長鏈非編碼RNAMALAT1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者外周血清中的表達(dá)及臨床意義

陸 強(qiáng)，趙建榮

（上海瑞金醫(yī)院盧灣分院心內(nèi)科，上海200020）

·論 著·

長鏈非編碼RNAMALAT1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者外周血清中的表達(dá)及臨床意義

陸 強(qiáng)，趙建榮

（上海瑞金醫(yī)院盧灣分院心內(nèi)科，上海200020）

目的 探討長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）MALAT1在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┗颊咄庵苎逯械谋磉_(dá)水平及其臨床意義。方法 采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測122例冠心病患者（冠心病組）和48例冠狀動(dòng)脈造影檢查陰性人群（對(duì)照組）血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平；將冠心病組患者分為未接受他汀類藥物治療亞組和接受他汀類藥物治療亞組，分析冠心病患者血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平差異。采用單因素及多因素分析影響冠心病患者臨床預(yù)后的危險(xiǎn)因素。結(jié)果 與對(duì)照組相比，冠心病組血清lncRNA MALAT1的表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；冠心病未接受他汀類藥物治療亞組血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平高于接受他汀類藥物治療亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，單因素分析發(fā)現(xiàn)患者的年齡、吸煙、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）濃度、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）濃度、糖尿病、原發(fā)性高血壓（高血壓）及血清MALAT1的表達(dá)是冠心病的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）；進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)高血壓、低密度脂蛋白膽固醇濃度及血清MALAT1表達(dá)水平是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。結(jié)論 冠心病患者外周血清中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)水平升高；他汀類藥物可降低冠心病患者血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平。lncRNA MALAT1可能是潛在的冠心病預(yù)后預(yù)測的血清標(biāo)志物。

冠狀動(dòng)脈疾?。婚L鏈非編碼RNA MALAT1；臨床意義

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦亲畛Ｒ姷男难芟到y(tǒng)疾病之一，已成為現(xiàn)代社會(huì)影響人類健康的最大殺手之一。其中動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和血管內(nèi)膜的新生是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的重要生物學(xué)過程［1-2］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是一類長度超過200 nt的非編碼RNA，近年來亦被證明是非編碼RNA中可發(fā)揮生物學(xué)功能的重要組分［3-4］。LncRNA主要在表觀修飾、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后這3種層面上調(diào)控基因的表達(dá)。眾多研究結(jié)果提示，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，lncRNAs均有參與并發(fā)揮著重要作用［5-6］，然而，LncRNAs在心血管系統(tǒng)疾病中的作用卻依然不十分清楚。MALAT1（metastasis associated in lung adeno?carcinoma transcript）又稱為非編碼核內(nèi)富含轉(zhuǎn)錄物2（noncoding nuclear-enriched abundant transcript 2，NEAT2），是一種主要在核內(nèi)表達(dá)且高度保守的，長度為7 kb的折疊非編碼RNA。研究表明MALAT1在哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種組織細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因此，近年得到廣泛研究［7］。MALAT1最初發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織樣本中過度表達(dá)，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及代謝。MALAT1調(diào)控代謝相關(guān)基因的表達(dá)，在細(xì)胞G1/S及有絲分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。隨著lncRNA與血管疾病的研究不斷深入，Michalik等［9］發(fā)現(xiàn)MALAT1參與調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物功能。MALAT1的沉默表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞的增殖從而減少新生血管的生成。本研究旨在探討MALAT1在冠心病患者外周血清中的表達(dá)水平及其臨床意義，為冠心病的防治提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2016年6月期間相繼在上海瑞金醫(yī)院盧灣分院心內(nèi)科就診的患者，包括122例冠心病陽性病例和48例冠心病陰性對(duì)照。冠心病組：冠心病定義為冠狀動(dòng)脈造影時(shí)左主干、前降支、回旋支、右冠狀動(dòng)脈或其分支的血管直徑狹窄超過50%；其中男85例，女37例；年齡60（36～89）歲。對(duì)照組：冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果陰性對(duì)照組均行冠狀動(dòng)脈造影明確排除冠心??；其中男24例，女24例，年齡59（33～87）歲。122例冠心病患者中，從未接受他汀類藥物治療的有77例（未接受他汀類藥物治療亞組）；服用阿托伐他汀片（輝瑞）20 mg/d連續(xù)6～12個(gè)月的有45例（接受他汀類藥物治療亞組）。所有患者間無血緣關(guān)系。采集入選對(duì)象外周血液樣本同時(shí)收集其臨床資料，包括性別、年齡、是否患有原發(fā)性高血壓（高血壓）、是否患有高血脂、是否患有糖尿病、是否發(fā)生過心肌梗死。記錄所有研究對(duì)象完整病史信息。所有入選患者確診后即刻用含抗凝劑的紫色采血管采集靜脈血靜置于4℃冷藏30 min后，室溫下3 000 r/min離心15 min，留取上層血清，置于-80℃冰箱備用。所有患者均簽署知情同意書，經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清總RNA提取

將分離所得血清，置于冰上融化；取250 μL血清樣品，加入 750 μLTrizol，振蕩器混勻，靜置5 min；加入 200 μL氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下12 000 r/min離心10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無Rnase的EP管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下12 000 r/min離心10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1 mL75%乙醇；室溫12 000 r/min離心2 min；倒出乙醇，并用Tip槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入10 μL無Rnase的雙蒸水，以能夠充分溶解RNA；用分光光度計(jì)測定總RNA濃度及純度。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)分析lncRNAMALAT 1的表達(dá)水平

提取血清總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進(jìn)行cDNA的合成。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quanti?tative real time polymerase chain reaction，QRTPCR）采用2xSYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為摸板，引物濃度 0.4 μmol/L，15 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測樣本設(shè)置3個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以GAPDH作為內(nèi)參照。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。血液標(biāo)本中LNCRNA MALAT1的表達(dá)用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)分析。單因素及多因素回歸分析冠心病的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

122例冠心病患者和48例陰性對(duì)照者的基線資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較，詳見表1和表2。冠心病組和對(duì)照組年齡、吸煙史、糖尿病史、糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoproteincholesterol，LDL-C）、高敏C反應(yīng)蛋白（high-sensi?tive C-reactive protein，hs-CRP）、收縮壓、脂蛋白（a）［lipoprotein a，Lp（a）］比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而兩組性別、高血壓史、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。冠心病組中男性明顯多于女性，高血壓患病率高，HDL-C濃度低于對(duì)照組。

表1 兩組基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（計(jì)量資料）比較［±s］

表1 兩組基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（計(jì)量資料）比較［±s］

臨床特征n年齡（歲）HbA1c（%）TG（mmol/L）TC（mmol/L）LDL-C（mmol/L）HDL-C（mmol/L）hs-CRP（mg/L）Lp（a）（mg/L）冠心病組122 60.0±10.9 7.03±0.49 1.85±1.20 4.47±0.81 2.39±0.55 1.18±0.33 4.88±0.23 292.1±105.6對(duì)照組48 63.5±10.1 5.27±0.82 1.52±0.50 4.35±0.54 2.24±0.37 1.65±0.24 3.75±0.43 228.7±112.4 P值0.290 0.173 0.152 0.592 0.270 0.019 0.270 0.170

表2 兩組基本臨床資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（計(jì)數(shù)資料）比較［n（%）］

2.2 兩組血清中l(wèi)ncRNA MALAT 1的表達(dá)水平比較

QRT-PCR檢測結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，冠心病組血清MALAT1表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.23，P＜0.001），見圖1。

2.3 兩冠心病亞組血清MALAT 1表達(dá)水平比較

接受他汀類藥物治療亞組血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平比未接受他汀類治療亞組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0 5），見圖2。接受他汀治療亞組lncRNA MALAT1表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 兩組血清MALAT1的表達(dá)水平比較圖

圖2 3組血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平比較圖

2.4 單因素及多因素回歸分析冠心病的危險(xiǎn)因素

單因素非條件Logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙、LDL-C、HDL-C、糖尿病、高血壓及血清MALAT1的表達(dá)是冠心病的危險(xiǎn)因素，詳見表3。進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)高血壓、LDL-C及血清MALAT1表達(dá)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，詳見表4。

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈病理改變中最常見、最嚴(yán)重的一種，常導(dǎo)致心、腦等重要器官受累，嚴(yán)重影響人們的健康［10-11］。血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的始動(dòng)因素。如果能夠早期干預(yù)內(nèi)皮損傷，就能大大減少冠心病的致殘率及病死率，所以對(duì)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷修復(fù)相關(guān)基因的研究日益受到重視［12-13］。

表3 冠心病的危險(xiǎn)因素單因素回歸分析結(jié)果

表4 冠心病的危險(xiǎn)因素多因素回歸分析結(jié)果

眾所周知，人類基因組中的可轉(zhuǎn)錄本超過90%，但是其中只有大約2%為蛋白編碼基因。這意味著非編碼RNA是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組中的重要組成部分，在這些非編碼RNA中，長度為21～23 nt的微小RNA（microRNA，miRNA）已被證明在多種生物及病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用。lncRNA及其亞型基因lncRNA（long intergenic non-coding RNAs，lincRNAs）這一類長度超過200 nt的非編碼RNA，近年來亦被證明是非編碼RNA中可發(fā)揮生物學(xué)功能的重要組分。眾多研究結(jié)果提示，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，lncRNAs均有參與并發(fā)揮著重要作用，然而，lncRNAs在心血管系統(tǒng)疾病中的作用卻依然不十分清楚。近期的一項(xiàng)研究鑒定出了一個(gè)名為Braveheart（Bvht）的lncRNA，該lncRNA與心肌細(xì)胞的維持和命運(yùn)高度相關(guān)［14］。過去的一項(xiàng)報(bào)道又揭示了一個(gè)位于人染色體9p21.3上的lncRNA-ANRIL（CDKN2B-AS），與冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)性高度相關(guān)［15-16］。盡管如此，lncRNA在心血管系統(tǒng)疾病尤其是動(dòng)脈粥樣硬化中的作用和分子機(jī)制仍不十分明確。前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA MALAT1在冠心病患者血清中明顯高于正常對(duì)照組，提示LncRNA MALAT1可能參與調(diào)節(jié)冠心病的發(fā)生、發(fā)展。

MALAT-1基因位于染色體11q13上，轉(zhuǎn)錄物是lncRNA，長度大于8 000 nt，廣泛存在于人類和小鼠正常組織的細(xì)胞核內(nèi)。MALAT-1表達(dá)序列在進(jìn)化上的高度保守性提示其可能具有某些潛在的重要功能。MALAT-1在多種腫瘤中表達(dá)，與患者的預(yù)后相關(guān)［17］。然而，關(guān)于MALAT-1在冠心病患者中的具體作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。

本研究采用QRT-PCR檢測122例冠心病患者和48例冠狀動(dòng)脈陰性對(duì)照組血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平；分析冠心病血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平與冠狀動(dòng)脈狹窄程度的關(guān)系；分析冠心病未接受他汀類藥物治療亞組和接受他汀類藥物治療亞組患者血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平差異。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，冠心病患者血清lncRNA MALAT1的表達(dá)水平明顯升高；未接受他汀類藥物治療亞組血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平高于接受他汀類藥物治療亞組；單因素分析發(fā)現(xiàn)患者的年齡、吸煙、LDL-C、HDL-C、糖尿病、高血壓及血清lncRNA MALAT1的表達(dá)是冠心病的危險(xiǎn)因素；進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)高血壓、LDL-C及血清lncRNA MALAT1表達(dá)是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

以上研究結(jié)果提示冠心病患者外周血清中l(wèi)ncRNA MALAT1表達(dá)水平升高；他汀類藥物可降低冠心病患者血清lncRNA MALAT1表達(dá)水平。lncRNA MALAT1可能是潛在的診斷和預(yù)測冠心病預(yù)后的血清標(biāo)志物。

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Expression and significance of serum long non-coding RNAs MALAT1 in patients with coronary athero?sclerotic heart disease

LU Qiang，ZHAO Jian-rong
（Department of Cardiology，Shanghai Ruijin Hospital Luwan Branch Hospital，Shanghai 200020，China）

ObjectivesTo investigate the expression and clinical significance of long non-coding RNAs（lncRNAs）MALAT1 in patients with coronary atherosclerotic heart disease（CAD）.MethodsSerum lncRNA MALAT1 expres?sion levels were measured in 122 patients with CAD（CAD group）and 48 cases with negative coronary angiography re?sults（control group）by quantitative real time polymerase chain reaction（QRT-PCR）.Patients in CAD group were further divided into receiving statin therapy subgroup and not receiving statin therapy subgroup.Serum lncRNA MALAT1 expression levels were compared between the two subgroups.Risk factors for clinical outcomes of patients with CAD were analyzed by univariate factor and multiple factor analysis.ResultsCompared with control group，serum ln?cRNA MALAT1 expression levels were significantly increased in CAD group（P＜0.05）.Serum lncRNA MALAT1 ex?pression levels in not receiving statin therapy subgroup was significantly higher than that in receiving statin therapy sub?group（P＜0.05）.In addition，univariate analysis found that the patient's age，smoking，low density lipoprotein choles?terol（LDL-C）concentration，high density lipoprotein cholesterol（HDL-C）concentration，diabetes，hypertension and serum lncRNA MALAT1expression level were risk factors for CAD（P＜0.0 5）；further multivariate analysis found that hypertension，LDL-C concentration and serum lncRNA MALAT1 expression level were independent risk factors for CAD（P ＜0.05）.ConclusionsSerum lncRNA MALAT1 expression level in patients with CAD significantly de?crease，which may be as a potential marker for diagnosis and prognosis of CAD.

coronary atherosclerotic heart disease；long non coding RNA MALAT1；clinical significance

R541.4

A

1007-9688（2017）05-0506-05

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.05.02

陸強(qiáng)（1980-），男，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)楣谛牟〉脑\治。

2016-12-12）