11周齡硝酸甘油大鼠模型表面效度研究

周會(huì)霞+章正祥+陳強(qiáng)+孔敏露+鄧玉+程靜+侯群+邵敏峰

[摘要] 目的 本研究旨在11周齡硝酸甘油偏頭痛模型大鼠頭痛行為學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合臨床偏頭痛的頭痛癥狀學(xué)對(duì)偏頭痛大鼠模型的表面效度進(jìn)行研究。 方法 根據(jù)體重及基礎(chǔ)痛閾將36只大鼠隨機(jī)分成四組，即正常組、模型組、西藥組（苯甲酸利扎曲普坦）、中藥組（川芎-天麻），每組9只。造模后，用高清攝像頭記錄大鼠行為學(xué)2 h。通過(guò)空白對(duì)照和藥物反證治療進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。 結(jié)果 造模后2 h內(nèi)，模型組爬籠及理毛次數(shù)少于正常組，撓頭次數(shù)多于正常組。西藥組及中藥組撓頭次數(shù)少于模型組。 結(jié)論 撓頭次數(shù)可以作為評(píng)價(jià)偏頭痛大鼠模型表面效度的核心內(nèi)容及判斷藥物療效的指標(biāo)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，11周齡偏頭痛大鼠行為可能與人類偏頭痛癥狀更相近。

[關(guān)鍵詞] 偏頭痛；硝酸甘油；表面效度；周齡

[中圖分類號(hào)] R747.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）25-0033-04

Study on the surface validity of 11-week-old nitroglycerin rat model

ZHOU Huixia1，2 ZHANG Zhengxiang3 CHEN Qiang3 KONG Minlu4 DENG Yu1 CHENG Jing1 HOU Qun3 SHAO Minfeng1

1.No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University， No.1 School of Clinical Medicine， Zhejiang Chinese Medical University， Zhejiang Provincial Hospital of TCM， Hangzhou 310006， China； 3.Zhejiang Xiaoshan Hospital， Hangzhou 311202， China； 4.Hangzhou Geriatric Disease Hospital， Hangzhou 310022， China

[Abstract] Objective To study the surface validity of migraine rats on the basis of the headache behavioral science of 11-week-old nitroglycerin migraine rate model combined with the symptomatology of clinical migraine. Methods 36 rats were randomly divided into 4 groups according to body weight and basic pain threshold， namely normal group， model group， Western medicine group（Rizatriptan）， and traditional Chinese medicine group（ligusticum wallichii-gastrodia elata）， with 9 rats in each group. After modeling， the behavior of rats was recorded by high-definition camera for 2 hours. A systematic review was conducted by blank control and drug counterevidence therapy. Results Within 2 hours after modeling， the frequency of climbing cage and grooming in the model group was less than that in the normal group， and the frequency of scratching head was more than that in the normal group. The frequency of scratching head in the Western medicine group and Chinese medicine group was less than that in the model group. Conclusion Scratching head can be used as the core content of evaluating surface validity of migraine rats and the index of judging drug efficacy. At the same time， the behavior of 11-week-old migraine rats are found to be more likely to be associated with human migraine symptoms.

[Key words] Migraine； Nitroglycerin； Surface validity； Week age

偏頭痛是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)血管性疾病，我國(guó)患病率為9.3%[1]，好發(fā)于中青年，40歲[2]達(dá)最高峰，40歲后發(fā)病率開(kāi)始下降。2013年全球疾病負(fù)擔(dān)調(diào)查的研究結(jié)果表明偏頭痛為人類第三位常見(jiàn)疾病，按失能所致生命年損失（years of life lost to disability，YLDs）計(jì)算，偏頭痛為第六位致殘性疾病[3]。硝酸甘油模型具有操作簡(jiǎn)單、機(jī)制單一、短時(shí)間內(nèi)可大量復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)，且其行為學(xué)表現(xiàn)及病理生理變化與人類發(fā)病時(shí)的表現(xiàn)及變化相似，因此被廣泛應(yīng)用于偏頭痛相關(guān)課題的研究。本研究選用11周齡[4，5]大鼠通過(guò)視頻錄像方法對(duì)硝酸甘油大鼠模型行為學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。endprint

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠36只，體重（300.81±10.84）g（浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK（浙）20140001），浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分籠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)時(shí)間：2015年2～5月。

1.2 藥品及試劑

苯甲酸利扎曲普坦（批號(hào)140404），湖北歐立制藥有限公司生產(chǎn)；川芎（1403158），天麻（1404046）江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；硝酸甘油注射液（批號(hào)20131223），北京益民藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；0.9%NaCl溶液（F1412033），杭州民生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。西藥組及中藥組均用超純水定容稀釋。

1.3主要儀器設(shè)備

Nanopure UV/UF綜合分析型超純水系統(tǒng)（D11931），美國(guó)BARNSTEAD公司生產(chǎn)；電子天平（CP213），奧豪斯儀器（上海）有限公司生產(chǎn)；松下高清攝像機(jī)（HC-V210M），松下電器（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯鼠光熱測(cè)痛儀（JD-A）：上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠生產(chǎn)。

1.4 造模

36只健康SD雄性大鼠經(jīng)過(guò)7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)，先予兩次甩尾試驗(yàn)，取均值，即基礎(chǔ)痛閾。動(dòng)物按體重及基礎(chǔ)痛閾隨機(jī)分成四組：正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組9只，組間均衡。正常組及模型組均予超純水灌胃（給藥體積：1 mL/100 g）；西藥組予苯甲酸利扎曲普坦溶液灌胃（給藥劑量：0.816 mg/kg，給藥體積：1 mL/100 g）；中藥組予川芎-天麻溶液灌胃（給藥劑量：2449 mg/kg，給藥體積：1 mL/100 g）。各組動(dòng)物共灌胃7 d，每天1次。

以上四組中除正常組外，其余各組在完成第7天灌胃后0.5 h，進(jìn)行硝酸甘油造模，即腹腔注射硝酸甘油（給藥劑量：10 mg/kg，給藥體積：0.2 mL/100 g），正常組予腹腔注射0.9%生理鹽水（給藥體積：0.2 mL/100 g）進(jìn)行對(duì)照。第7天造模前測(cè)得所有SD大鼠體重為（360.36±13.35）g（相當(dāng)于11周齡[4，5]）。

1.5 行為學(xué)觀察

注射完成后立即進(jìn)行大鼠行為學(xué)觀察，并用高清攝像機(jī)進(jìn)行記錄，共計(jì)2 h，統(tǒng)計(jì)造模后2 h內(nèi)各行為出現(xiàn)的次數(shù)。主要觀察以下3個(gè)行為學(xué)癥狀。①爬籠：雙前爪離地搭于桶壁上或騰空站立為爬籠。②理毛：大鼠用嘴舔舐爪子及身上的毛，或用前后爪搔抓頭面部以外區(qū)域的毛。③撓頭：大鼠使用前爪或后爪迅速搔抓頭面部，連續(xù)撓計(jì)為一次，若中間有停頓或者夾有其他動(dòng)作，則計(jì)為兩次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)表示。采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，正態(tài)計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，非正態(tài)計(jì)量資料以中位數(shù)（四分位間距）表示。方差齊性者比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK法；方差不齊者比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)的Kruskal-Wallis法，其中兩兩比較采用所有成對(duì)比較（all pairwise multiple comparisons）法。各組資料均以α=0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠體重變化

干預(yù)前，各組大鼠基礎(chǔ)體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第1天，正常組大鼠體重較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.007，P<0.01），西藥組大鼠體重較模型組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.027，P<0.05），第2天到第6天模型組與其余各組大鼠體重相較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。提示中、西藥對(duì)體重?zé)o明顯影響。見(jiàn)表1。

2.2 行為學(xué)結(jié)果

造模后2 h內(nèi)，正常組大鼠始終活動(dòng)自如，模型組、西藥組、中藥組大鼠在造模后5 min左右開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)減少及倦怠表現(xiàn)。其中模型組的爬籠及理毛次數(shù)[0（2.5），1（3.5）]明顯少于正常組[43（24），13（5.5）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P爬籠=0.000，P理毛=0.000，P<0.01），而模型組撓頭次數(shù)[1（3）]則多于正常組[0（0）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002，P<0.01），表明造模成功。西藥組及中藥組撓頭次數(shù)[0（0.5），0（0.5）]少于模型組[1（3）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P西藥組=0.042，P中藥組=0.031，P<0.05），表明西藥與中藥均有一定治療效果，見(jiàn)表2。

3 討論

偏頭痛模型廣泛應(yīng)用于偏頭痛發(fā)病機(jī)制及臨床新藥的研究，觀察指標(biāo)多種多樣。目前最常用的是熱及機(jī)械痛閾值測(cè)定，用von Frey纖維絲測(cè)定足底或者面部、眶周疼痛敏感性，熱板實(shí)驗(yàn)、甩尾實(shí)驗(yàn)、Hargreaves測(cè)定法[6]等測(cè)定熱敏感性。但由于痛覺(jué)超敏延遲發(fā)生[6]，Tassorelli C等[7]研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油在給藥后2～4 h誘導(dǎo)痛覺(jué)過(guò)敏，所以測(cè)量時(shí)效性及準(zhǔn)確性難以把握。而且雖然有近2/3偏頭痛患者有異常性疼痛[8]，但異常性疼痛不是偏頭痛的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Jones MG[9]等通過(guò)肌電圖定量測(cè)定響應(yīng)于角膜空氣氣泡引起的眼輪匝肌眨眼反射的強(qiáng)度，間接記錄硝酸甘油引起的三叉神經(jīng)通路的激活。另外還有大鼠面部痛苦表情量表（RGS）測(cè)定面部動(dòng)作[10]、光暗盒或者高架十字迷宮等測(cè)定畏光行為。但這些特征表現(xiàn)只存在于偏頭痛部分亞型。

偏頭痛的主要診斷依據(jù)是疼痛，而疼痛是一種生物感覺(jué)，是發(fā)生在清醒狀態(tài)下的、有行為反應(yīng)的感覺(jué)，所以研究偏頭痛模型與疼痛相關(guān)的表面效度更具說(shuō)服力。表面效度是指動(dòng)物模型中動(dòng)物與人類之間現(xiàn)象學(xué)的相似性，即癥狀同源性。對(duì)于偏頭痛模型來(lái)講，表面效度就是指能夠多大程度上反映人類偏頭痛的客觀行為指標(biāo)。目前判斷偏頭痛模型的行為學(xué)標(biāo)準(zhǔn)仍未統(tǒng)一，因此建立較好的表面效度至關(guān)重要，但同時(shí)又存在一定的困難，原因有：個(gè)別指標(biāo)與臨床表現(xiàn)不符；判斷的個(gè)人主觀性較強(qiáng)；指標(biāo)過(guò)于單一等。endprint

硝酸甘油作為NO的前體，通過(guò)激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶擴(kuò)張血管誘發(fā)頭痛的發(fā)生，參與疼痛的激發(fā)與維持[11]。硝酸甘油模型具有操作簡(jiǎn)單、機(jī)制單一、經(jīng)濟(jì)、短時(shí)間內(nèi)可大量復(fù)制等優(yōu)點(diǎn)，且其清醒時(shí)的行為學(xué)表現(xiàn)與患者臨床癥狀一致性較高，可較直觀反映疼痛的發(fā)生，故本研究選用了該造模法。

硝酸甘油偏頭痛大鼠的行為學(xué)目前主要有耳紅、爬籠、理毛、撓頭等，目前多數(shù)研究[12-15]發(fā)現(xiàn)大鼠在造模后即出現(xiàn)煩躁不安，表現(xiàn)為耳紅、爬籠、撓頭次數(shù)增多、過(guò)度理毛等，他們認(rèn)為這些行為學(xué)表現(xiàn)與臨床患者煩躁不安、易激惹表現(xiàn)相似，可解釋為由焦慮情緒引起的自主活動(dòng)增多。但李濤等[16]發(fā)現(xiàn)腹部皮下注射硝酸甘油的大鼠一開(kāi)始表現(xiàn)自如，3～5 min后出現(xiàn)精神不振、反應(yīng)遲鈍。姜維等[17]、王克柱[18]研究發(fā)現(xiàn)偏頭痛造模后起初半小時(shí)，模型組較對(duì)照組撓頭明顯增多，爬籠無(wú)差異，隨后以活動(dòng)減少、倦怠為主。這與本實(shí)驗(yàn)一致。Tassorelli C[19]也認(rèn)為偏頭痛大鼠在發(fā)病期間表現(xiàn)為活動(dòng)減少，不進(jìn)食飲水。這些表現(xiàn)則與臨床患者懶散、疲乏無(wú)力、昏昏欲睡等癥狀相符。以上兩種研究結(jié)果不一致，于是我們認(rèn)為評(píng)價(jià)該模型的行為學(xué)指標(biāo)仍未統(tǒng)一，有待進(jìn)一步探討。

Andrews N等[20]研究發(fā)現(xiàn)損傷周圍神經(jīng)，表現(xiàn)為先天挖洞行為的明顯減少。另外有發(fā)現(xiàn)疼痛可以引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食減少[21]。已知中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）調(diào)節(jié)疼痛的關(guān)鍵部位，Depaulis A等[22]通過(guò)藥物刺激PAG發(fā)現(xiàn)，作為對(duì)“深層次”或“不可避免的”疼痛，慢性損傷或失敗的反應(yīng)，動(dòng)物通常會(huì)減少運(yùn)動(dòng)，變得更加孤獨(dú)，對(duì)環(huán)境的反應(yīng)減弱。與本研究模型組爬籠、理毛明顯減少相一致。也與人類偏頭痛患者表現(xiàn)的倦怠乏力相一致，且與偏頭痛診斷標(biāo)準(zhǔn)“活動(dòng)后加重”相呼應(yīng)。偏頭痛的特征是嚴(yán)重的疼痛和對(duì)感覺(jué)刺激的敏感性增加，導(dǎo)致正常日?；顒?dòng)的抑制。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，有大于50%[23]的患者需要臥床休息來(lái)治療偏頭痛發(fā)作。由此可知，抑制性行為是偏頭痛的重要特征之一，同時(shí)也是動(dòng)物對(duì)疼痛的普遍反應(yīng)，并非偏頭痛所特有。

本研究發(fā)現(xiàn)硝酸甘油偏頭痛大鼠模型除理毛、爬籠等日?；顒?dòng)受抑制外，有特征性的撓頭行為的增加，且中藥組或西藥組干預(yù)后均明顯減少。這與Melo-Carrillo A和Lopez-Avila A[24]的發(fā)現(xiàn)部分相一致，他們通過(guò)刺激大鼠硬腦膜，發(fā)現(xiàn)偏頭痛大鼠休息、凍結(jié)行為、同側(cè)后爪撓頭較對(duì)照組明顯增多。但不管行為活躍或抑制，上述研究偏頭痛模型均有明顯增加的行為特征，即撓頭。該行為是對(duì)主觀疼痛感直接且客觀的反應(yīng)，與臨床患者的頭痛癥狀相符，故我們有理由認(rèn)為撓頭可作為判斷模型成功的核心指標(biāo)。

偏頭痛好發(fā)于中青年，40歲[2]達(dá)最高峰，40歲后發(fā)病率開(kāi)始下降。從分子生物學(xué)角度闡釋，F(xiàn)an PC等[25]研究發(fā)現(xiàn)青春期大鼠和成年期大鼠有相當(dāng)?shù)娜嫔窠?jīng)根頸部復(fù)合體（TCC），但三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)（TGVS）的外周反應(yīng)性比成人差，有年齡依賴性差異。故實(shí)驗(yàn)大鼠年齡的選取與偏頭痛結(jié)局明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)第7天造模前測(cè)得所有SD大鼠體重為（360.36±13.35）g（相當(dāng)于大鼠11周齡[4，5]），目前大部分偏頭痛動(dòng)物模型的研究選取的大鼠體重在200～300 g（相當(dāng)于7～8周齡大鼠[4，5]）。因此部分研究表現(xiàn)為行動(dòng)活躍，可能與青少年大鼠發(fā)病率低，三叉血管系統(tǒng)外周反應(yīng)差，尚構(gòu)不成典型的偏頭痛模型有關(guān)。不過(guò)目前這些只是猜測(cè)，尚需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步論證。為了能盡量客觀地評(píng)價(jià)模型大鼠的行為學(xué)，本研究采用高清攝像機(jī)進(jìn)行全程錄制，以便后期可以重復(fù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，增加行為學(xué)評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。另外，在指標(biāo)的選擇上，我們考慮到行為學(xué)指標(biāo)的易觀察性、可量化性等因素，最終將爬籠、理毛、撓頭作為觀察指標(biāo)。結(jié)果顯示，模型組撓頭次數(shù)明顯多于正常組，與既往的研究結(jié)果均相符合，同時(shí)又是對(duì)疼痛的直接反映，因此，我們認(rèn)為撓頭可作為評(píng)價(jià)偏頭痛模型行為學(xué)的核心指標(biāo)之一。

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