蓓蕾藍靛果花色苷對乙醇誘導小鼠氧化損傷的保護作用

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(1.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所,黑龍江哈爾濱 150040;3.北華大學林學院,吉林吉林 132013)

蓓蕾藍靛果花色苷對乙醇誘導小鼠氧化損傷的保護作用

周麗萍1,2,3,張悅2,王化2,李夢莎2,何丹嬈2,杜鳳國3,*

(1.東北林業(yè)大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所,黑龍江哈爾濱 150040;3.北華大學林學院,吉林吉林 132013)

探討蓓蕾藍靛果(Loniceracaerulea‘Beilei’)花色苷對乙醇誘導小鼠氧化損傷的保護作用。方法:將小鼠按體重隨機分為對照組、模型組、VC陽性對照組(20 mg/kg bw)、花色苷低劑量組(50 mg/kg bw)、花色苷中劑量組(100 mg/kg bw)和花色苷高劑量組(200 mg/kg bw),每天經(jīng)口灌胃,灌胃容量為0.2 mL/10 g,對照組和模型組經(jīng)口灌胃等體積的生理鹽水。30 d后,除對照組外,其他實驗組灌胃乙醇造成氧化損傷模型,檢測血液和組織中的丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基(PC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。結(jié)果表明蓓蕾藍靛果花色苷可以極顯著(p<0.01)降低小鼠體內(nèi)MDA和PC含量,極顯著(p<0.01)提高體內(nèi)SOD、GSH-PX抗氧化酶的活力和抗氧化物質(zhì)GSH的含量。蓓蕾藍靛果花色苷具有防護乙醇誘導小鼠氧化損傷的功能。

蓓蕾藍靛果,花色苷,乙醇,氧化損傷

飲酒是現(xiàn)代生活的重要調(diào)和元素,但過量攝入或者低劑量長期攝入都會對身體造成傷害。乙醇代謝會產(chǎn)生大量自由基,機體抗氧化能力不足以應付自由基的積累,從而對機體造成氧化損傷。醫(yī)學研究表明,氧化傷害是導致機體中各組織器官損傷、病變的重要原因之一,人類許多重大疾病如動脈粥樣硬化、風濕性關節(jié)炎、糖尿病、癌癥以及衰老過程均與自由基造成的氧化損傷有關。從植物中尋找高效、低毒、價廉的抗氧化劑成為研究的熱點。研究表明,花色苷不但是天然的抗氧化劑,而且具有延緩衰老、降血脂、預防糖尿病、抗腫瘤[1-4]等多種功效。藍靛果富含花色苷類物質(zhì),是天然抗氧化劑的良好原料。研究表明藍靛果提取物對DPPH自由基的清除率達到85%,比番茄(平均為43%)、沙棘(74%)和VC(平均為51%)的清除率均要高[5],藍靛果提取物的總抗氧化能力也高于篤斯越橘和紅樹莓[6],花色苷類物質(zhì)是藍靛果中主要的抗氧化活性物質(zhì)[7]。

蓓蕾藍靛果(Loniceracaerulea‘Beilei’)是從俄羅斯引進品種中優(yōu)選出來的栽培藍靛果品種。2011年4月通過黑龍江省農(nóng)作物品種審定委員會審定,其各方面性狀優(yōu)于野生藍靛果,尤其是花色苷含量是野生藍靛果的2倍[8]。目前,蓓蕾藍靛果在黑龍江省各地區(qū)已經(jīng)大量推廣栽培,而對其果實的相關功能的研究尚未見報導。為了評價蓓蕾藍靛果花色苷的體內(nèi)抗氧化活性,采用建立乙醇誘導氧化損傷小鼠模型,探討蓓蕾藍靛果花色苷對乙醇誘導小鼠氧化損傷的保護作用,為蓓蕾藍靛果的綜合開發(fā)利用及豐富天然植物源抗氧化劑原料奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蓓蕾藍靛果果實 由哈爾濱市塘坊浩北種植合作有限公司提供;實驗動物 健康成年昆明種SPF級雄性小鼠[生產(chǎn)許可證號:SCXK(黑)2016-001、使用許可證號:SYXK(黑)2015-002]90只,體質(zhì)量(25.0±2.0)g;丙二醛(MDA)、蛋白質(zhì)羰基(PC)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Uv-ViSEVO300紫外-可見分光光度計 Thermo公司;低溫高速離心機 Thermo公司;潔凈動物培養(yǎng)箱 東北林業(yè)大學植物藥工程研究中心。

1.2實驗方法

1.2.1 蓓蕾藍靛果花色苷凍干粉的制備 蓓蕾藍靛果花色苷果實粉碎,用70%乙醇提取,提取液真空濃縮,以X-5大孔樹脂為固定相,經(jīng)40%～70%的乙醇水溶液由低濃度到高濃度梯度洗脫,分離純化蓓蕾藍靛果花色苷,得到10個組分,以量最大的2號花色苷組分(花色苷純 度為51.20%)為樣品進行本實驗研究。

1.2.2 動物建模方法 依據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局以國食藥監(jiān)保化〔2012〕107號印發(fā)《抗氧化功能評價方法》中所規(guī)定的乙醇氧化損傷模型造模方法建模。

SPF級昆明健康成年雄性小鼠90只,體重25～30 g。實驗室溫度:(23±2) ℃,相對濕度:(45%±5%),正常適應性喂養(yǎng)3 d后,將小鼠按體重隨機分為對照組、模型組、VC陽性對照組和低、中、高劑量花色苷組6組,每組15只。VC陽性對照組(20 mg/kg bw),花色苷低劑量組(50 mg/kg bw)、花色苷中劑量組(100 mg/kg bw)、花色苷高劑量組(200 mg/kg bw),對照組和模型組經(jīng)口灌胃等體積的生理鹽水,灌胃容量為0.2 mL/10 g,連續(xù)30 d,并根據(jù)體質(zhì)量來調(diào)整灌胃劑量,灌胃期間自由取食和飲水。

末次灌胃后,除對照組外,其他5組禁食16 h,然后1次性經(jīng)口灌胃,給予50%乙醇12 mL/kg BW,6 h后取材。

采用眼球取全血,4 ℃低溫離心分離血清備用;冰上取小鼠臟器,以預冷的生理鹽水沖洗后吸干水分,-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.3 指標測定 指標檢測參照各指標的試劑盒說明書方法進行測定。肝、腦組織勻漿的制備,參照試劑盒說明書的方法進行制備。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體質(zhì)量的影響

實驗小鼠隨機分組,實驗前各組小鼠平均體質(zhì)量無顯著性差異(p>0.05)。根據(jù)分組設計分別灌胃,于灌胃前每隔3 d測定各只小鼠的體質(zhì)量,連續(xù)測定28 d,各劑量組小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果見圖1。

圖1 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of anthocyanins abstractedfrom Lonicera caerulea ‘Beilei’on the weight in mice(±SE,n=15)

由圖1可見,飼喂期間各組小鼠的體質(zhì)量隨著時間的延長,體質(zhì)量均呈正增長趨勢,通過顯著性分析各組之間實驗終末體質(zhì)量和凈增體質(zhì)量無顯著性差異(p>0.05),這說明花色苷和陽性對照物在實驗劑量范圍內(nèi)對小鼠正常生長無影響,對動物機體是安全的。

2.2蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體內(nèi)脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一,通過測定機體血清和組織中MDA的含量,可以間接估計乙醇誘導體內(nèi)氧化損傷的脂質(zhì)過氧化水平。蓓蕾藍靛果花色苷各劑量組對小鼠血清和組織中的MDA含量影響見表1。

表1 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠血清和臟器組織中MDA含量的影響Table 1 Effect of anthocyanins abstractedfrom Lonicera caerulea ‘Beilei’on MDA in serum and organs in mice(±SE,n=15)

注:a:與對照組比較,差異顯著(p<0.05);A:與對照組比較,差異極顯著(p<0.01);b:與模型組比較,差異顯著(p<0.05);B:與模型組比較,差異極顯著(p<0.01);c:與陽性對照組比較,差異顯著(p<0.05);C:與陽性對照組比較,差異極顯著(p<0.01),下同。

由表1可見,模型組血清、腦和肝中MDA含量增加,與對照組之間有極顯著性差異(p<0.01),表明乙醇誘導的小鼠氧化損傷,促使體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生?；ㄉ崭鲃┝拷M血清、肝和腦中的MDA含量極顯著(p<0.01)低于模型組,表明蓓蕾藍靛果花色苷可以有效預防乙醇所致的小鼠機體脂質(zhì)過氧化傷害。而陽性對照組與模型組比較,小鼠血清和肝中的MDA含量無顯著性差異(p>0.05),而腦組織中MDA含量極顯著(p<0.01)低于模型對照組,表明陽性對照組VC對腦組織的脂質(zhì)過氧化損傷具有抑制作用。由此說明花色苷各對小鼠整個機體的氧化損傷保護作用效果優(yōu)于VC陽性對照組。并且血清中MDA含量隨著花色苷計量的增加而減少,說明花色苷抑制小鼠血清中脂質(zhì)過氧化水平,存在劑量-效應關系,在實驗選定范圍內(nèi),高劑量組最好;而抑制腦中脂質(zhì)過氧化水平則是低劑量組最好。

2.3蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體內(nèi)蛋白質(zhì)氧化產(chǎn)物PC含量的影響

羰基產(chǎn)物也是機體受到氧化損傷的產(chǎn)物。主要原因是過氧化氫或超氧自由基氧化蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈,導致羰基產(chǎn)物的積累。通過測定PC的含量,可以間接說明花色苷抑制氧化損傷的能力。結(jié)果見表2。

表2 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠血清和臟器組織中PC含量的影響Table 2 Effect of anthocyanins abstracted from Lonicera caerulea ‘Beilei’on PC in serumand organs in mice(±SE,n=15)

表2結(jié)果可知,模型組血清、腦和肝中的蛋白質(zhì)羰基含量極顯著(p<0.01)高于對照組,表明乙醇誘導小鼠氧化損傷可破壞機體內(nèi)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),導致PC含量增加。陽性對照組和花色苷各劑量組血清、腦和肝中的PC含量極顯著(p<0.01)低于模型組,表明蓓蕾藍靛果花色苷可以通過保護蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),來降低乙醇氧化對小鼠機體的損傷。并且小鼠血清和肝中PC含量隨著花色苷劑量的增加而減少,表明蓓蕾花色苷劑量與PC水平之間存在劑量-效應關系,在實驗選定范圍內(nèi),高劑量組效果最好。

2.4蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體內(nèi)過氧化物酶SOD和GSH-Px活力的影響

SOD和GSH-Px是機體內(nèi)主要的抗氧化酶系,其清除自由基的能力與酶活性成正比。通過測定小鼠血清和組織中抗氧化酶系的活性可以探討花色苷是否可以通過激活小鼠機體抗氧化酶系,起到預防氧化損傷的效果。蓓蕾藍靛果花色苷各劑量組對小鼠血清和臟器組織中SOD和GSH-Px含量的影響結(jié)果見表3和表4。

表3 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠血清和臟器組織中SOD的影響Table 3 Effect of anthocyanins abstractedfrom Lonicera caerulea ‘Beilei’on SOD in serum and organs in mice(±SE,n=15)

由表3可見,模型組與對照組比較,模型組血清和肝中的SOD活性極顯著(p<0.01)低于對照組,表明乙醇誘導的小鼠氧化損傷降低了機體內(nèi)SOD酶的活性;陽性對照組與模型組比較,小鼠血清和肝中SOD酶的活性升高極顯著(p<0.01),而腦中的SOD酶活性差異不顯著(p>0.05);花色苷各劑量組與模型組比較,不但血清和肝中的SOD酶活性提高極顯著(p<0.01),同時腦中SOD酶活性也極顯著(p<0.01)升高。

表4 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠血清和臟器組織中GSH-PX的影響 (x(-)±SE,n=15)Table 4 Effect of anthocyanins abstractedfrom Lonicera caerulea ‘Beilei’ on GSH-PXin serum and organs in mice(±SE,n=15)

由表4可見,模型組與對照組比較,模型組血清、腦和肝中的GSH-Px活性極顯著(p<0.01)低于對照組,表明乙醇誘導的小鼠氧化損傷降低了機體內(nèi)GSH-Px酶的活性;陽性對照組和花色苷各劑量與模型組比較,可以極顯著(p<0.01)提高血清、腦和肝中的GSH-Px活性,并且花色苷各劑量組提高GSH-Px活性效果極顯著(p<0.01)優(yōu)于陽性對照組。

表3和表4研究結(jié)果表明,蓓蕾藍靛果花色苷可以通過激活機體內(nèi)SOD和GSH-Px抗氧化酶的活性,來起到保護機體免受氧化損傷。

2.5蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠體內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH含量的影響

表5 蓓蕾藍靛果花色苷對小鼠血清和臟器中GSH含量的影響Table 5 Effect of anthocyanins abstractedfrom Lonicera caerulea ‘Beilei’on GSH in serum and organs in mice(±SE,n=15)

由表5可見,模型組血清和腦中GSH的含量雖然略低于對照組,但是無顯著性差異(p>0.05),而模型組肝中的GSH的含量極顯著(p<0.01)低于對照組,表明乙醇誘導的小鼠氧化損傷可導致肝中抗氧化物質(zhì)GSH的含量降低;陽性對照組血清和腦中GSH的含量極顯著(p<0.01)高于模型組,表明陽性對照組可以提高機體中GSH的含量;花色苷中、高劑量組血清中GSH的含量極顯著(p<0.01)高于模型組,花色苷低劑量組腦和肝中的GSH的含量極顯著(p<0.01)高于模型組,表明花色苷可以有效提高機體抗氧化物質(zhì)GSH的含量,并且存在劑量-效應關系。

3 結(jié)論與討論

藍靛果富含多酚、花色苷等抗氧化物質(zhì),這些物質(zhì)含有酚羥基,是藍靛果中主要的抗氧化活性物質(zhì)[9]。本研究結(jié)果表明蓓蕾藍靛果花色苷對乙醇誘導的小鼠氧化損傷具有防護作用。作用途徑可能是通過直接清除自由基、降低脂質(zhì)過氧化水平、激活機體抗氧化酶活力,增強機體抗氧化酶活性等多個途徑來實現(xiàn)的。

乙醇在體內(nèi)氧化會產(chǎn)生自由基,攻擊細胞膜,使細胞受到損傷。丙二醛(MDA)是常用的測定膜脂過氧化指標。Palíková等[10]研究表明18.5%的藍靛果花色苷提取物對肝微粒體脂質(zhì)過氧化有抑制作用。本研究結(jié)果也表明蓓蕾藍靛果花色苷可以極顯著降低小鼠機體內(nèi)MDA含量,保護機體免受脂質(zhì)過氧化傷害。這可能是因為蓓蕾藍靛果花色苷含有酚羥基,可以直接與乙醇誘導機體產(chǎn)生的自由基結(jié)合,從而起到預防氧化傷害。

乙醇進入人體后,90%以上是在肝臟代謝,單次攝入過量酒精所致的急性酒精中毒導致的肝損傷機制之一是通過激活氧分子產(chǎn)生氧自由基,當超過機體抗氧化系統(tǒng)清除能力時便可導致肝細胞膜脂質(zhì)過氧化反應而引起肝細胞損傷[11]。有研究表明GSH-Px在抵抗酒精所致的肝損傷中起關鍵作用,其活力水平可以表明酒精性肝損傷時肝臟抗氧化能力[12]。有研究表明藍靛果果渣提取物可通過提高肥胖大鼠SOD、GSH-Px活性,防止脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物產(chǎn)生[5]。本研究結(jié)果也表明蓓蕾藍靛果花色苷各劑量組小鼠肝內(nèi)SOD和GSH-Px酶的活力極顯著(p<0.01)提高。這說明花色苷一方面可以通過自身與氧化損傷產(chǎn)生的自由基結(jié)合,降低乙醇對肝臟的損害,同時也可以通過激活機體內(nèi)抗氧化酶的活性,使其與氧化損傷產(chǎn)生的自由基結(jié)合,起到抗氧化的效果。乙醇對神經(jīng)有麻醉作用,慢性酗酒和一次性攝入過量均可造成腦損傷[13]。乙醇的致神經(jīng)毒性的機制被認為與氧自由基的神經(jīng)毒性以及線粒體細胞色素氧化酶的活性低下有關[14]。有研究表明SOD酶活性和MDA含量的高低與氧自由基導致的腦損傷相關[15,16]。本研究乙醇誘導的小鼠模型中,模型組腦中MDA含量極顯著(p<0.01)升高,SOD酶的活力水平極顯著(p<0.01)降低,表明乙醇誘導氧化的小鼠造成了腦組織氧化損傷。通過灌胃蓓蕾藍靛果花色苷,腦中MDA含量極顯著(p<0.01)降低,SOD酶的活力水平極顯著(p<0.01)升高,這表明蓓蕾藍靛果花色苷可以通過調(diào)節(jié)腦中SOD酶活和MDA含量水平預防氧自由基導致的腦損傷。并且花色苷效果優(yōu)于VC陽性對照,可能與蓓蕾藍靛果花色苷能通過血腦屏障清除自由基有關。

GSH為一種典型的非酶類抗氧化劑,GSH的含量可以反映出非酶類抗氧化防御系統(tǒng)的狀態(tài)。本研究結(jié)果表明,蓓蕾藍靛果花色苷可以通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)抗氧化物質(zhì)GSH的含量,防護氧化損傷。

蓓蕾藍靛果花色苷可以通過多個途徑預防乙醇誘導的氧化損傷,并且存在劑量-效應關系,在實驗選定劑量范圍內(nèi),高劑量組效果最好,但作用的分子機制尚不清楚,還有待進一步研究。

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ProtectionofLoniceracaerulea‘Beilei’anthocyaninsonoxidativeinjuryofmiceinducedbyethanol

ZHOULi-ping1,2,3,ZHANGYue2,WANGHua2,LIMeng-sha2,HEDan-rao2,DUFeng-guo3,*

(1.School of Forestry,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China;2.Institute of Natural Resources and Ecology,Heilongjiang Academy of Sciences,Harbin 150040,China;3.Forestry College of Beihua University,Jilin 132013,China)

To explore the protection ofLoniceracaerulea‘Beilei’ anthocyanins on ethanol induced oxidative injury in mice.According to the weight,mice were randomly divided into 6 groups,the control group,model group,VCcontrol group(20 mg/kg BW),anthocyanins low dose group(50 mg/kg BW),anthocyanin medium dose group(100 mg/kg BW)and anthocyanin high dose group(200 mg/kg BW). The volume of oral gavage was 0.2 mL/10 g per day,and the control group and model group were filled with normal saline. After 30 days,the oxidative damage model was induced by oral gavage with ethanol except the control group. The content of malondialdehyde(MDA),protein carbonyl(PC),superoxide dismutase(SOD),glutathione peroxidase(GSH-PX)and glutathione(GSH)in blood and tissues were detected. Results showed thatLoniceracaerulea‘Beilei’ anthocyanins could significantly reduce the content of MDA and PC in mice(p<0.01),and it could significantly(p<0.01)improve the activity of SOD and GSH-PXinvivoand raise the content of GSH.Loniceracaerulea‘Beilei’ anthocyanins have protective effect in preventing oxidative damage in mice.

Loniceracaerulea‘Beilei’;anthocyanin;ethanol;oxidative damage

TS201.4

A

1002-0306(2017)19-0293-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.054

2017-04-11

周麗萍(1976-)，女，博士研究生，副研究員，研究方向：植物活性成分，E-mail:zhoulipingnefu@163.com。

*通訊作者:杜鳳國(1960-)，男，博士，教授，研究方向：植物資源培育與開發(fā)利用，E-mail:dfg4656@qq.com。

“十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFC500300)；黑龍江省科學院院基金項目(2014)；黑龍江省科學院對外合作基金項目(2016)。