dá)差異顯著，背最長(zhǎng)肌組織中ANGPTL4 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，后腿肌ANGPTL4 mRNA表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，證明ANGPTL4基因可以作為延邊黃牛肌內(nèi)脂肪沉積的候選基因。本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)延邊黃牛ANGPTL4基因表達(dá)的初步研究，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步了解ANGPTL4基因?qū)εＶ拘罘e以及利用該基因改良牛肉質(zhì)性狀提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

ANGPTL4基因的表達(dá)不存在明顯的組織特異性，在本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的7個(gè)組織中均有表達(dá)，其中肝臟表達(dá)量最高，后腿肌表達(dá)量最低，表達(dá)水平從高到低依次為肝、肺、腎、心、脾、背最長(zhǎng)肌、后腿肌。ANGPTL4基因在肌肉組織中的表達(dá)量與IMF含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明ANGPTL4基因影響肌內(nèi)脂肪沉積，為進(jìn)一步研究ANGPTL4基因?qū)ρ舆咟S牛肉質(zhì)的調(diào)控作用提供了一定的參考。

[1] 馬云, 侯飛, 李榮榮, 等. 牛血管生成素樣蛋白4基因(ANGPTL4)編碼區(qū)SNPs檢測(cè)及其與南陽(yáng)牛生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011, 19(5):887-892.

[2] Adachi H, Fujiwara Y T, Nishikawa T, et al. Angptl 4 deficiency improves lipid metabolism, suppresses foam cell formation and protects against atherosclerosis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 379(4):806-811.

[3] Mandard S, Zandbergen F, Van Straten E, et al. The fastinginduced adipose factor/ angiopoietin -like protein 4 is physically associated with lipoproteins and governs plasma lipid levels and adiposity[J]. J Biol Chem, 2006, 281: 934-944.

[4] Gbaguidi F G, Chinetti G, Milosavljevic D, et al. Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) agonists decrease lipoprotein lipase secretion and glycated LDL uptake by human macrophages[J]. FEBS Lett, 2002, 512(1-3):85-90.

[5] Koster A, Chao Y B, Mosior M, et al. Transgenic angiopoietin-like (Angptl) 4 overexpression and targeted disruption of Angptl4 and Angptl3: Regulation oftriglyceride metabolism[J]. Endocrinology, 2005, 146(11): 4943-4950.

[6] Legry V, Bokor S, Cottel D, et al. Associations between common genetic polymorphisms in angiopoietin-like proteins 3 and 4 and lipid metabolism and adiposity in European adolescents and adults[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2009, 94(12):5070-5077.

[7] 馬云. 牛三個(gè)基因的分離、定位及其與牛經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2006.

[8] Mamedova L K, Robbins K, Johnson B J, et al. Tissue expression of angiopoietin-like protein 4 in cattle[J]. J Anim Sci, 2010, 88(1):124-130.

[9] 馬云, 李榮榮, 侯飛, 等. ANGPTL4基因的表達(dá)調(diào)控及功能研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)牛業(yè)科學(xué), 2009, 35(6):36-40.

[10] 徐龍?chǎng)? 劉鏡, 張麟, 等. 關(guān)嶺黃牛ANGPTL4基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,44(9):51-53.

[11] 李文浩. 羔羊肉生產(chǎn)雜交組合篩選及藏綿羊ANGPTL4基因多態(tài)性分析[D]. 蘭州: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016.

[12] Hato T, Tabata M, Oike Y. The role of angiopoietinlike proteins in angiogenesis and metabolism[J]. Trends Cardiovasc Med, 2008, 18(1):6-14.

[13] 馬云, 駱瑩瑩, 李芬, 等. 牛ANGPTL4基因結(jié)構(gòu)和功能的生物信息學(xué)分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,32(1):135-140.

[14] 豐勝求. 豬Angptl家庭基因的克隆、表達(dá)及調(diào)控研究[D].武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[15] Dutton S, Trayhurn P. Regulation of angiopoietin-like protein 4/fasting-induced adipose factor (Angptl4/FIAF)expression in mouse white adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes[J]. Br J Nutr, 2008, 100(1):18.

[16] Feng S Q, Chen X D, Xia T, et al. Cloning, chromosome mapping and expression characteristics of porcine ANGPTL3 and -4[J]. Cytogenet Genome Res, 2006,114(1):44-49.

S823.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-043

2017-04-26；收回日期：2017-07-09

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（201602 04017NY）；吉林省現(xiàn)代肉牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)研究課題（201635）；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目

徐暢（1991-），女，吉林長(zhǎng)春人，碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)，E-mail：591667504@qq.com

*通訊作者：夏廣軍，E-mail：ybuac@ybu.edu.cn