柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料的制備及其抗氧化活性

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(江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料的制備及其抗氧化活性

管章瑞,田裕,夏小樂*,吳劍榮*

(江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

以柚子和菊芋為原料,經酒藥、釀酒酵母、植物乳桿菌、醋酸桿菌混合發(fā)酵制得具有較強抗氧化活性的果蔬發(fā)酵飲料。通過正交實驗確定果蔬汁澄清工藝,監(jiān)測發(fā)酵過程中理化指標及抗氧化活性物質的變化,并采用DPPH法、超氧陰離子法和還原能力檢測果蔬發(fā)酵飲料的抗氧化活性。結果表明,果蔬汁中果膠酶濃度0.08%,溫度55 ℃,時間50 min,果蔬飲料的透光率最佳達到85.8%。果蔬飲料混合發(fā)酵結束時,果蔬汁中添加酒藥的總糖和抗氧化活性物質比未添加酒藥的含量高,其中添加酒藥的果蔬飲料中總糖含量達3.973 g/L,提高28.41%,維生素C的含量達9.454 mg/100 mL,提高23.81%;柚皮苷的含量達0.150 mg/mL,提高23.97%;菊糖的含量達1.229 mg/mL,提高63.65%。果蔬發(fā)酵飲料對DPPH自由基的清除率達95.50%,高于谷胱甘肽但低于VC;對超氧陰離子的清除率達73.90%,均高于谷胱甘肽和VC;還原能力明顯高于谷胱甘肽但低于VC。

柚子,菊芋,酒藥,抗氧化,果蔬發(fā)酵飲料

柚子含有較高的VC，可以降低人體內的自由基,促進氨基酸的代謝,延遲壽命。還含有豐富的酚類化合物,這些酚類化合物具有清除自由基抗氧化的作用,對人體的健康有益[1]。菊芋是一種菊科向日葵屬宿根性草本植物。菊芋地下塊莖含豐富的菊糖,菊糖又名菊粉,具有天然抗氧化特性[2-4]。尚紅梅等[5]對菊粉的抗氧化性進行研究,研究表明隨著菊粉濃度的增大其清除活性逐漸增強。目前,國內研制的純天然且具有天然抗氧化活性的果蔬發(fā)酵飲料仍存在不足,許曉芳[6]等研制的茉莉柚子復合飲料,雖然風味濃郁、酸甜適中,但略帶苦味,并未研究其天然抗氧化活性。李奇[7]等研制的紫甘薯和黑提葡萄復合果蔬飲料具有天然的抗氧化活性,但其復合果蔬飲料酸度不足,通過添加檸檬酸來解決。本研究將柚子和菊芋按一定比例混合以強化其風味,且不添加任何抗氧化劑和酸度調節(jié)劑,并且它們擁有良好的體內自由基清除活性,可研發(fā)一種具有較強抗氧化活性的新型復合功能飲料。

眾所周知,菊芋在攪拌過程中極易發(fā)生褐變,嚴重影響后加工,并給后續(xù)處理帶來困難[8]。因此在加工過程中添加果膠酶,可顯著提高果蔬汁的透光率[9]。傳統(tǒng)果蔬發(fā)酵工藝是經釀酒酵母、醋酸桿菌、植物乳酸菌混合發(fā)酵制得,可以得到風味和口感較好的飲料,但對抗氧化活性的研究少有報道[10],而消費者更加青睞具有天然抗氧化活性的飲料[11]。因此,本文以新鮮的柚子、菊芋為原材料,經酒藥、釀酒酵母、植物乳酸菌、醋酸桿菌混合發(fā)酵,制得柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料。從工藝技術和經濟效益出發(fā),研究果蔬加工過程的酶解工藝,提高原料透光率,并監(jiān)測發(fā)酵過程中理化指標及抗氧化活性物質的變化,研究果蔬發(fā)酵飲料對DPPH自由基、超氧陰離子、還原能力的清除能力,為柚子和菊芋的綜合開發(fā)利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料和儀器

酒藥 江蘇南通白蒲黃酒有限公司;釀酒酵母CICIM Y0086(T)、植物乳桿菌CICIM Boo80(T) 江南大學工業(yè)微生物資源和信息中心;巴氏醋酸桿菌滬釀1.01菌株CICC 2001 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;柚子(表皮光滑細致,外形上尖下寬、底部扁圓,分量重)、菊芋(表面無腐爛) 無錫市歐尚超市有限公司;白砂糖 廣州福正東海食品有限公司;果膠酶(食品級,酶活力單位3萬U/g) 鄭州康帆生物科技有限公司;DPPH 上海麥克林生化科技有限公司;菊粉酶(20萬U/g) 上海源葉生物科技有限公司;鐵氰化鉀溶液、三氯乙酸、FeCl3、苯酚、濃硫酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、濃鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚,分析純。

數顯恒溫水浴鍋 上海通特科技儀器廠;多功能攪拌機 好生活電子科技有限公司;立式圓形壓力蒸氣滅菌器 上海醫(yī)用核子儀器廠;分析天平 上海精科天美科學儀器有限公司;pH計 德國賽多利斯股份公司;紫外分光光度計 北京普析通用儀器責任有限公司;均質機 上海索廷機電設備有限公司;數顯恒溫水浴鍋 上海通特科技儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 柚子和菊芋果蔬發(fā)酵飲料的制備工藝 原料選擇→預處理→打漿→酶解→一步發(fā)酵→二步發(fā)酵→三步發(fā)酵→過濾→調配→均質→罐裝封口→殺菌→冷卻→成品

1.2.2 操作要點 原料選擇:選擇表皮光滑、外形上尖下寬、分量重且水分充足的柚子及表面無腐爛的菊芋作為原材料;預處理:將柚子、菊芋的皮用干凈的水果刀削掉,用飲用水洗凈,分別切碎成塊;打漿:放入高速攪拌機中打漿,所得漿液備用;酶解:原料中含有大量的果膠,因此在漿液中加入果膠酶,所得溶液備用;一步發(fā)酵:在無菌操作臺上將上述所得溶液加入200%飲用水、1.5%酒藥和5%釀酒酵母,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d;二步發(fā)酵:在無菌操作臺上將上述所得溶液加入5%植物乳桿菌,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d;三步發(fā)酵:在無菌操作臺上將上述所得溶液加入5%醋酸桿菌,置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 d;將上述所得溶液,過濾,濾液用15%白砂糖、10%低聚果糖和10%低聚半乳糖分別加熱溶解,待用;均質(8～10 MPa)與灌裝封口;殺菌(121 ℃,30 min)、冷卻(4 ℃冰箱)。

1.2.3 果蔬加工果膠酶解工藝的研究

1.2.3.1 單因素實驗 為了減少果蔬飲料的濁度和黏度等問題,對果蔬原料用果膠酶處理。根據相關文獻[12],在55 ℃,30 min條件下,果膠酶濃度采用0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%;在30 min,0.08%濃度條件下,溫度采用35、40、45、50、55、60 ℃;在55 ℃,0.08%濃度條件下,時間采用10、20、30、40、50、60 min,分別于8000 r/min離心10 min。取上清液以蒸餾水作參比,以不添加果膠酶作為空白對照,在660 nm處測定果汁的透光率T(%),平行實驗3次。

1.2.3.2 正交實驗 根據影響果蔬汁透光率的果膠酶量、溫度、時間三因子的水平范圍,采用三因素三水平設計正交優(yōu)化實驗,確定最佳的提取工藝條件。

表1 正交實驗因素及水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 發(fā)酵過程中理化指標的檢測 發(fā)酵整個階段,每天上午9點取樣分析,測定發(fā)酵液的pH、總酸、總糖、乙醇、VC、柚皮苷、菊糖含量。pH:pH計;酸度:NaOH滴定法[13];總糖:苯酚硫酸法[14];乙醇:重鉻酸鉀比色法[15];VC:2,6-二氯靛酚滴定法[16];柚皮苷:HPLC(色譜條件:色譜柱:C18色譜柱;流動相:超純水+甲醇=65+35;柱溫:35 ℃;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:283 nm);菊糖∶菊糖含量(mg/mL)=添加菊粉酶(1‰,55 ℃,48 h)果蔬飲料的還原糖(mg/mL)-發(fā)酵時果蔬飲料的還原糖(mg/mL)式(1)。

1.2.5 抗氧化活性研究

1.2.5.1 對二苯代苦味?；杂苫?DPPH)清除能力的測定 將2 mL果蔬飲料及2 mL 20 mmol/L DPPH溶液加同試管中,搖勻,放置30 min后用溶劑作參比測定其吸光度Ai,同時測定20 mmol/LDPPH溶液與2 mL溶劑混合后的吸光度Ac,以及2 mL提取物與2 mL溶劑混合后的吸光度Aj。按照下列公式計算清除率,清除率越大抗氧化能力越強[17]。

DPPH·抑制率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(2)

1.2.5.2 超氧陰離子清除實驗 取0.5 mL待測液于10 mL試管中,分別加入4.5 mL Tril-HCL溶液和3 mL蒸餾水,搖勻,25 ℃恒溫培養(yǎng)10 min,加0.6 mol/L鄰苯三酚0.1 mL,搖勻放置反應3 min,加10 mol/L濃鹽酸0.1 mL,測定吸光度值A325 nm,所有測定值均為三次平均值[18]。

抑制率(%)=[(R-W)/R]×100

式(3)中R為蒸餾水做空白;W為含樣品。

1.2.5.3 還原能力的測定 取2.5 mL待測液于10 mL試管中,分別加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,混合均勻,于50 ℃水浴中反應20 min。取出,再加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混合后以8000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL,加蒸餾水2.5 mL、0.1% FeCl30.5 mL,混合均勻,靜置10 min后,測定700 nm的吸光值A700,所有測定值均為三次平均值[19]。

1.2.6 感官評價標準 采用百分制的評分標準,通過10人組成的評分小組對產品的組織狀態(tài)、風味、口感、色澤進行評分,通過感官評分來確定最佳組合,感官評分標準見表2。

表2 感官評價標準Table 2 Standard of sensory evaluation

1.2.7 數據統(tǒng)計分析 采用Origin和SAS軟件對實驗數據進行方差分析。當p<0.05時,表示差異顯著,當p>0.05時,表示差異不顯著。所有實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1 果膠酶添加量的影響 果膠酶主要用于果蔬飲料的榨汁及澄清,對分解果膠具有良好的作用[20]。由圖1可知,隨著果膠酶用量的增加柚子菊芋果蔬汁的澄清度呈上升趨勢,主要因為果膠酶可以專一性地水解果膠類物質,使體系中其它膠體類物質因失去果膠的保護而沉淀析出,實現汁液澄清,透光率由0.01%果膠酶時的65.50%上升到0.10%果膠酶時的82.10%,在果膠酶用量達到0.06%時透光率增加最快,從經濟角度上采用0.06%的酶解濃度為宜。

圖1 酶解反應對果蔬汁透光率的影響Fig.1 Enzymatic hydrolysis concentration influenceon fruit and vege Table juices transmittance注:*p<0.05,與對照組相比；圖2、圖3同。

2.1.2 果膠酶溫度的影響 由圖2可知,溫度在35～55 ℃范圍內,澄清度隨溫度升高而上升,透光率由43.50%上升到82.00%。當溫度超過55 ℃后即使溫度升高澄清度也無法再提高,反而呈現快速下降的趨勢,60 ℃時透光率下降到80.40%,在酶穩(wěn)定的溫度范圍內,溫度升高有利于酶活力提高,當溫度超過一定值時,溫度升高將加速酶的鈍化,酶被鈍化后活性受抑制甚至消失,直接表現為酶促反應速度下降,作用效果降低[21]。本實驗的結果也驗證了這一點。從實驗結果可看出,當酶處理溫度為55 ℃時,果膠酶的作用效果最佳。

圖2 酶解溫度對果蔬汁透光率的影響Fig.2 Enzymatic hydrolysis temperature influenceon fruit and vege Table juices transmittance

2.1.3 果膠酶時間的影響 由圖3可知,果膠酶對柚子菊芋果蔬汁澄清效果隨時間延長呈現上升的趨勢,在10～60 min之間,透光率由39.80%上升到83.10%。當酶解時間為40 min時,透光率升高的最快,時間延長會導致生產成本上升及降低生產效率,因此選用40 min為最適處理時間。

圖3 酶解時間對果蔬汁透光率的影響Fig.3 Enzymatic hydrolysis time influenceon fruit and vege Table juices transmittance

2.2正交實驗

澄清工藝的正交實驗結果如表3所示。通過酶解條件的正交實驗結果的極差分析可知,各因素對柚子菊芋果蔬汁透光率的影響程度強弱順序為:B>C>A,即溫度對果蔬汁透光率影響最大,其次是酶解時間,影響較小的是果膠酶濃度。得出最佳澄清工藝條件為A3B3C3。

表3 澄清工藝的正交實驗結果Table 3 Clarification process results of orthogonal experiment

在正交實驗表中并沒有用到A3B3C3組合,因此需要在此條件下進行驗證。在最佳酶解條件下,即果膠酶濃度0.08%,溫度55 ℃,時間50 min。測定三次以驗證酶解效果,此條件下柚子菊芋果蔬汁的透光率達85.80%。

2.3發(fā)酵過程理化指標分析

2.3.1 柚子和菊芋果蔬發(fā)酵飲料發(fā)酵過程中pH、總酸、乙醇、總糖的變化 食品中的酸不僅作為酸味成分,而且在食品的加工、貯運及品質等方面起著重要作用。由圖4可知,添加酒藥等多菌種混合發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵的pH均呈下降趨勢,pH從4.19下降至3.85,并最終維持在3.85保持不變,因此酒藥的添加對發(fā)酵過程的pH無明顯影響。添加酒藥等多菌種混合發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵的總酸均呈逐漸上升,未添加酒藥的發(fā)酵液在第5 d上升較快,因為乳酸菌為優(yōu)勢菌群,發(fā)酵結束時總酸的含量為25.344 g/L。添加酒藥的發(fā)酵液在第5 d沒有急劇上升是因為酒藥中的微生物分擔營養(yǎng)物質及利用一部分乳酸,這導致總酸上升緩慢。在第6 d上升較快,這是添加醋酸桿菌所導致的,發(fā)酵結束時總酸的含量為23.808 g/L。由此說明酒藥的添加,對發(fā)酵液的pH和總酸基本無影響。適量的乙醇能為機體提供熱量,促進血液循環(huán),有利于健康。由圖5可知,發(fā)酵過程中乙醇的含量先穩(wěn)定增加后慢慢下降,醋酸菌的添加導致乙醇含量下降,最終乙醇含量維持在40.525 g/L,酒藥的添加對乙醇含量無影響?？偺堑暮扛叩蛯Ξa品的色、香、味、組織形態(tài)、營養(yǎng)價值、成本等有一定影響。發(fā)酵過程中添加酒藥的發(fā)酵液始終比未添加酒藥的發(fā)酵液總糖含量高,最終發(fā)酵完成時高出28.41%。

圖4 果蔬飲料發(fā)酵過程中pH與總酸的變化Fig.4 pH and total acid change of fruitand vege Table beverage in the fermentation process

圖5 果蔬發(fā)酵飲料發(fā)酵過程中乙醇與總糖的變化Fig.5 Ethanol and total sugar change of fruitand vege Table beverage in the fermentation process

表4 發(fā)酵前后抗氧化活性物質的變化Table 4 Antioxidant activity material changesbefore and after fermentation

2.3.2 發(fā)酵前后抗氧化活性物質的變化 抗氧化物質以較低的濃度,就能有效抑制自由基的氧化反應。由表4可得,在傳統(tǒng)工藝基礎上添加酒藥發(fā)酵劑,發(fā)酵結束產生的抗氧化活性物質均有顯著提高(p<0.05)。VC是一種抗氧化劑,因為它能夠保護身體免于氧化劑的威脅,添加酒藥發(fā)酵液的VC的含量達9.454 mg/100 mL,比傳統(tǒng)發(fā)酵的VC含量高23.81%。柚皮苷能夠阻斷鄰苯三酚自氧化的自由基鏈反應,具有抗氧化作用,添加酒藥發(fā)酵液的柚皮苷達0.150 mg/mL,比傳統(tǒng)發(fā)酵的柚皮苷含量高23.97%。菊糖主要通過提高細胞內抗氧化酶的活力發(fā)揮其抗氧化作用[22],添加酒藥發(fā)酵液的菊糖達1.229 mg/mL,比傳統(tǒng)發(fā)酵的菊糖含量高63.65%。添加酒藥發(fā)酵液的總糖含量高,產生的營養(yǎng)物質能夠被分解成更多的活性物質,結果表明,酒藥與多菌種混合發(fā)酵能夠增加抗氧化活性物質的含量。

對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,能夠有效的提高果蔬飲料的抗氧化性。除此之外,酒藥作為一種復合發(fā)酵劑,富含多種菌種,產生更多的營養(yǎng)物質,常被用為發(fā)酵多種傳統(tǒng)食品和飲料。本研究中,我們發(fā)現在傳統(tǒng)工藝的基礎上添加酒藥發(fā)酵,可提高果蔬發(fā)酵飲料的抗氧化性。但酒藥是一種混菌的發(fā)酵劑,導致抗氧化活性提高的具體原因尚未明確,可能是酒藥中某個或某些菌的原因,因此具體原因需要再進一步研究。

2.4柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料體外抗氧化活性的測定

2.4.1 DPPH自由基清除能力的測定 DPPH自由基有單電子,在517 nm處有一強吸收,其醇溶液呈紫色。當有自由基清除劑存在時,與其單電子配對而使其吸收逐漸消失,其褪色程度與接受的電子數量成定量關系,因而可用分光光度計進行快速的定量分析。由圖6可知,果蔬發(fā)酵飲料隨稀釋倍數的減少清除率逐漸上升,果蔬發(fā)酵飲料清除率達95.5%,略低于96.76%清除率的VC,遠高于67.21%清除率的未發(fā)酵液和80.72%清除率的谷胱甘肽,對DPPH自由基就具有很強的清除能力,結果說明柚子和菊芋果蔬發(fā)酵飲料具有較強的抗氧化還原能力。

圖6 果蔬發(fā)酵飲料清除DPPH能力的測定結果Fig.6 Clearing DPPH capacity determination results offermented fruit and vege Table drinks

圖7 果蔬發(fā)酵飲料超氧陰離子清除測定Fig.7 The ultra oxygen anion removal of determination offermented fruit and vege Table drinks

2.4.3 還原力的測定 還原能力的測定是以樣品是否為良好電子供應者為指標的,以特征吸收波長處的吸光度表示總抗氧化能力的強弱,吸光度越高,樣品的總抗氧化能力越強。由圖8可知,果蔬發(fā)酵飲料隨稀釋倍數的減少吸光度逐漸上升,果蔬發(fā)酵飲料的吸光度雖然低于陽性對照組VC,但吸光度明顯高于谷胱甘肽。結果表明,柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料具有體外抗氧化活性。

圖8 果蔬發(fā)酵飲料還原力的測定Fig.8 The determination of reducing power offermented fruit and vege Table drinks

2.5感官指標

對柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料的感官指標進行分析,結果如表5所示。

表5 柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料的感官評價Table 5 Standard of sensory evaluationof fruit and vege Table fermented beverage

3 結論

采用正交法對柚子菊芋果蔬加工過程酶解工藝進行優(yōu)化,以提高果蔬飲料的透光率,確定最佳澄清條件為果膠酶濃度0.08%,溫度55 ℃,時間50 min。在此條件下,柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料的透光率達85.80%。通過對果蔬發(fā)酵過程中理化指標及對抗氧化活性物質含量的測定,可更好的監(jiān)測發(fā)酵過程中各個因素的變化。改良工藝的果蔬發(fā)酵飲料,總糖含量達3.973 g/L,提高28.41%,VC的含量達9.454 mg/100 mL,提高23.81%;柚皮苷的含量達0.150 mg/mL,提高23.97%;菊糖的含量達1.229 mg/mL,提高63.65%,而pH、總酸及乙醇含量無明顯變化?？寡趸钚晕镔|含量提高,越有利于人體的健康。對果蔬發(fā)酵飲料的體外抗氧化活性進行研究,結果表明:對DPPH自由基的清除率達95.50%、對超氧陰離子自由基的清楚率達73.90%且具有還原能力,因此可得到抗氧化活性較高、口感較佳的柚子菊芋果蔬發(fā)酵飲料,但對于抗氧化活性作用的機理尚不明確,有待于繼續(xù)深入研究其抗氧化機理等,為實現天然抗氧化產品的開發(fā)奠定基礎。

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Fermentedbeverageofshaddockandjerusalemartichokepreparationanditsantioxidantactivityanalysis

GUANZhang-rui,TIANYu,XIAXiao-le*,WUJian-rong*

(Biological Engineering Institue,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

A fruit and vege
Table fermented beverage with strong antioxidant activity was made from raw materials(shaddock and jerusalem artichoke)which mixed fermentation by koji,Saccharomycescerevisiae,LactobacillusplantarumandAcetobacter. The clarification process of fruit and vege
Table juices was determined by orthogonal experiment,and the changes of physical and chemical indexes and antioxidant substances in the fermentation process were monitored. The antioxidant activity of fruit and vege
Table fermented beverage was detected by DPPH method,superoxide anion method and reducing ability respectively. It showed that the light transmittance of fruit and vege
Table beverage reached 85.80% with 0.08% of pectinase concentration of fruit and vege
Table juices,55 ℃ and 50 min. At the end of the mixed fermentation of fruit and vege
Table beverage,the total sugar increased 28.41% to 3.973 g/L,vitamin C was 9.454 mg/100 mL which increased 23.81%,naringin was 0.150 mg/mL,increased by 23.97%,and inulin was 1.229 mg/mL which increased 63.65%,compared to the fruit and vege
Table juices without adding the koji. The clearance rate of DPPH by fruit and vege
Table fermented beverage was 95.50%,which was higher than glutathione but lower than VC. The clearance rate of superoxide cations was 73.90%,which was higher than glutathione and VC. Reducing capacity was significantly higher than glutathione but lower than VC.

shaddock;jerusalem artichoke;Chinese yeast;antioxidant;fruit and vege
Table fermented beverage

TS255.36

A

1002-0306(2017)19-0136-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.026

2017-03-27

管章瑞(1993-),男,在讀碩士研究生,研究方向:釀造工業(yè)研究,E-mail:18811993852@163.com。

*通訊作者:夏小樂(1980-),男,博士,副教授,研究方向:釀造及其微生物研究,E-mail:xiaolexia@jiangnan.edu.cn。

吳劍榮(1976-),男,博士,副教授,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:kinowu@jiangnan.edu.cn。

江蘇省重點研發(fā)計劃(現代農業(yè))(BE2016331)。