分散固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定飼料中低聚果糖含量

潘 城

(國(guó)家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建福州 350002)

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖規(guī)?；潭鹊牟粩嗵岣吆图s化養(yǎng)殖模式的推廣，動(dòng)物疫病防控的難度越來(lái)越大。低聚果糖作為抗生素替代物，在動(dòng)物飼料中添加能顯著提高飼料利用率，促進(jìn)雞、豬、魚(yú)增重，增強(qiáng)其腸道有益菌增殖能力從而提高成活率，具有高效、安全、健康且綠色等特點(diǎn)[1]。本文作者曾發(fā)表過(guò)飼料添加劑中低聚果糖的檢測(cè)[2]，但飼料添加劑基質(zhì)相比飼料樣品簡(jiǎn)單不少，對(duì)前處理要求不高。而飼料基質(zhì)成分復(fù)雜，往往含有脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物、甾醇、金屬離子、色素等干擾物，同時(shí)飼料中添加低聚果糖含量都較低，前處理操作過(guò)于簡(jiǎn)單，不僅會(huì)污染色譜柱乃至過(guò)快報(bào)廢，而且影響測(cè)定準(zhǔn)確性。分散固相萃取法(Dispersive Solid-phase Extraction,DSPE)具有簡(jiǎn)便、快速和廉價(jià)的特點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品中多農(nóng)藥殘留和獸藥殘留檢測(cè)[3 - 8]，但在飼料中應(yīng)用較少[9 - 10]，而其應(yīng)用于低聚果糖的檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。本文采用DSPE凈化，結(jié)合高效液相色譜(HPLC)，建立了飼料中蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖四種低聚果糖的檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)便快捷，適用于飼料中低聚果糖的日常檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)，Waters公司)，配2414示差折光檢測(cè)器；DS-8510超聲波發(fā)生器(上海生析超聲儀器有限公司)；Milli Q超純水制備器(美國(guó)，Milipor公司)；分析天平(賽多利斯北京有限公司)；Avanti J-E冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)，貝克曼公司)。

低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品：蔗果三糖(純度≥99.0%)、蔗果四糖(純度≥99.0%)和蔗果五糖(純度≥80.0%)，均購(gòu)于日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。蔗果六糖(純度≥92.1%)購(gòu)于北京振翔科技公司。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取低聚果糖標(biāo)準(zhǔn)品各200 mg，用50%乙腈溶解并定容至10 mL，配制成濃度為20 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。采用逐級(jí)稀釋的方法配制濃度從0.1～5.0 mg/mL之間的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均置于冰箱中0～4 ℃下保存。乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，其它試劑為分析純。乙二胺基-N-丙基(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、佛洛里硅土填料購(gòu)于安捷倫科技有限公司；Sepax GP-C18填料(40～60 μm,120 ?)購(gòu)于美國(guó)賽分科技有限公司。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)取飼料樣品10 g(精確至0.01 g)于100 mL的具塞三角瓶，加入70 mL 50%乙腈溶液，置于超聲波振蕩器中超聲提取30 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度并混勻，4 000 r/min下離心5 min，取上清液2 mL，加入20 μL甲酸酸化后，加入100 mg的PSA和100 mg 的GCB作為復(fù)合吸附劑，渦旋混合1 min，15 000 r/min下離心5 min，取上清液以0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，濾液供分析用。

1.3 色譜條件

色譜柱：XB-NH2柱(250×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Welch公司)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：乙腈∶水=65∶35(V/V)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

圖1 低聚果糖在不同色譜柱和不同比例流動(dòng)相下分離效果比較Fig.1 Comparison of different columns and mobile phases for separation of fructooligosaccharides 1.fructose;2.glucose;3.sucrose;4.maltose;5.lactose;6.1-kestose;7.nystose;8.1F-fructofuranosylnystose;9.fructo-oligosaccharide;A.Sugar-Ca column with water as mobile phase;B.XB-NH2 column with acetonitrile-water=55∶45 as mobile phases;C.XB-NH2 column with acetonitrile-water=65∶35 as mobile phases.

實(shí)驗(yàn)比較了Xtimate Sugar-Ca型陽(yáng)離子柱及XB-NH2柱這2種色譜柱對(duì)低聚果糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的分離效果(圖1)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4種低聚果糖以及其它糖類(lèi)物質(zhì)在鈣型陽(yáng)離子柱上無(wú)法有效分離(圖1A)，而在氨基柱上能取得較好的分離效果(圖1C)。本文同時(shí)考察了乙腈-水體系作為流動(dòng)相的比例分別為55∶45、65∶35(V/V)進(jìn)行等度洗脫時(shí)目標(biāo)物的分離效果。結(jié)果表明，在乙腈∶水=55∶45(V/V)流動(dòng)相體系下，分離效果欠佳(圖1B)，蔗果三糖和乳糖等物質(zhì)無(wú)法分離，而在乙腈∶水=65∶35(V/V)流動(dòng)相體系下，4種低聚果糖以及果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖均達(dá)到基線分離(圖1C)，同時(shí)由于氨基柱最佳使用條件為水相比例小于40%，長(zhǎng)時(shí)間多頻率使用40%和以上比例水相容易造成氨基柱鍵合相水解乃至報(bào)廢，因而選擇乙腈∶水=65∶35(V/V)體系作為流動(dòng)相。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1提取體系的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)比較了純水、50%的乙腈以及80%的乙腈超聲萃取效果。經(jīng)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)研究，超聲30 min以上,純水和50%的乙腈提取體系下低聚果糖的加標(biāo)回收率均可達(dá)95%以上，而80%乙腈溶液提取的回收率低于65%。飼料基質(zhì)復(fù)雜，往往含有蛋白質(zhì)，添加一定比例的乙腈能夠很好的沉淀飼料蛋白，同時(shí)由于50%的乙腈提取體系與流動(dòng)相體系相近，能夠較大程度的降低溶劑效應(yīng)的影響，因而選擇50%的乙腈作為提取溶劑。

2.2.2吸附劑的選擇由于氨基色譜柱的pH使用范圍為2～8，本文試驗(yàn)了PSA、C18、GCB、佛羅里硅土4種吸附劑在中性和酸性條件下的凈化性能及對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明：4種吸附劑在中性條件下均無(wú)良好吸附雜質(zhì)或低聚果糖目標(biāo)物的性能，而在酸性條件下4種吸附劑表現(xiàn)出不同程度吸附樣品雜質(zhì)的特性，同時(shí)不吸附低聚果糖目標(biāo)物。相比較而言，飼料基質(zhì)中的主要干擾物為脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物、甾醇等極性干擾物以及金屬離子，在酸性條件下PSA兼具極性吸附作用和弱陰離子交換作用，可以通過(guò)弱陰離子交換或極性吸附達(dá)到保留作用去除。同時(shí)飼料中經(jīng)常含有色素干擾物，GCB具有良好的去除色素的性能。因此本文選擇PSA和GCB作為復(fù)合吸附劑進(jìn)行凈化。

2.2.3樣品酸度對(duì)凈化效果的影響取2 mL飼料加標(biāo)樣品上清液，分別加入2、5、10、20、30、50 μL的甲酸調(diào)節(jié)酸度，再分別加入100 mg的PSA和GCB吸附劑渦旋混合5 min，離心后上機(jī)分離分析。結(jié)果表明，添加20 μL的甲酸能夠得到較好的凈化效果，更高的酸度不利于色譜柱的使用，因此實(shí)驗(yàn)選擇樣品中加入20 μL的甲酸。

圖2 配合飼料空白基質(zhì)加標(biāo)樣品凈化前(A)后(B)效果對(duì)比圖Fig.2 Comparison of the spiked swine feeds before (A) and after (B) purification 1.1-kestose;2.nystose;3.1F-fructofuranosylnystose;4.fructo-oligosaccharide.

2.2.4吸附劑用量對(duì)凈化效果的影響考察了不同PSA和GCB用量(30、50、100、200、500 mg)條件下的凈化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所有用量條件下，兩種吸附劑均不吸附低聚果糖目標(biāo)物，100 mg吸附劑用量下，PSA凈化效果不明顯，100 mg吸附劑用量上，干擾得到較大程度的去除，同時(shí)所有PSA用量條件下，溶液顏色均較未凈化溶液沒(méi)有顯著變化；當(dāng)石墨化碳黑在100 mg用量以下時(shí)，凈化液顏色相比未凈化液變化不顯著，說(shuō)明色素等雜質(zhì)無(wú)法完全去除，當(dāng)GCB在100 mg用量以上時(shí)，凈化液完全澄清透明。因此本文同時(shí)選擇100 mg的PSA和100 mg的GCB作為復(fù)合吸附劑。圖2為飼料空白基質(zhì)加標(biāo)樣品凈化前后效果對(duì)比圖。

2.3 線性方程、線性關(guān)系、檢出限及定量限

配制各濃度為0.1～5.0 mg/mL之間的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積(y)對(duì)濃度(x)進(jìn)行線性回歸，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見(jiàn)表1。結(jié)果表明，蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖和蔗果六糖在0.1～5.0 mg/mL內(nèi)具有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2不小于0.9997。以3倍信噪比(S/N=3)為檢出限，如表1所示，各低聚果糖的檢出限不高于0.069 mg/g，完全能滿足測(cè)定要求。

表1 低聚果糖的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equations， correlation coefficients(R2)， linear ranges and detection limits of fructooligosaccharides

2.4 回收率和精密度

在優(yōu)化后測(cè)試條件下，取飼料空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測(cè)試，加標(biāo)水平分別為5 mg/g、10 mg/g、20 mg/g，每個(gè)水平重復(fù)分析6次，結(jié)果見(jiàn)表2。從表2中可知，該方法的加標(biāo)回收率為89.9%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～4.7%。結(jié)果表明該方法適用于飼料中低聚果糖的日常分析檢測(cè)。

表2 不同樣品中低聚果糖的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations( RSDs) of fructooligosaccharides in different samples( n=6)

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文建立的分析方法對(duì)市售的20個(gè)批次不同基質(zhì)的飼料樣品進(jìn)行分析，共檢出5個(gè)陽(yáng)性樣品，低聚果糖含量為1.5～21.3 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法快速、準(zhǔn)確、可靠，可應(yīng)用于實(shí)際大批量樣品的快速分析。

3 結(jié)論

本文采用分散固相萃取法結(jié)合高效液相色譜-示差折光檢測(cè)器，建立了飼料中低聚果糖含量的測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，適用于飼料樣品中低聚果糖含量的測(cè)定。