兔急性亞硝酸鈉中毒病診斷方法的篩選

楊 妍 ， 房英姿 ， 逄賓賓 ， 曹榮峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

兔急性亞硝酸鈉中毒病診斷方法的篩選

楊 妍 ， 房英姿 ， 逄賓賓 ， 曹榮峰

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

為找出診斷動(dòng)物急性亞硝酸鈉中毒病更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法，試驗(yàn)先用9只兔，篩選建立中毒模型所需靜脈注射亞硝酸鈉的劑量；再取9只兔分別經(jīng)耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重，在注藥前及注藥后10、20 min和30 min取兔眼液、血液和尿液，用5種顯色法檢測(cè)亞硝酸鈉含量，用試劑盒檢測(cè)血中高鐵血紅蛋白的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中毒兔血清和尿液的亞硝酸鈉與聯(lián)苯胺冰醋酸、安替比林、格里斯、1-萘胺和偶氮試劑都發(fā)生了顏色反應(yīng)；中毒兔眼液與偶氮試劑接觸迅速呈玫紅色；中毒兔血液高鐵血紅蛋白占17.68%～38.19%。結(jié)果表明，偶氮眼瞼擦拭法可作為亞硝酸鈉中毒病的定性診斷法；血液和尿液中亞硝酸鈉含量采用格利斯法檢測(cè)更靈敏；用試劑盒法檢測(cè)血液高鐵血紅蛋白升高，也可作為亞硝酸鈉中毒的參考指標(biāo)。

兔 ； 亞硝酸鈉中毒 ； 格利斯法 ； 偶氮試劑法

亞硝酸鹽中毒是各種動(dòng)物因誤食硝酸鹽含量高的飼料或飲水，在體內(nèi)或體外形成亞硝酸鹽進(jìn)入血液，使血紅蛋白氧化為高鐵血紅蛋白而失去攜氧能力，導(dǎo)致組織缺氧而引起的一種常見(jiàn)中毒病。臨床上以突然發(fā)病、呼吸困難、黏膜發(fā)紺、血液褐變和痙攣抽搐為特征。實(shí)驗(yàn)室診斷該病主要用顯色試劑檢測(cè)剩余飼料、嘔吐物或胃內(nèi)容物中，以及血液、尿液和其他體液中亞硝酸鹽的含量，或者測(cè)定血中高鐵血紅蛋白含量等方法。在獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)課上，僅用聯(lián)苯胺冰醋酸顯色法來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，一般不對(duì)安替比林、格利斯、1-萘胺和偶氮試劑顯色效果進(jìn)行比較。但是由于聯(lián)苯胺冰醋酸顯色試驗(yàn)結(jié)果并不明顯，操作也不方便，所以，擬通過(guò)建立家兔急性亞硝酸鈉中毒模型，并增加眼液現(xiàn)場(chǎng)快速診斷法和血中高鐵血紅蛋白含量測(cè)定法，來(lái)篩選出臨床上最佳的診斷方法，為動(dòng)物急性亞硝酸鈉中毒病更簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 比利時(shí)兔18只，體重1.9～2.4 kg，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性飼喂14 d后開(kāi)始試驗(yàn)，期間自由飲水，飼喂固體飼料。

1.2 試劑和設(shè)備 722G可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司)；離心機(jī)(SIGMA公司)；心電監(jiān)護(hù)儀(MIDMARK)；高鐵血紅蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)；1-萘胺(Sigma)、N-1-萘乙二胺(上海展云化工有限公司)；安替比林(克拉瑪爾試劑)，亞硝酸鈉(萊陽(yáng)康德化工有限公司)；鹿眠寶(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送)；10%亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液、聯(lián)苯胺冰醋酸試劑、安替比林試劑、格利斯試劑、1-萘胺試劑和偶氮試劑按照《獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》[3]配制。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和動(dòng)物分組 將9只兔子自由分3組，每組3只。稱(chēng)重后，皮下注射鹿眠寶0.06 mL/kg體重，分別經(jīng)兔耳緣靜脈注射亞硝酸鈉80 mg/kg體重、120 mg/kg體重和160 mg/kg體重。連接心電監(jiān)護(hù)儀監(jiān)控中毒前后體溫、脈搏、呼吸數(shù)和血壓等的變化，觀(guān)察兔的癥狀表現(xiàn)，確定兔急性亞硝酸鈉中毒模型的最佳劑量。

將9只兔稱(chēng)重，耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重。在注藥前及注藥后10、20 min和30 min，分別測(cè)體溫、心率、呼吸數(shù)，記錄臨床癥狀，采血取血清，導(dǎo)尿管取尿液1 mL，棉簽擦拭眼液。

1.4 眼液顯色診斷兔急性亞硝酸鈉中毒試驗(yàn) 在注藥前及注藥后10、20 min和30 min，用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽蘸取眼液部位上分別滴加5種顯色液2滴，隨即觀(guān)察棉簽顏色變化并記錄。

1.5 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗(yàn)

1.5.1 不同濃度的亞硝酸鈉與5種顯色劑體外顯色反應(yīng) 取白瓷板分別滴加0.1、1、10、100 μg/mL 亞硝酸鈉溶液2滴，另取對(duì)應(yīng)孔滴2滴生理鹽水做空白對(duì)照，再分別滴加聯(lián)苯胺冰醋酸、安替比林、格里斯、1-萘胺和偶氮5種顯色劑各2滴。攪拌靜置1 min，觀(guān)察不同濃度亞硝酸鈉溶液與5種試劑反應(yīng)的顏色變化并記錄。

1.5.2 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗(yàn) 分別取注藥前及注藥后10、20 min和30 min兔血清和尿液，白瓷板中分別與5種顯色試劑反應(yīng)，觀(guān)察顏色變化并與標(biāo)準(zhǔn)顏色反應(yīng)比對(duì)。

1.6 急性亞硝酸鈉中毒兔血中高鐵血紅蛋白的含量變化 耳緣靜脈采注藥前及注藥后10、20 min和30 min兔血，肝素抗凝，2 h內(nèi)用高鐵血紅蛋白試劑盒，測(cè)定急性亞硝酸鈉中毒前后兔血液高鐵血紅蛋白含量變化情況。

2 結(jié)果

2.1 兔急性亞硝酸鈉中毒模型的建立 兔耳緣靜脈注射亞硝酸鈉80 mg/kg體重、120 mg/kg體重和160 mg/kg體重，觀(guān)察兔的癥狀表現(xiàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鈉80 mg/kg體重組，3只兔無(wú)異常癥狀表現(xiàn)，生理指標(biāo)也無(wú)變化，未經(jīng)治療一直存活；160 mg/kg體重組，10 min內(nèi)3只兔全部死亡，僅出現(xiàn)瀕死期呼吸困難、結(jié)膜發(fā)紺、抽搐等癥狀，尸體剖檢僅見(jiàn)主動(dòng)脈充盈、動(dòng)脈血發(fā)紺的變化，生理指標(biāo)突然極度紊亂；注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重，3只兔逐漸出現(xiàn)呼吸急促、抽搐、結(jié)膜發(fā)紺和耳廓血管顏色變深等癥狀，通過(guò)心電監(jiān)護(hù)儀能夠發(fā)現(xiàn)脈搏和呼吸數(shù)增高，體溫降低和血壓不穩(wěn)，中毒后1～2 h死2只，另1只耐受。所以，確定兔急性亞硝酸鈉中毒模型接毒方法是耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重。

2.2 急性亞硝酸鈉中毒前后兔臨床癥狀、體溫、心率和呼吸數(shù)的變化 對(duì)9只兔經(jīng)耳緣靜脈注射亞硝酸鈉120 mg/kg體重 10 min后，觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，兔逐漸出現(xiàn)四肢無(wú)力、抽搐，瞳孔散大，耳廓血管顏色變?yōu)榘底仙Y(jié)膜顏色由粉紅色變?yōu)榘l(fā)白、發(fā)紺。呼吸數(shù)在中毒后的10 min增大，中毒后20 min和30 min時(shí)略減少，體溫持續(xù)降低，心率持續(xù)增加，但體溫、心率和呼吸數(shù)與中毒前比較差異均不顯著(P>0.05)(表1)。

表1 兔急性亞硝酸鈉中毒前后體溫、呼吸數(shù)和心率

2.3 眼液顯色診斷兔急性亞硝酸鈉中毒試驗(yàn) 在注藥前用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽分別滴加5種顯色液2滴，隨即觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，兔眼液均未發(fā)生顏色變化。

注藥后10、20 min和30 min，分別用5支棉簽擦拭兔眼結(jié)合膜囊，立即向棉簽滴加5種顯色液2滴，觀(guān)察棉簽顏色變化發(fā)現(xiàn)，聯(lián)苯胺冰醋酸出現(xiàn)淺棕色，安替比林肉眼無(wú)法判斷顏色變化，格里斯出現(xiàn)淺粉色但有的無(wú)顏色變化，1-萘胺肉眼無(wú)法判斷顏色變化，滴加偶氮試劑均出現(xiàn)明顯的玫紅色(見(jiàn)中插彩版圖1)。

2.4 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗(yàn)

2.4.1 不同濃度的亞硝酸鈉與5種顯色劑體外顯色反應(yīng) 0.1、1、10、100 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液與5種顯色試劑的反應(yīng)結(jié)果(見(jiàn)中插彩版圖2)。隨著亞硝酸鈉濃度的增大，聯(lián)苯胺冰醋酸由無(wú)色變?yōu)闇\黃色至棕紅色；安替比林顯色不明顯，最后呈淡綠色；格里斯試劑從無(wú)色變?yōu)榉奂t至紫紅色，顯色明顯；1-萘胺試劑從無(wú)色變?yōu)槊导t色至橙紅色；偶氮試劑從無(wú)色變?yōu)闇\粉至粉紅最后為深洋紅色。

2.4.2 顯色法診斷兔急性亞硝酸鈉中毒的比較試驗(yàn) 在注藥前取兔尿液、血清與5種試劑接觸無(wú)顏色變化，而注藥后10 min、20 min、30 min，尿液、血清與5種試劑除安替比林試劑顏色變化不明顯，其他均顯色明顯，尤其以格里斯試劑呈明顯紫紅色(見(jiàn)中插彩版圖3、圖4)。

2.5 急性亞硝酸鈉中毒兔血液高鐵血紅蛋白的含量變化 將采集的抗凝血在2 h內(nèi)用高鐵血紅蛋白試劑盒測(cè)定急性亞硝酸鈉中毒前后兔血液高鐵血紅蛋白含量。中毒后兔血液呈醬油色，血紅蛋白含量降低，然后升高最后降低；高鐵血紅蛋白百分比顯著升高(見(jiàn)表2)。

表2 急性亞硝酸鈉中毒兔血液高鐵血紅蛋白含量

*：與中毒前相比有極顯著差異(P<0.01)

3 討論

3.1 淚液棉簽定性診斷法的比較 用淚液棉簽偶氮法快速診斷豬亞硝酸鹽中毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，中毒后棉簽顏色隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加深，由淺紅色變?yōu)槊导t色最后為棕紅色[2]，結(jié)合《獸醫(yī)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》中介紹不同染色試劑可以與血清中亞硝酸鈉反應(yīng)[3]，據(jù)此我們?cè)O(shè)計(jì)棉簽蘸取眼液后分別滴加5種試劑結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兔在注射亞硝酸鈉后10～30 min內(nèi)，沾取眼液的棉簽滴加偶氮試劑后均顯現(xiàn)玫紅色，而聯(lián)苯胺冰醋酸和格里斯試劑顏色變化不明顯，安替比林和1-萘胺試劑肉眼無(wú)法判斷顏色變化。其中偶氮試劑作用原理是在酸性條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酰胺進(jìn)行重氮化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與1-萘胺作用，生成深紅色偶氮染料[4]，雖然都是1-萘胺反應(yīng)，但條件不同其顏色也不同。說(shuō)明偶氮法檢測(cè)淚液能夠定性快速診斷亞硝酸鈉中毒。

3.2 中毒兔血清和尿液顯色法的比較 研究報(bào)道，格里斯法定量檢測(cè)亞硝酸鈉最低限量為0.1μg/mL[5]，本試驗(yàn)給兔注射亞硝酸鈉含量為120 mg/kg體重，試驗(yàn)結(jié)果是除安替比林試劑顏色變化不明顯外，其他試劑均呈現(xiàn)明顯的顏色變化，尤其以格里斯試劑呈紫紅色，變化更明顯。根據(jù)體重和血液含量推算其血清中亞硝酸鈉含量約為600 μg/mL，而經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)已知濃度亞硝酸鈉溶液反應(yīng)的顏色對(duì)比，其亞硝酸鈉濃度在100 μg/mL左右，說(shuō)明亞硝酸鈉進(jìn)入體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列吸收或代謝等生物學(xué)反應(yīng)，其定量結(jié)果與體外試驗(yàn)有差別。

本試驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，兔亞硝酸鈉中毒10～30 min，其尿液與試劑均發(fā)生顯色反應(yīng)，其中10 min左右就出現(xiàn)，說(shuō)明靜脈注射亞硝酸鈉能迅速到達(dá)腎臟，經(jīng)腎小球過(guò)濾而出現(xiàn)在尿液中。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，尿液與聯(lián)苯胺冰醋酸試劑反應(yīng)后的顏色與兔尿顏色相似，所以聯(lián)苯胺冰醋酸試劑不適合檢測(cè)尿液中的亞硝酸鹽。

4 結(jié)論

耳緣靜脈注射120 mg/kg體重亞硝酸鈉溶液，成功建立兔急性亞硝酸鈉中毒模型；偶氮試劑眼瞼擦拭法操作簡(jiǎn)單，可以作為定性診斷的方法；血液和尿液中亞硝酸鈉含量采用格利斯法檢測(cè)更靈敏；測(cè)定血液中高鐵血紅蛋白含量，可作為亞硝酸鈉中毒的參考指標(biāo)。

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S829.1

B

0529-6005(2017)08-0078-03

2016-12-26

青島農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用型人才培養(yǎng)特色名校建設(shè)工程項(xiàng)目(XJG2015117, XDSJP2015002)；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生案例庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目(750/1115008)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(SDAIT-09-14)

楊妍(1989-)，女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖免疫與疾病防治方向，E-mail:262493859@qq.com

曹榮峰，E-mail:rfcao@126.com