家兔雌激素受體1基因編碼區(qū)序列分析

張翠霞，李叢艷，雷 岷，張翔宇，楊 超，鄺良德，鄭 潔，謝曉紅

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

家兔雌激素受體1基因編碼區(qū)序列分析

張翠霞，李叢艷，雷 岷，張翔宇，楊 超，鄺良德，鄭 潔，謝曉紅*

（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都 610066）

家兔的繁殖性狀屬于低遺傳力性狀，基于傳統(tǒng)育種方法的遺傳改良很難取得顯著進展。家兔雌激素受體1（ESR1）基因是影響繁殖性狀的重要候選基因，本研究利用PCR技術擴增了德國巨型白兔ESR1基因的編碼區(qū)序列。結果表明：基因進化樹與已知進化樹一致，哺乳動物的ESR1基因可能來自于同一個祖先基因；德國巨型白兔ESR1基因與豬的同源性最高（87.1%）；預測的蛋白包括4個主要的功能區(qū)域A/B區(qū)（aa1-187）、C區(qū)（aa188-264)、D區(qū)（aa265-314）和E區(qū)（aa315-598）；分析發(fā)現(xiàn)5個保守的磷酸化位點，可進一步作為與性狀關聯(lián)研究的候選位點。測定的德國巨型白兔ESR1編碼區(qū)序列將為基因功能突變和繁殖性狀的相關性研究提供理論基礎。

家兔；雌激素受體；繁殖性狀

家兔繁殖性狀的改良是遺傳育種領域的研究熱點，也是提高養(yǎng)殖經濟效益的關鍵環(huán)節(jié)。以分子標記技術為核心的分子育種逐漸成為家兔繁殖性狀改良的新途徑，其關鍵步驟是尋找與性狀顯著相關的DNA標記，常用方法包括全基因組掃描法和候選基因法。雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）基因是影響繁殖性狀的重要功能候選基因，其通過與靶基因上特異性效應元件的結合，改變雌激素基因的轉錄，進而對雌性第二特征、繁殖周期、生殖力、妊娠維持產生影響[1]。目前已克隆出人的ESR1基因，其中人ESR1基因位于染色體6q24-q27區(qū)域，含7個內含子和8個外顯子，全長約140 kb，編碼595個氨基酸殘基[2]。基因功能研究表明，該基因包含對靶基因起轉錄激活作用的A/B域、DNA結合所必需的C域、影響DNA穩(wěn)定性的D域、配體結合和受體的二聚化所必需的E域4個功能區(qū)域[3]。人類的ESR1基因與多個生殖器官的發(fā)育和疾病有關，如卵巢和子宮內膜[4]。分析發(fā)現(xiàn)ESR1序列在不同物種間具有很高的保守性，其中人與雞、人與鼠、鼠與雞的同源性分別為88%、80%、77%[5-6]。已有文獻資料表明，ESR1基因中存在多態(tài)性位點，且與畜禽繁殖性狀中產仔數(shù)具有相關[7]。母豬的SNP（Single Nucleotide Polymorphisms）位點與繁殖性狀關聯(lián)分析表明，ESR1基因的SNP位點與斷奶發(fā)情間隔以及初生死胎數(shù)存在顯著關聯(lián)[8]。不同ESR基因型母豬的初生窩重差異顯著[9]。公豬ESR1基因與精液質量相關聯(lián)，同時ESR1的表達量在睪丸和附睪中差異顯著，對精原細胞的分化產生影響[10]。胚胎移植后的魯西牛的配懷率和激素水平與ESR1的多態(tài)位點存在關聯(lián)[11]。已有報道指出，土耳其綿羊的第4外顯子發(fā)現(xiàn)6個SNP位點[12]。齊卡肉兔配套系中的G系德國巨型白兔，為配套系中的父系，具有生長速度快，但繁殖力相對較低，性成熟較晚等特性[13]。但德國巨型兔的ESR1基因編碼區(qū)序列還未見報道，一定程度上限制了其基因結構和突變位點的研究，并且影響了與家兔繁殖性狀相關DNA標記的開發(fā)利用。本研究擴增了德國巨型白兔ESR1基因編碼區(qū)序列，以期能夠為家兔ESR基因的結構和突變研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液樣本采集和全基因組DNA提取 采用人醫(yī)用一次性采血管收集靜脈采血5 mL，肝素鈉抗凝處理；所有樣本-20℃低溫保存?zhèn)溆谩＠肬niversal Genomic DNA Extraction Kit （TaKaRa，Dalian，China）試劑盒抽提基因組DNA。取DNA提取樣本，混合適量的上樣緩沖液，使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，120 V電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測DNA提取效果。

1.2 PCR引物設計 以ENSEMBLE數(shù)據(jù)家兔的參考基因組序列（ENSOCUG00000004829）作為模板進行PCR擴增引物的設計，利用Primer5軟件進行引物設計，保證引物擴增的效率與特異性，共擴增ESR基因的1～9號外顯子，引物信息及目的片段見表1。

1.3 PCR擴增與測序 以檢測合格的單一樣本基因組DNA為模板，分別對每一對設計的引物進行PCR擴增。PCR擴增反應體系：模板DNA0.2 μL，上、下游引物各0.15 μL，PCR擴增2× MasterMix 10 μL，加超純水至終體積25 μL。PCR擴增反應程序：95℃預變性5 min，94℃變性60 s，退火50 s，72℃延伸90 s，根據(jù)擴增效率循環(huán)30～35次，最后72℃延伸10 min，4℃保持。取適量PCR擴增產物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，120 V電泳20 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測結果（圖1）。對PCR擴增成功的樣本直接送上海英駿公司測序，返回測序膠圖，用于序列分析。

圖1 家兔ESR基因不同外顯子的PCR擴增產物檢測

1.4 數(shù)據(jù)分析 利用DNA Star軟件進行序列拼接、同源性比較和基因進化分析。利用在線的基因作圖軟件（http://ibs.biocuckoo.org/）繪制基因結構圖。

2 結 果

2.1 不同物種間的同源性 利用DNA STAR的MegAlign程序對16個物種的ESR1基因編碼區(qū)進行了同源性比對（其中哺乳動物7個，兩棲動物2個，鳥類2個，爬行動物2個，魚類3個），不同物種間ESR1基因編碼區(qū)的相似性為42.5%～94.2%（表2）。哺乳動物間的同源性為78.4%～94.2%，其中兔與豬的同源性最高為87.1%，與人類的同源性為86.8%。鳥類與哺乳動物的同源性為67.3%～71.8%，兩棲類與哺乳動物的同源性為58.5%～66.2%。哺乳類與鳥類的同源性最高。

表1 引物信息

表2 不同物種間ESR1基因編碼區(qū)核酸序列的同源性比較

2.2 基因結構及修飾位點 對家兔ESR基因的CDS區(qū)測序結果表明，該區(qū)域全長1 794 bp，編碼598個氨基酸。通過與人的ESR序列比對表明，家兔ESR包含4個區(qū)域，分別為包含家族特征結構的A/B區(qū)（aa1-187）、C區(qū)（aa188-264）、D區(qū)（aa265-314）和 E區(qū)（aa315-598），見圖 2。預測到8個磷酸化位點，分別為107、109、121、170、171、204、314和 540。 人 和 兔ESR1基 因存在5個保守的磷酸化位點，分別為107、109、121、170和 540。

圖2 家兔與人ESR1的結構圖

2.3 基因進化樹 基因進化分析結果表明，魚類首先分為一支，兩棲類分化為一支，鳥類、蜥蜴類和哺乳類再度分化（圖3）。家兔首先和人及偶蹄動物聚集在一起，家兔與人的遺傳距離最近。鳥類首先和蜥蜴類爬行動物聚在一起，再與兩棲動物聚集最后與哺乳動物匯成一支。

圖3 不同物種的ESR1基因進化樹

3 討 論

家兔ESR1基因編碼區(qū)與人具有很高的同源性，推測其各個區(qū)域和基因功能也具有相似性。人ESR1基因A/B域包含1個非配體依賴型轉錄激活功能區(qū)（Activation Function1，AF1），能與相關轉錄因子相互作用激活靶基因[14]。C域包含有2個鋅指結構并富含高度保守的堿性氨基酸殘基，主要參與DNA的結合。D區(qū)域為絞鏈區(qū)，在無雌激素的條件下，該區(qū)結合1個熱應激蛋白并進行適當?shù)恼郫B以保護疏水的配體結合區(qū)，從而維持受體的非活性狀態(tài)。E區(qū)域含有1個在激素依賴的轉錄過程中有重要作用的 AF-2區(qū)（Activation Function 2，AF2），在轉錄激活中起調節(jié)作用[15]。

人類ESR1基因對生殖系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用，影響排卵、受精和胚胎著床等重要生殖過程[16]。目前研究表明，家兔ESR1基因對其生殖過程有直接影響。Baranda-Avila等[17]利用RT-PCR技術對懷孕早期家兔輸卵管不同時期的壺腹和峽部進行了ERS1基因的表達差異分析，結果表明，懷孕母兔2個組織的ESR1表達量高于未孕的家兔；懷孕母兔壺腹的ESR1表達量在懷孕第3天最高，第4天開始下降；而峽部的表達量前4 d持續(xù)增加，第3天達到最大值，由此可知ESR基因可能對懷孕早期的產道起著特殊的生物學作用。ESR1基因能調控公兔附睪內的催產素受體的表達和活性[18]。雌激素受體通過雌激素敏感的類固醇激素合成途徑調控雌二醇，進而影響母兔黃體中的孕酮水平[19]。另外，Okada等[20]利用實時熒光定量PCR對不同懷孕期大鼠輸卵管內ESR1和ESR2的表達量進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)不同孕期和不同組織細胞的輸卵管中ESR1的表達量差異顯著。因此，可以將ESR1作為影響家兔繁殖性狀的重要功能候選基因。

根據(jù)受體是否與目的基因結合，可將ESR作用機理分為基因組作用和非基因組作用。非基因組作用主要通過激素和受體結合，再利用磷酸化激活轉錄因子，最后作用于目的基因[21]。基因組作用根據(jù)是否有激素參與可分為激素配體途徑和激素非配體途徑。非激素配體的途徑通過相關調控因子如生長因子引起磷酸化的級聯(lián)反應以激活受體，受體同雌激素反應元件（Estrogen Reactive Element，ERE）作用調節(jié)目的基因的轉錄[22]。激素配體途徑可以分為ERE作用途徑和非ERE作用途徑2類。ERE作用屬于經典方式，激素和受體結合后發(fā)生二聚化，再與目的基因的ERE區(qū)域結合，影響其轉錄[23]。非ERE作用途徑則是激素和受體結合后與目的基因的復合物結合（復合物由相關因子和目的基因的啟動區(qū)域結合產生）以調控目的基因[24]。磷酸化在非激素配體和非基因組激活途徑中起作用，是ESR實現(xiàn)目的基因調控的重要方式之一。表皮生長因子和游離ESR1轉錄調控的分子機理就是通過SER118的磷酸化實現(xiàn)的。目前，人的ESR1基因發(fā)現(xiàn)6個影響轉錄的磷酸化位點，其中5個與預測的兔ERE磷酸化位點為同源保守性位點，這些位點可能在家兔ESR調控目的基因轉錄方面起著重要的作用。

化石證據(jù)表明，進化規(guī)律由水生到陸生。脊椎動物的共同祖先從魚類開始進化，然后進化到兩棲類的過渡階段，再進化到完全陸生的爬行類，又進一步進化為鳥類和哺乳類動物。基因的變異是產生表型變異的內在原因，也是動物進化的遺傳基礎，因此基因的演化歷程也是由水生到陸生，魚類的ESR1基因首先分為一支，與動物的進化規(guī)律一致?；驔Q定表型，ESR1基因對繁殖周期、生殖力、骨骼密度等性狀都有重要影響。哺乳動物的關鍵進化是能產生乳汁，都具有乳腺、胎生等特征表型。由于ESR1參與調控乳腺的形成和胚胎的發(fā)育，因此哺乳動物的ESR1基因同源性較高，親緣關系最近，聚為一支[25-26]。羊膜動物具有羊膜結構，鳥類和哺乳動物屬于羊膜動物，兩棲類沒有羊膜，因此哺乳動物ESR基因與鳥類的親緣關系比兩棲類要近，首先聚為一支再與兩棲類聚在一起。ESR1基因編碼區(qū)的保守結構表明，這些基因很可能來自同一個祖先，為進化出適應環(huán)境的表型而發(fā)生改變。

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Analysis of Coding Sequence of Estrogen Receptor Alpha in Rabbit

ZHANG Cui-xia, LI Cong-yan, LEI Min, ZHANG Xiang-yu, YANG Chao, KUANG Liang-de,ZHENG Jie, XIE Xiao-hong*

(Sichuan Animal Sciences Academy, Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Chengdu 610066, China)

The reproduction traits of rabbit are the low heritability traits. The traditional breeding method shows a slow improvement. The ESR1 gene is an important candidate associated with the reproduction traits in rabbit. In this research,the coding sequence of ESR1 of ZIKA meat rabbit was amplified with the PCR technology. The result shows that the gene evolution tree is consistent with the known evolution tree, so the ESR1 gene of a mammal may be from the same ancestral gene. The homology between ZIKA meat rabbits and pigs is the highest (87.1%). It is predicted that protein consists of four functional domains, which are namely A/B region (aa1-187), C region (aa188-264), D region (aa265-314) and E region(aa315-598). Five conservative phosphorylation sites have been found and can serve as candidate sites for further research related to traits. Besides, it is also predicted that the ESR1 coding sequence of ZIKA meat rabbit will provide necessary basic data for the research on correlation between functional mutation and reproduction traits.

Rabbit; Estrogen receptor; Reproductive traits

S829.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-029

2017-02-14；

2017-04-28

四川省畜牧科學研究院基本科研業(yè)務費專項資金（SASA2014A11）；公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項經費（201303143）；中國南方經濟作物副產物飼料化利用技術研究與示范 （201403049）；國家兔產業(yè)技術體系（CARS-44-B-4）；四川省育種攻關項目（2016NYZ0046）；四川省科技支撐計劃（2016NZ0002）

張翠霞（1981-），女，四川自貢人，助理研究員，碩士，主要從事家兔遺傳育種研究，E-mail:dawn713@163.com

*通訊作者：謝曉紅，女，四川廣安人，研究員，本科，主要從事家兔育種及飼養(yǎng)管理研究，E-mail:xkyyts@vip.126.com