鐵皮石斛主要組分對慢性萎縮性胃炎模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用及PCNA、Bcl-2蛋白的影響*

馬津真 吳人照 龍華晴 聶曉靜 陳 宇 戴關(guān)海 陳 璇 童曄玲 任澤明 楊芳亮

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007 3 浙江天皇藥業(yè)有限公司 浙江 杭州 310012

實驗研究

鐵皮石斛主要組分對慢性萎縮性胃炎模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用及PCNA、Bcl-2蛋白的影響*

馬津真1吳人照2#龍華晴1聶曉靜1陳 宇2戴關(guān)海2陳 璇2童曄玲2任澤明2楊芳亮3

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007 3 浙江天皇藥業(yè)有限公司 浙江 杭州 310012

目的：探討鐵皮石斛及其兩類主要組分鐵皮石斛粗多糖、鐵皮石斛非多糖對亞硝基胍（N-methyl-N'-nit ro-N-nit rosoguanidine，MNNG）誘發(fā)慢性萎縮性胃炎（Chronic Atrophic Gast ritis，CAG）模型大鼠的萎縮逆轉(zhuǎn)作用及對PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的影響。方法：Wistar大鼠自由飲用167μg/ml蒸餾水濃度的飲用液，實驗造模12周。確定成模后，將大鼠分為模型組、鐵皮石斛提取物組、鐵皮石斛粗多糖組、鐵皮石斛非多糖組，正常組。并分別給予藥物治療8周后，觀察大鼠體重、胃組織病理組織學(xué)、胃組織PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：①體重：治療第8周鐵皮石斛組體重顯著高于模型組，體重丟失有顯著恢復(fù)（P＜0.05）；鐵皮石斛粗多糖組、鐵皮石斛非多糖組體重也顯著高于模型組，體重丟失有顯著恢復(fù)（P＜0.01）。②病理：鐵皮石斛組腺體萎縮、主細(xì)胞、腸化較模型組顯著減輕（P＜0.05，P＜0.01）；鐵皮石斛粗多糖組腺體萎縮、主細(xì)胞、不典型增生、腸化顯著減輕（P＜0.05，P＜0.01）；鐵皮石斛非多糖組炎癥（等級）、腺體萎縮、不典型增生、腸化顯著減輕（P＜0.05，P＜0.01）。模型組雄1發(fā)生腫瘤，治療各組未發(fā)生腫瘤。③PCNA蛋白、Bcl-2蛋白：鐵皮石斛組、鐵皮石斛粗多糖組、鐵皮石斛非多糖組的PCNA蛋白較模型組均有顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白較模型組有降低趨勢。結(jié)論：鐵皮石斛組、鐵皮石斛粗多糖組、鐵皮石斛非多糖組均對CAG模型大鼠具有良好的治療作用，減輕體重丟失，減輕胃粘膜萎縮和腸化，其作用機(jī)理之一可能是通過下調(diào)胃黏膜PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的高表達(dá)起到治療作用。

鐵皮石斛 石斛粗多糖 石斛非多糖 慢性萎縮性胃炎 PCNA蛋白 Bcl-2蛋白

CAG是胃黏膜上皮和固有腺體萎縮導(dǎo)致黏膜變薄甚至消失，黏膜肌層增厚的病理改變，并常伴有腸上皮化生、炎癥反應(yīng)及不典型性增生[1]，為消化系統(tǒng)常見病,且為胃癌前病變。胃癌很少從正常的胃黏膜上皮直接發(fā)生，通常需經(jīng)歷多年持續(xù)的癌前病變過程，從正常胃黏膜→慢性淺表性胃炎→CAG→腸化生→不典型增生→胃癌的發(fā)展模式。因此，對CAG進(jìn)行干預(yù)，有效逆轉(zhuǎn)胃癌前病變對降低胃癌發(fā)病率和病死率具有重要意義。近年來，我國胃癌發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢。西醫(yī)治療CAG尚無特效療法，中醫(yī)藥治療有一定優(yōu)勢[2]。本課題主要研究中藥材鐵皮石斛及其兩類主要組分鐵皮石斛粗多糖、鐵皮石斛非多糖的藥理作用，初步探討其對PCNA蛋白、Bcl-2蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：正常Wistar大鼠80只，雌雄各半，體重160～190g，動物合格證編號：0228546。均購買于上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SCXK(滬)2013-0016。實驗動物均飼養(yǎng)于25±2℃的屏障實驗室內(nèi)，每12小時光照明暗交替，實驗動物使用許可證號：SYXK(浙)20090122。

1.2 實驗藥物：鐵皮石斛提取物組：生藥量為0.25g/ml，批號：T01-150914。鐵皮石斛粗多糖提取物組：生藥量為0.25g生藥/ml，批號：T01-150914-01。鐵皮石斛非多糖提取物組：生藥量為2.0g生藥/ml，批號：T01-150914-02；以上藥品均由浙江天皇藥業(yè)有限公司提供。

1.3 實驗儀器：RM2235 LEICA病理切片機(jī)、EG1150C LEICA生物組織冷凍機(jī)、EG1150H LEICA生物組織包埋機(jī)、ASP200 LEICA生物組織自動脫水機(jī)：德國萊卡公司；BX41OLYMPUS顯微鏡：日本OLYMPUS（オリンパス）株式會社；Nikon ECLIPSE Ti顯微攝像系統(tǒng)：日本Nikon株式會社。全波長酶標(biāo)儀：美國BioTek公司。

1.4 實驗試劑：MNNG：5g/瓶，上海藍(lán)季生物公司購買，由日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，批號：75F71-TF；甲醛溶液：500ml/瓶，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：20130610；BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：0226160511；PCNA蛋白、Bcl-2蛋白ELISA試劑盒：上海美旋生物技術(shù)公司，批號：201605。

1.5 MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠造模方法：6周齡的Wistar大鼠80只，雌雄各半，60只開始造模型：每周配167μg/ml濃度的MNNG飲用液，將其裝入外用黑色塑料袋包裹著的水瓶，大鼠自由飲用。本次實驗造模12周。

1.6 大鼠分組治療：造模完成時，隨機(jī)選取4只模型動物與4只正常動物胃組織做病理組織學(xué)檢查，確定成模后，按照實驗的分組要求（每組12只，雌雄各半）分組并開始給藥。模型組給生理鹽水，鐵皮石斛提取物組給鐵皮石斛提取物生藥量0.67g/kg/d灌胃，鐵皮石斛粗多糖組給鐵皮石斛粗多糖提取物生藥量0.67g/kg/d灌胃，鐵皮石斛非多糖組給鐵皮石斛非多糖提取物生藥量0.67g/kg/d灌胃，此外，取12只相同條件的大鼠作為空白（未造模）對照組。在給藥第8周完成時，5組大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，用福爾馬林固定，石蠟包埋，做4μm切片，用HE、AB染色，進(jìn)行組織學(xué)檢查。

1.7 病理組織學(xué)檢查方法：標(biāo)本：大鼠均麻醉，迅速將胃摘出，標(biāo)本為全胃，上段留0.5cm食管，下段留1.5cm十二指腸；沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗，浸于10%中性福爾馬林中[3]。

取材范圍：從前胃一直到十二指腸縱向全長、全層。包埋切片：石蠟包埋，作4μm切片。染色：HE染色、AB染色，按照相關(guān)要求操作。光鏡觀察：①胃黏膜炎癥情況：采用半定量法。在胃組織的胃竇部取10個視野，具體參照在1994年美國休斯頓所提出的胃炎診斷標(biāo)準(zhǔn)。②胃黏膜腺體厚度：每張胃組織切片中，選取胃竇部黏膜5個視野，測出在每個視野下胃竇黏膜腺體厚度，得出每張切片5個視野平均值(μm)。③胃腺體數(shù)目：選取100倍鏡下，找到每只大鼠胃組織的幽門環(huán) 0.2～1.2mm（200～1200μm）之間（即1mm范圍）胃竇固有的腺體總個數(shù)，單位通常以“個/mm”來表示。④不典型增生：在每張切片中，取5個高倍鏡視野，觀察胃黏膜上皮細(xì)胞，明確有無細(xì)胞核多形性和腺體不典型增生的變化（采用輕、中、重級別報告）。⑤主細(xì)胞、壁細(xì)胞數(shù)目：選400倍鏡下，取5個視野平均值，觀察范圍是每張切片的前胃和胃體部交界以下1.0mm開始的胃體部黏膜處。⑥腸上皮化生表現(xiàn)：參照《中藥新藥治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究指導(dǎo)原則》及2006中國上海慢性胃炎共識意見。

1.8 胃組織PCNA、Bcl-2蛋白檢測方法：將大鼠胃組織蛋白樣品，按照PCNA、Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒說明書要求操作。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）來進(jìn)行表示，多組均數(shù)比較采用F檢驗，其中兩組比較計量資料采用LSD-t和Dunnet t T3檢驗方法檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05（或P＜0.01）為差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 體重：治療前MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重167.77±38.23g，較正常大鼠體重259.42±51.93g顯著下降（P＜0.01）。造模完成后，在治療前各治療組間體重情況是無顯著性差異（P＞0.05），說明在各治療組之間，其體重丟失的恢復(fù)療效具有可比性。各治療組MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠，治療后體重較模型組的體重丟失有一定程度恢復(fù)。治療第8周鐵皮石斛提取物組大鼠體重203.83±27.55g，鐵皮石斛粗多糖組大鼠體重218.08±22.13g，鐵皮石斛粗非多糖組大鼠體重216.08±23.50g，三組均顯著高于模型組體重171.08±32.23g，體重丟失有顯著恢復(fù)（P＜0.01，P＜0.05）。數(shù)據(jù)見表1、圖1。

治療8周大鼠體重觀察結(jié)果說明，鐵皮石斛及其兩類主要組分提取物對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠均具有顯著減輕體重丟失的療效。

2.2 病理：鐵皮石斛提取物組腺體數(shù)量42.83±7.51（個/mm）、腺體 厚度 290.40±42.61um、主 細(xì) 胞321.88±68.37（個/視野）、腸化（“++”“+++”只數(shù)）4/12（33.33%），與模型組腺體數(shù)量33.67±4.58（個/mm）、腺體厚度212.02±41.83um、主細(xì)胞205.75±118.12（個/視野）、腸化（“++”“+++”只數(shù)）10/12（83.33%）比較，有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。模型組還有1只動物（雄1號）發(fā)生腫瘤，為十二指腸漿膜面胃腺癌，其他各治療組未發(fā)生腫瘤。數(shù)據(jù)見表2、表3。

鐵皮石斛提取物的主要組分提取物組--鐵皮石斛粗多糖提取物組腺體數(shù)量43.17±7.41（個/mm）、腺體厚度276.12±42.48um、主細(xì)胞290.91±92.36（個/視野）、輕度不典型增生 1/12（8.33%）、腸化（“++”“+++”只數(shù)）9/12（75%）；鐵皮石斛提取物的主要組分提取物組--鐵皮石斛非多糖提取物組炎癥（等級）0.46±0.23、腺體數(shù)量 40.83±7.41（個/mm）、輕度不典型增生2/12（16.67%）、腸化（“++”“+++”只數(shù)）6/12（50%）。這兩組鐵皮石斛的主要組分提取物分別與模型組比較，上述指標(biāo)也有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。

結(jié)合表1的體重丟失恢復(fù)療效，以及模型組還有1只動物發(fā)生腫瘤，進(jìn)行綜合分析，鐵皮石斛提取物組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠體重丟失恢復(fù)、萎縮逆轉(zhuǎn)、腸化改善各方面有較好療效，對炎癥、不典型增生改善有一定作用。鐵皮石斛的兩類主要組分——鐵皮石斛粗多糖提取物、鐵皮石斛非多糖提取物各自單獨應(yīng)用組數(shù)據(jù)說明均對治療效果有一定貢獻(xiàn)。

表1 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周大鼠體重（±s,g/只）

表1 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周大鼠體重（±s,g/只）

注：與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01。

分組鐵皮石斛組鐵皮石斛粗多糖組鐵皮石斛非多糖組正常組模型組例數(shù)12 12 12 12 12治療前NRS評分170.08±27.87 165.50±30.85 170.50±32.96 259.42±51.93★167.77±38.23治療第8周203.83±27.55☆218.08±22.13★216.08±23.50★292.83±61.88★171.08±32.23

圖1 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周大鼠體重（單位：g/只）

表2 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織炎癥萎縮病理觀察（±s）

表2 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織炎癥萎縮病理觀察（±s）

注：與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01。

分組鐵皮石斛組(n=12)鐵皮石斛粗多糖組(n=12)鐵皮石斛非多糖組(n=12)正常組(n=12)模型組(n=12)炎癥 (等級)0.65±0.38 0.50±0.18 0.46±0.23☆0.23±0.20★0.88±0.38腺體數(shù)量(個/mm)42.83±7.51★43.17±7.41★40.83±7.41☆45.83±7.16★33.67±4.58腺體厚度(um)290.40±42.61★276.12±42.48★237.2±29.54 254.91±38.97☆212.02±41.83主細(xì)胞(個/視野)321.88± 68.37★290.91± 92.36☆249.41±106.87 319.42±121.35☆205.75±118.12壁細(xì)胞(個/視野)206.35±62.00 214.68±65.12 183.47±62.33 285.00±113.21★184.42±102.81

表3 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織不典型增生、腸化病理觀察（只）

2.3 胃組織PCNA蛋白、Bcl-2蛋白表達(dá)檢測：鐵皮石斛提取物組PCNA蛋白5.26±2.62（μg/mg）、Bcl-2蛋白3.33±1.87（μg/mg）；鐵皮石斛粗多糖提取物組PCNA蛋白 4.89±1.19（μg/mg）、Bcl-2蛋白 3.24±0.88（μg/mg）；鐵皮石斛非多糖提取物組PCNA蛋白5.35±2.65（μg/mg）、Bcl-2蛋白3.30±1.59（μg/mg）；模型組PCNA蛋白8.22±3.43（μg/mg）、Bcl-2蛋白5.04±2.14（μg/mg）。鐵皮石斛提取物組、鐵皮石斛粗多糖提取物組、鐵皮石斛非多糖提取物組胃組織PCNA蛋白較模型組均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白較模型組有降低，但5組之間的F檢驗未見顯著性（P＞0.05）。數(shù)據(jù)見表4。

表4 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織PCNA、Bcl-2蛋白分析（±s，μg/mg）

表4 鐵皮石斛組及其兩類主要組分提取組對MNNG誘發(fā)的CAG模型大鼠治療8周胃組織PCNA、Bcl-2蛋白分析（±s，μg/mg）

注：與模型組比較，☆P＜0.05。

分組鐵皮石斛組鐵皮石斛粗多糖組鐵皮石斛非多糖組正常組模型組例數(shù)12 12 12 12 12 PCNA 5.26±2.62☆4.89±1.19☆5.35±2.65☆6.82±3.53 8.22±3.43 Bcl-2 3.33±1.87☆3.24±0.88☆3.30±1.59☆4.22±2.28 5.04±2.14

3 討論

慢性萎縮性胃炎根據(jù)其臨床癥狀與體征，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“胃脘痛”“痞滿”等范疇，病機(jī)的關(guān)鍵在于脾胃虛弱，氣機(jī)升降失常[4]。清代葉天士在《臨證指南醫(yī)案》中指出：“胃宜降則和，非用辛開苦降，亦非苦寒下奪，以損胃氣，不過甘平或甘涼濡潤以養(yǎng)胃陰，則津液來復(fù)，使之通降而已矣?！睔v代醫(yī)家多有主張以養(yǎng)胃生津，促進(jìn)通降為主要治法[5]。

石斛性微寒，味甘、淡，具有益胃生津、滋陰清熱的功效。石斛在臨床實踐上常適用于陰虛型慢性萎縮性胃炎、慢性淺表性胃炎和慢性結(jié)腸炎等胃腸道病癥?！侗静萸笳妗酚涊d石斛“入脾腎，甘淡微苦、咸平，故能入脾，除虛熱”；清代汪昂《本草備要》“（石斛）甘淡入脾，而除虛熱”；《神農(nóng)本草經(jīng)》指出石斛“補(bǔ)五臟虛勞羸弱”之功效[6]。

鐵皮石斛富含石斛多糖、石斛堿以及總氨基酸等多種成分，藥效作用非常廣泛，在提高人體免疫能力、抗衰老、抑制腫瘤、補(bǔ)五臟虛勞、改善糖尿病癥狀和慢性萎縮性胃炎等方面有明顯療效[7]。鐵皮石斛的主要成分之一石斛粗多糖具有提高免疫力、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性，具有低毒、不良反應(yīng)少等特點[8]。石斛多糖可以減弱脂多糖引起巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的釋放[9]。傳統(tǒng)認(rèn)為多糖為鐵皮石斛主要藥效成分，而對非多糖關(guān)注相對較少。有研究證實鐵皮石斛莖非多糖成分不僅在體內(nèi)具有較強(qiáng)的抗氧化活性，在體外也具有抗氧化活性。在清除ABTS自由基方面，鐵皮石斛莖非多糖更是優(yōu)于粗多糖[10]。

增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是DNA復(fù)制合成過程中的必需蛋白，是一種僅在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，其表達(dá)合成密切反映細(xì)胞的增殖動力變化，而陽性表達(dá)更表明細(xì)胞是處于活躍的增殖狀態(tài)。B細(xì)胞淋巴瘤基因（Bcl-2）是一種親脂性膜蛋白，是一種原癌基因。主要通過阻斷細(xì)胞凋亡的公共信號傳遞通路，抑制或阻斷多種細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞壽命。胃黏膜處于細(xì)胞增殖與凋亡失衡狀態(tài)是在慢性萎縮性胃炎模型大鼠中普遍存在的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胃組織PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)升高，經(jīng)藥物干預(yù)后，鐵皮石斛提取物組及其兩類主要組分提取組PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)降低。表明鐵皮石斛提取物組及其兩類主要組分提取組可能通過下調(diào)PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)，促使胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡平衡，改善乃至逆轉(zhuǎn)CAG的病理狀態(tài)。也可能與其干預(yù)治療CAG的病理狀態(tài)恢復(fù)后胃組織的PCNA、Bcl-2蛋白過高表達(dá)自然回落有關(guān)。

鐵皮石斛及其兩類主要組分治療MNNG誘發(fā)慢性萎縮性胃炎模型大鼠具有顯著減輕體重丟失、改善胃組織腺體萎縮、不典型增生、腸化，下調(diào)PCNA、Bcl-2蛋白的高表達(dá)，阻止向癌前病變進(jìn)一步發(fā)展，促使病變胃黏膜恢復(fù)正常，起到改善乃至逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎的作用。其中兩類主要組分鐵皮石斛粗多糖和鐵皮石斛非多糖均有一定的療效貢獻(xiàn)。

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國家科技重大專項重大新藥創(chuàng)制項目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎的臨床研究，編號：2016ZX09101069；浙江省自然科學(xué)基金項目鐵皮楓斗顆粒有效成分治療慢性萎縮性胃炎的分子機(jī)理實驗研究，編號：LY15H280011；浙江省重大科技專項項目鐵皮楓斗顆粒治療慢性萎縮性胃炎研究——擴(kuò)大適應(yīng)癥研究，編號：2009C13032。

# 通訊作者：吳人照，E-mai l：wufeng03@126.com

2017-04-17