基于RAW264.7細(xì)胞模型的不同茶類(lèi)抗炎功能特性

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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

基于RAW264.7細(xì)胞模型的不同茶類(lèi)抗炎功能特性

李曉飛,高雄,林曉蓉,張媛媛,李斌*,陳忠正*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

茶葉根據(jù)經(jīng)典加工工藝不同分為紅茶、綠茶、青(烏龍)茶、白茶、黃茶、黑茶。為探討不同加工工藝形成的不同茶類(lèi)的抗炎功能特性,本研究以云南大葉種綠茶、紅茶、普洱黑茶、金觀(guān)音烏龍茶、福鼎大白白茶、君山銀針黃茶為材料。采用硝普化鈉法和脂多糖誘導(dǎo) RAW264.7巨噬細(xì)胞為體外炎癥模型評(píng)價(jià)抗炎活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),綠茶、白茶及黃茶對(duì)一氧化氮(NO)的清除能力較強(qiáng),半抑制濃度(IC50)值在99.27～104.83 μg/mL范圍內(nèi);在六種茶類(lèi)中,黃茶對(duì)脂多糖誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的抑制作用最強(qiáng),其抑制NO產(chǎn)生的IC50值為398.13 μg/mL,在濃度為500 μg/mL時(shí),其對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的抑制率分別為69.25%、87.68%;黃茶可在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上,顯著下調(diào)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。相關(guān)性分析表明,茶多酚含量與清除NO的IC50值、抑制細(xì)胞產(chǎn)生NO的IC50值、TNF-α以及IL-6產(chǎn)生量均呈顯著負(fù)相關(guān)。表明六種茶類(lèi)均具有抗炎活性,黃茶對(duì)促炎癥因子(NO、TNF-α、IL-6)的抑制效果最佳,可通過(guò)下調(diào)iNOS基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平,減少NO產(chǎn)生,從而發(fā)揮抗炎功效。

六種類(lèi)茶,RAW264.7細(xì)胞,抗炎功效,炎癥介質(zhì)

在正常人機(jī)體內(nèi),適當(dāng)?shù)难装Y有助于清除損傷,促進(jìn)傷口修復(fù)和愈合,但過(guò)度的炎癥會(huì)釋放大量的炎癥介質(zhì),如一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)等。其中,過(guò)量的NO會(huì)進(jìn)一步產(chǎn)生活性氮自由基,攻擊DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子,造成細(xì)胞和組織損傷;過(guò)量的TNF-α、IL-6等促炎癥因子會(huì)進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng),造成惡性循環(huán)。持續(xù)的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重威脅人體健康,漸進(jìn)性導(dǎo)致惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等慢性疾病的發(fā)生[1-4]。

茶葉中含有豐富的茶多酚、茶多糖、生物堿、氨基酸等成分[5],賦予茶葉抗氧化、抗炎癥、抗癌、保護(hù)神經(jīng)等功能特性[6]。我國(guó)茶樹(shù)資源豐富,根據(jù)經(jīng)典制茶工藝,茶葉可分為:綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶等六大類(lèi),賦予茶葉不同的品質(zhì)特性。茶葉抗炎活性以綠茶和紅茶研究較多[7-8],也有研究者根據(jù)茶葉發(fā)酵程度,比較了綠茶(未發(fā)酵)、烏龍茶(半發(fā)酵)以及紅茶(全發(fā)酵)的抗炎活性[9]。但迄今未見(jiàn)同時(shí)比較六種不同茶類(lèi)抗炎功能特性的研究。

為系統(tǒng)比較六大經(jīng)典加工茶類(lèi)的抗炎功能特性,本研究以云南大葉種綠茶、紅茶、普洱黑茶、金觀(guān)音烏龍茶、福鼎大白白茶、君山銀針黃茶為材料,沸水浸提、凍干后,測(cè)定和比較凍干茶粉中茶多酚、咖啡堿等化學(xué)組成,采用硝普化鈉法評(píng)價(jià)NO清除能力,以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7體外炎癥細(xì)胞模型評(píng)價(jià)抗炎活性;以研究發(fā)現(xiàn)抗炎活性最強(qiáng)的黃茶為代表,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析其對(duì)一氧化氮合成酶(iNOS)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響,初步探討其抗炎機(jī)制,為系統(tǒng)比較不同茶類(lèi)的功能特性提供初步的理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

福建福鼎大白白茶、湖南君山銀針黃茶 由北京云開(kāi)雅集茶文化交流中心提供;金觀(guān)音烏龍茶 由廣東懷集高山青農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供;云南大葉種綠茶、紅茶 由廣東省華海糖業(yè)發(fā)展有限公司提供;云南大葉種普洱黑茶 由廣東省茶葉進(jìn)出口公司提供。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；色譜純甲酸(96%)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、脂多糖(LPS)、氨基苯磺胺、N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽 美國(guó)Sigma公司;無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、杜氏磷酸鹽緩沖液(DPBS)、GlutaMAX 美國(guó)Life公司;細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所;二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒、封閉液、化學(xué)發(fā)光試劑盒 美國(guó)Thermo公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)兔抗小鼠抗體、β-actin兔抗小鼠抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司;咖啡堿(99.9%)、Trizol提取試劑盒、4S Red Plus核酸染色劑、瓊脂糖、第一鏈cDNA合成試劑盒 上海生工生物有限公司;聚偏氟乙烯(PVDF)膜 德國(guó)Merk Millipore公司;色譜純甲醇 韓國(guó)Honeywell Burdick & Jackson公司;福林酚試劑(2 mol/L) 北京普博欣生物科技有限公司;所有實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

Centrifuge 5804R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf A G公司;ALPHA1-2 LD plus真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司;Milli-Q Integral 3超純水系統(tǒng) 德國(guó)Merk Millipore公司;UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼科有限公司;Spectra Max Plus酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司;HERAcell 150i CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;Ckx41顯微鏡 日本Olympus公司;Agilent 1200高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀、垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)槽 美國(guó)Bio-Rad公司;OmegaLumG自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀 美國(guó)Aplegen公司;Stepone plus型熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶葉水提取物凍干粉的制備 茶葉研磨過(guò)20～30目篩,按茶水比1∶25 (w/v)加入沸水,封口,100 ℃沸水浴浸提45 min,每10 min振搖一次,過(guò)濾、冷卻后,將濾液置于-40 ℃快速結(jié)凍,轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中凍干成茶粉,-20 ℃保存?zhèn)溆谩龈刹璺?超純水溶解后測(cè)定化學(xué)成分和一氧化氮(NO)自由基清除能力;細(xì)胞培養(yǎng)液溶解之進(jìn)行細(xì)胞測(cè)定實(shí)驗(yàn)。凍干粉得率計(jì)算公式如下:

式(1)

式中:m1為水提取物凍干粉的質(zhì)量,g;m0為浸提茶湯的茶葉干重,g。

1.2.2 NO自由基清除率測(cè)定 參照Tsai等[10]方法,并進(jìn)行適當(dāng)修改。將60 μL不同濃度的茶葉水提取物(15.63～250 μg/mL)和60 μL硝普化鈉溶液(10 mmol/L,pH7.4磷酸鹽緩沖液配制)先后加入96孔板并混勻,日光燈下,25 ℃光照150 min后,加入120 μL Griess試劑(60 μL A溶液:2%(w/v)氨基苯磺胺溶于4%磷酸水溶液,60 μL B溶液:0.2%(w/v)N-1-萘基乙二胺二鹽酸鹽溶于水),酶標(biāo)儀測(cè)定542 nm處吸光值。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7復(fù)蘇后,培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中,每隔2 d繼代一次。培養(yǎng)液組成為88%無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基、10% FBS、1%青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)、1% GlutaMAX(4 mmol/L)。

1.2.4 RAW264.7細(xì)胞上清液中NO產(chǎn)生量測(cè)定 參照Z(yǔ)hang等[11]方法,接種細(xì)胞:RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)/mL的濃度接種于96孔板,每孔200 μL,于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;加入樣品:棄去舊培養(yǎng)液,加入100 μL不同濃度的茶葉水提取物(細(xì)胞培養(yǎng)液配制)和100 μL終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻,繼續(xù)培養(yǎng);NO產(chǎn)生量測(cè)定:加入樣品培養(yǎng)24 h后取出96孔板,每孔轉(zhuǎn)移100 μL細(xì)胞培養(yǎng)上清液到新96孔板,向新96孔板加入100 μL Griess試劑,酶標(biāo)儀測(cè)定542 nm處吸光值;細(xì)胞存活率測(cè)定:將舊96孔板中剩余培養(yǎng)液棄去,每孔加入100 μL MTT溶液(0.05 mg/mL),于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后,棄去MTT溶液,加入200 μL二甲基亞砜,置于搖床上(100 r/min)搖勻15 min,酶標(biāo)儀測(cè)定550 nm處吸光值。NO產(chǎn)生百分比和細(xì)胞存活率的計(jì)算公式如下:

式(2)

式(3)

式中:A樣品+LPS為樣品和LPS共處理組吸光值;A樣品為樣品單獨(dú)處理組吸光值;ALPS為L(zhǎng)PS單獨(dú)處理組吸光值;A空白為正常培養(yǎng)組吸光值。NO百分比(%)是相對(duì)于LPS單獨(dú)處理組,即將LPS單獨(dú)處理組的NO產(chǎn)生量當(dāng)作100%;細(xì)胞存活率(%)是相對(duì)于LPS單獨(dú)處理組,即將LPS單獨(dú)處理組的細(xì)胞存活率當(dāng)作100%。

1.2.5 TNF-α和IL-6含量測(cè)定 接種細(xì)胞:同1.2.5,樣品處理組分別加入500 μg/mL茶葉水提取物和終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻?？瞻捉M只加細(xì)胞培養(yǎng)液,對(duì)照組只加LPS溶液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,將96孔板1000×g離心20 min,吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,稀釋適當(dāng)倍數(shù),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α和IL-6含量。

1.2.6 茶葉水提取物凍干粉主要化學(xué)成分測(cè)定 采用福林酚比色法測(cè)定茶多酚含量[12];茚三酮比色法測(cè)定游離氨基酸含量[12];硫酸-蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[13];高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定咖啡堿含量[14],測(cè)得的化學(xué)成分含量均換算成占凍干茶粉的百分比。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平 參照王佐等[15]的方法,并進(jìn)行適當(dāng)修改。接種細(xì)胞:RAW264.7細(xì)胞按5×105個(gè)/mL的濃度接種于直徑70 mm培養(yǎng)皿中,于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;加入樣品:棄去舊培養(yǎng)液,加入不同濃度的黃茶水提取物和終濃度為1 μg/mL的LPS溶液,混勻,繼續(xù)培養(yǎng)24 h;總RNA提取:棄去舊培養(yǎng)液,用Trizol提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,UV-2102C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定提取RNA的A260及A280值;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按試劑盒說(shuō)明,在PCR管中加入RNA 800 ng和隨機(jī)引物p(dN)6(0.2 μg/μL)1 μL,用不含RNA酶的超純水定容至13 μL;70 ℃溫浴5 min,冰浴10 s,短暫離心后加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL、dNTP混合液(10 mmol/L)2 μL、RNA酶抑制劑(20 U/μL)1 μL、AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/μL)2 μL;37 ℃溫浴5 min,42 ℃溫浴60 min,70 ℃溫浴10 min后終止反應(yīng),將上述溶液-20 ℃保存;熒光定量PCR檢測(cè):對(duì)iNOS、β-actin基因(引物序列見(jiàn)表1)表達(dá)進(jìn)行定量分析,PCR反應(yīng)體系為2×SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL、Template(cDNA)7.2 μL、10 μmol/L的FP和RP各0.4 μL,加超純水定容至20 μL;PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min,隨后95 ℃變性7 s,57 ℃退火延伸10 s,共40個(gè)循環(huán)。

表1 目的基因和內(nèi)參基因PCR引物序列Table 1 The PCR primer sequence oftarget genes and reference gene

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)量 參照王佐等[15]的方法,并進(jìn)行適當(dāng)修改。接種細(xì)胞和加入樣品實(shí)驗(yàn)步驟同1.2.7;細(xì)胞總蛋白提取:取出培養(yǎng)皿棄去培養(yǎng)基,DPBS洗3遍,刮下細(xì)胞并離心收集,加入適量細(xì)胞裂解液(含1 mmol/L苯甲基磺酰氟),冰上裂解30 min后,14000×g離心15 min,上清即為抽提到的細(xì)胞總蛋白;蛋白濃度定量:將BCA試劑A與B按50∶1的比例混合,配成BCA工作液;取25 μL適當(dāng)稀釋的樣品到96孔板中,每孔加入200 μL BCA工作液,混勻,37 ℃孵育30 min,酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm處吸光值,根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白濃度;檢測(cè)目的蛋白表達(dá):將抽提蛋白與上樣緩沖液按4∶1的體積比混合,沸水浴10 min,冷卻后按等蛋白量(40 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳(電壓80 V電泳40 min后換電壓110 v電泳150 min),電泳結(jié)束后,將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,用TBST溶液洗膜6次(每次5 min),將PVDF膜置于封閉液中室溫封閉1 h后進(jìn)行一抗(1∶1000)孵育(4 ℃過(guò)夜);洗膜后加入TBST溶液稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000),室溫孵育1.5 h,洗膜后進(jìn)行ECL顯影,用化學(xué)發(fā)光儀掃描并記錄結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.2進(jìn)行差異顯著性分析;采用ABI 7500 system SDS Software 1.4進(jìn)行熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理,以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因轉(zhuǎn)錄的相對(duì)變化;采用FluorChem進(jìn)行蛋白質(zhì)條帶光密度值積分,以β-actin為內(nèi)參蛋白做相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示(n=3)。

2 結(jié)果與分析

2.1不同茶類(lèi)水提取物對(duì)NO自由基的清除作用分析

由圖1可知,六個(gè)不同種類(lèi)茶在15.63～250 μg/mL范圍內(nèi),隨著水提取物濃度增大,其對(duì)NO的清除效果逐漸增強(qiáng)。這與Tsai等研究綠茶與幾種藥用植物對(duì)NO清除作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似[10]。經(jīng)擬合可以計(jì)算得NO清除率IC50值(半數(shù)抑制濃度),其值越低,NO清除效果越好。由表2可知,不同茶類(lèi)對(duì)NO的清除作用存在一定差異,綠茶、白茶、黃茶對(duì)NO的清除作用最強(qiáng),IC50值在99.27～104.83 μg/mL范圍內(nèi),三者無(wú)顯著性差異(p>0.05),其次是烏龍茶(120.06 μg/mL)、黑茶(176.04 μg/mL)、紅茶(214.68 μg/mL)。結(jié)果表明,不同加工工藝生成的茶類(lèi),隨著茶葉發(fā)酵程度加深,NO自由基的清除能力降低。大量研究表明,茶多酚是茶葉中清除自由基的有效成分[16],在加工過(guò)程中,六種茶類(lèi)發(fā)酵程度的差異,使其茶多酚含量發(fā)生變化,進(jìn)而影響NO自由基清除作用。

圖1 六種茶類(lèi)水提取物凍干粉對(duì)NO清除率的影響Fig.1 NO-scavenging effect ofwater extract of six types of tea

2.2不同茶類(lèi)水提取物對(duì)NO產(chǎn)生的影響

圖2 六種茶類(lèi)水提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生量和細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of water extract of six types of tea on NO production and cell viability in LPS-induced RAW264.7 cells注:無(wú)相同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3同。

由圖2可知,在62.5～1000 μg/mL濃度范圍內(nèi),六種茶類(lèi)水提取物處理RAW264.7細(xì)胞24 h后,細(xì)胞存活率均在90%以上。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步測(cè)定六個(gè)不同種類(lèi)茶水提取物對(duì)NO產(chǎn)生量的影響,與空白組相比,LPS單獨(dú)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后,細(xì)胞上清液中NO產(chǎn)生量顯著增加(p<0.05),六個(gè)不同種類(lèi)茶水提取物與LPS共培養(yǎng)可顯著抑制NO的產(chǎn)生,隨著處理濃度增加,NO產(chǎn)生量逐漸降低,呈劑量依賴(lài)關(guān)系。經(jīng)擬合計(jì)算得NO抑制率IC50值,如表2所示,黃茶(398.13 μg/mL)對(duì)NO產(chǎn)生的抑制作用最強(qiáng),綠茶、白茶、烏龍茶次之,IC50值在557.59～584.46 μg/mL范圍內(nèi),三者無(wú)顯著性差異(p>0.05),紅茶(951.27 μg/mL)最弱。Tsai等對(duì)藥用植物和香料研究發(fā)現(xiàn),抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO受三個(gè)方面的綜合影響:阻斷iNOS蛋白表達(dá);抑制iNOS酶活性;清除NO自由基[10,17]。本研究從表2可知,黃茶與綠茶、白茶清除NO自由基的作用無(wú)顯著差異,但抑制NO產(chǎn)生的作用顯著強(qiáng)于二者(p<0.05),其可能在阻斷iNOS蛋白表達(dá)或抑制iNOS酶活性方面作用更強(qiáng)。

表2 六種茶類(lèi)水提取物NO清除率和NO抑制率的IC50值Table 2 The IC50 values of water extract of six types of teafor NO-scavenging and NO-suppressing effect

注:不同茶類(lèi)上標(biāo)示無(wú)相同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表3 六種茶類(lèi)水提取物凍干粉中主要化學(xué)成分的含量(%)Table 3 The percentage of main chemical components in freeze-dried powder of water extract of six types of tea(%)

注:表中數(shù)據(jù)表示各化學(xué)成分含量占茶葉水提取物凍干粉的百分比(%);同一組分上標(biāo)示無(wú)相同字母表示差異顯著(p<0.05)。

表4 六種茶類(lèi)水提取物中主要理化成分含量與NO清除率IC50值、NO抑制率IC50值、TNF-α及IL-6產(chǎn)生量的相關(guān)性分析Table 4 The correlation analysis between main chemical components in tea extract and the IC50 values ofNO-scavenging and NO-suppressing effect,TNF-α and IL-6 production

注:*p<0.05,***p<0.001。

2.3不同茶類(lèi)水提取物對(duì)TNF-α和IL-6釋放的影響

炎癥的病理過(guò)程除與NO相關(guān)外,巨噬細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生促炎癥因子TNF-α和IL-6,引起T淋巴細(xì)胞的增殖和激活,進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),造成組織損傷[18]。因此,TNF-α和IL-6的釋放也是炎癥發(fā)生的重要標(biāo)志。從圖3可知,與空白組相比,LPS單獨(dú)處理RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6產(chǎn)生量顯著增加(p<0.05)。與LPS單獨(dú)處理組相比,六種茶類(lèi)水提取物在500 μg/mL濃度時(shí),均能顯著抑制IL-6釋放,而對(duì)于TNF-α,綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶可顯著抑制TNF-α釋放,黑茶和紅茶則無(wú)抑制作用。其中黃茶對(duì)TNF-α和IL-6的抑制效果最強(qiáng),抑制率分別為69.25%,87.68%。

圖3 六種茶類(lèi)水提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的影響Fig.3 Effects of water extract of six types of tea on TNF-αand IL-6 production in LPS-induced RAW 264.7 cells

2.4不同茶類(lèi)水提取物凍干粉主要化學(xué)組成及相關(guān)性分析

本研究綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、黑茶、紅茶水提取物凍干粉得率(占茶葉干重百分比)依次為40.8%、39.5%、37.1%、33.6%、29.6%、32.8%,茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖及咖啡堿含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。

從表3可知,本研究六種茶類(lèi)水提取物的主要理化成分含量存在差異,但均以茶多酚含量最高(19.65%～35.03%),不同茶類(lèi)茶多酚含量大小依次是:綠茶>黃茶>白茶>烏龍茶>黑茶>紅茶,這既與品種的遺傳基礎(chǔ)有關(guān),也與不同茶類(lèi)加工過(guò)程中多酚類(lèi)等物質(zhì)的氧化、水解等生化變化相關(guān)。趙洋等[19]連續(xù)兩年分析22個(gè)茶樹(shù)品種的生化成分,結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶多酚含量品種間差異顯著。周瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn),茶多酚含量隨著茶葉發(fā)酵程度的加深而減少,主要是由于茶葉在發(fā)酵過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生氧化。綠茶屬于未發(fā)酵茶,烏龍茶屬于半發(fā)酵茶,白茶和黃茶的發(fā)酵程度介于綠茶和烏龍茶之間,黑茶(后發(fā)酵)和紅茶(全發(fā)酵)的發(fā)酵程度大于烏龍茶。游離氨基酸以白茶中的含量最高(13.52%),黑茶最低(2.15%)。六種茶類(lèi)水提取物可溶性糖含量為5.97%～7.42%,咖啡堿含量為6.02%～10.82%。在理化組分分析基礎(chǔ)上,與六種茶類(lèi)的抗炎功能活性進(jìn)行相關(guān)性分析。

本研究相關(guān)性分析表明,茶多酚含量與清除NO的IC50值、抑制細(xì)胞產(chǎn)生NO的IC50值、TNF-α以及IL-6產(chǎn)生量均呈顯著負(fù)相關(guān)(p<0.001),相關(guān)系數(shù)分別為-0.9824、-0.8586、-0.8781、-0.8979(表4),表明茶多酚很可能是影響不同茶類(lèi)發(fā)揮抗炎活性的主要功能性成分。Paquay等研究表明,綠茶和紅茶多酚均可有效清除NO自由基[8]。Lin等研究發(fā)現(xiàn),綠茶、烏龍茶以及紅茶抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7產(chǎn)生NO是由于多種酚類(lèi)物質(zhì)的相互結(jié)合,而不僅僅是兒茶素,指出茶多酚可能是抑制NO產(chǎn)生的主要活性成分[9]。Ho等研究表明,龍眼花提取物抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO是由于多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、原花青素類(lèi)等共同作用的結(jié)果,而不僅僅是單一的酚類(lèi)物質(zhì)[21]。另外,研究表明,茶多酚[22]、咖啡堿[23]均可在基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上,抑制促炎癥因子TNF-α和IL-6的產(chǎn)生,相比于咖啡堿,茶多酚的抑制效果較好[24]。

2.5黃茶水提取物對(duì)iNOS基因轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)的影響

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,黃茶對(duì)NO自由基的清除作用與白茶和綠茶無(wú)顯著差異,而在細(xì)胞水平上,相比于其他茶類(lèi),黃茶的抗炎效果最強(qiáng),因此,選取黃茶為代表,進(jìn)一步對(duì)RAW264.7細(xì)胞中調(diào)控NO產(chǎn)生的iNOS基因表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 黃茶水提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)iNOS mRNA的影響Fig.4 Effect of water extract of yellow tea a on iNOSmRNA expression in LPS-induced RAW264.7 cells注:##(p<0.01)表示與空白組差異顯著;**(p<0.01)表示與LPS誘導(dǎo)組差異顯著。

由圖4、圖5可知,相比于空白組,LPS單獨(dú)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA和iNOS蛋白表達(dá)量極顯著上調(diào)(p<0.01)。在62.5、125、250 μg/mL濃度范圍內(nèi),黃茶水提取物處理組iNOS mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)組的21%、19%、11%,即黃茶水提取物處理極顯著下調(diào)iNOS mRNA表達(dá)(p<0.01);黃茶水提取物處理組iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為L(zhǎng)PS誘導(dǎo)組的73%、48%、32%,即黃茶水提取物處理顯著降低iNOS蛋白表達(dá)水平(p<0.05)。核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)是細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,在炎癥病理過(guò)程,NF-κB信號(hào)途徑的激活會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥因子,如NO、TNF-α、IL-6等,促炎癥因子又會(huì)進(jìn)一步活化NF-κB,導(dǎo)致惡性循環(huán),從而加劇炎癥反應(yīng),因此,大量抗炎藥物以NF-κB為作用靶點(diǎn)[23,25]。研究表明,茶葉中咖啡堿[23]、茶多酚[24]均可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)途徑的激活,下調(diào)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)iNOS mRNA和iNOS蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明,黃茶可通過(guò)下調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞中iNOS mRNA轉(zhuǎn)錄水平,從而抑制iNOS蛋白表達(dá),可能主要是黃茶中茶多酚與咖啡堿共同作用的結(jié)果。

圖5 黃茶水提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞表達(dá)iNOS蛋白的影響Fig.5 Effect of water extract of yellow tea a on iNOS proteinexpression in LPS-induced RAW264.7 cells注:##(p<0.01)表示與空白組差異顯著;*(p<0.05)和**(p<0.01)表示與LPS誘導(dǎo)組差異顯著。

3 結(jié)論

由于品種及制茶工藝不同,六種茶類(lèi)的化學(xué)組成存在差異,但均可有效清除NO自由基,其中綠茶、白茶、黃茶對(duì)NO的清除能力較強(qiáng),IC50值在99.27～104.83 μg/mL范圍內(nèi),三者無(wú)顯著性差異,其次是烏龍茶、黑茶、紅茶。

相比于其他茶類(lèi),黃茶對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α以及IL-6的抑制作用最強(qiáng),NO抑制率IC50值為398.13 μg/mL,處理濃度為500 μg/mL時(shí),黃茶對(duì)TNF-α和IL-6的抑制率分別為69.25%,87.68%。

相關(guān)性分析結(jié)果表明,茶多酚含量與NO自由基清除率IC50值、NO產(chǎn)生抑制率IC50值、TNF-α以及IL-6產(chǎn)生量呈顯著負(fù)相關(guān)性(p<0.001),表明茶多酚很可能是影響不同茶類(lèi)發(fā)揮抗炎活性的主要成分。

在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞模型中,黃茶可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平通過(guò)下調(diào)iNOS基因的表達(dá),從而抑制NO的產(chǎn)生。

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Anti-inflammatoryactivitiesofsixtypesofteainLPS-inducedRAW264.7cells

LIXiao-fei,GAOXiong,LINXiao-rong,ZHANGYuan-yuan,LIBin*,CHENZhong-zheng*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China)

According to the classical processing technology,tea can be categorised into six types:green tea,white tea,yellow tea,oolong tea,puer tea,black tea. This study aimed to investigate anti-inflammatory property of six types of tea,including Yunnan Daye(green tea,black tea,and puer tea),Fuding Dabai(white tea),Junshan Yinzhen(yellow tea),and Jin Guanyin(oolong tea). Nitric oxide(NO)-scavenging assay and LPS-induced RAW264.7 cells model were used to assess the anti-inflammatory activity of water extract of six types of tea. The results showed that,among six types of tea,green,white,and yellow tea displayed stronger NO-scavenging capacity with IC50values ranging from 99.27 to 104.83 μg/mL.Compared with other five types of tea,yellow tea exhibited significant anti-inflammatory activity against LPS-induced RAW264.7 cells. The IC50values of yellow tea for NO-suppressing effect was 398.13 μg/mL,and the inhibition rate for tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6)reached 69.25% and 87.68%,respectively,at a concentration of 500 μg/mL. Compared with LPS-induced group,treatment with water extract of yellow tea significantly down-regulated the expression of iNOS mRNA and decreased iNOS protein level. Correlation analysis showed that the content of tea polyphenols had a significant negative correlation with the IC50values of NO-scavenging and NO-suppressing,TNF-αand IL-6 productions. In conclusion,all six types of tea possessed anti-inflammatory property. Among six types of tea,yellow tea exerted the strongest inhibitory effect on production of pro-inflammatory mediators(NO,TNF-α,and IL-6),and could reduce NO production through down-regulating the expression of iNOS both in transcriptional and translational level.

six types of tea;RAW264.7 cell;anti-inflammatory activity;inflammatory mediators

TS201.1

A

1002-0306(2017)19-0067-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.013

2017-03-29

李曉飛(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：15622107307@163.com。

*通訊作者:陳忠正(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：zhongzhengch@scau.edu.cn。

李斌(1960-)，女，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)，E-mail：bli@scau.edu.cn。

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金(CARS-23)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012A020602040)。