檸檬酸與維多利亞藍(lán)B的吸收光譜及應(yīng)用

洪 歆, 何婷婷, 龐向東, 江 虹

(長(zhǎng)江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，武陵山片區(qū)綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 408100)

檸檬酸又名枸櫞酸,它是一種廣泛存在于水果中的有機(jī)酸，在食品、醫(yī)藥及日用化工等行業(yè)中廣泛應(yīng)用。檸檬含有大量的檸檬酸及多種人體所需的維生素及微量元素，是世界上最有藥用價(jià)值的水果之一。檸檬酸可增強(qiáng)人體內(nèi)的正常代謝，與Ca2+結(jié)合生成可溶性絡(luò)合物，具有預(yù)防和治療高血壓和心肌梗死的作用，還可促進(jìn)脂肪分解，實(shí)現(xiàn)快速減肥。檸檬酸對(duì)人體無(wú)直接危害，但它可促進(jìn)人體內(nèi)鈣的排泄和沉積，如果長(zhǎng)期食用含檸檬酸的食品，可能會(huì)導(dǎo)致低鈣血癥，增加患十二指腸癌的幾率，兒童會(huì)表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定、易興奮、植物神經(jīng)紊亂，成人會(huì)出現(xiàn)手足抽搐、肌肉痙攣，感覺(jué)異常，瘙癢及消化道癥狀等?；跈幟仕釋?duì)人體的價(jià)值及對(duì)鈣的代謝產(chǎn)生的不良影響，研究檸檬酸的快速檢測(cè)方法有一定意義。

目前，測(cè)定檸檬酸的方法主要有：高效液相色譜法[1 - 4]、氣相色譜法[5]、離子色譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、電化學(xué)法[9]和分光光度法[10 - 11]等。高效液相色譜法前處理麻煩、費(fèi)時(shí)，儀器價(jià)格偏貴，不易普及。氣相色譜法雖然快速，但樣品的前處理麻煩、費(fèi)時(shí)。離子色譜法雖能很好地測(cè)定有機(jī)酸，但因淋洗液和柱子填料的特殊性，對(duì)樣品中的含量有嚴(yán)格限定，條件苛刻。電化學(xué)法靈敏度較低，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較差。分光光度法儀器價(jià)廉，操作簡(jiǎn)便，長(zhǎng)期以來(lái)受到人們的廣泛應(yīng)用。目前，用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定檸檬酸的報(bào)道并不多，已報(bào)道的方法[10 - 11]，要么靈敏度低，要么線性范圍窄。因此，進(jìn)一步探索靈敏度高、選擇性好，線性范圍寬的測(cè)定檸檬酸的可見(jiàn)分光光度法有一定意義。本工作以維多利亞藍(lán)B作探針，研究了可見(jiàn)光區(qū)正吸收法、負(fù)吸收法及雙波長(zhǎng)法測(cè)定檸檬酸的適宜條件。建立的方法用于新鮮檸檬中檸檬酸的測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

U-3010紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本，日立公司)；pHS-3C精密酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)。

檸檬酸(CTA，重慶藥檢所提供)標(biāo)準(zhǔn)溶液：192.1 mg/L貯備液，冰箱4 ℃保存，用時(shí)稀釋10倍。維多利亞藍(lán)B(VITO)溶液：1.0×10-3mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：用0.10 mol/L HCl和0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計(jì)測(cè)定，配成pH=3.0～9.5的系列緩沖溶液。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸鎦水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

于10 mL具塞比色管中，準(zhǔn)確加入適量的19.21 mg/L檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，再加入1.0 mL pH=9.02的Tris-HCl緩沖溶液和2.0 mL 1.0×10-3mol/L維多利亞藍(lán)B溶液，用水定容，搖勻，35 min后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上，用1.0 cm比色皿，以試劑空白作參比，掃描吸收光譜，于最大正吸收和負(fù)吸收波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度，再以最大負(fù)吸收波長(zhǎng)為參比波長(zhǎng)，最大正吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)定溶液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬酸-維多利亞藍(lán)B的吸收光譜特征

圖1 吸收光譜Fig.1 The absorption spectra 1.CTA(1.92 mg/L);2.VITO(2.0×10-4 mol/L);1-2.against water;3-7.CTA(0.384,1.15,1.92,2.31,2.69 mg/L)-VITO(2.0×10-4 mol/L),against reagent blank;pH=9.02.

圖1表明，在可見(jiàn)光區(qū)，檸檬酸幾乎無(wú)吸收(曲線1)；而維多利亞藍(lán)B有較強(qiáng)吸收(曲線2)，λmax=510 nm；當(dāng)在pH=9.02的檸檬酸溶液中加入維多利亞藍(lán)B的溶液后，吸收曲線上出現(xiàn)一個(gè)明顯的正吸收峰和一個(gè)明顯的負(fù)吸收峰，最大正吸收波長(zhǎng)位于632 nm，紅移122 nm；最大負(fù)吸收波長(zhǎng)位于428 nm，紫移82 nm，可以判斷檸檬酸與維多利亞藍(lán)B的反應(yīng)確實(shí)生成了新物質(zhì)。在632 nm和428 nm波長(zhǎng)處，新物質(zhì)的吸光度絕對(duì)值與檸檬酸在一定濃度范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，并服從比爾定律。當(dāng)采用雙波長(zhǎng)法(以428 nm作參比波長(zhǎng)，632 nm作測(cè)定波長(zhǎng))測(cè)定時(shí)，新物質(zhì)的吸光度與一定濃度范圍的檸檬酸的質(zhì)量濃度仍服從比爾定律。故可見(jiàn)光區(qū)的正吸收法、負(fù)吸收法及雙波長(zhǎng)法均能用于檸檬酸的定量分析，并有較高靈敏度。

反應(yīng)機(jī)理：維多利亞藍(lán)B是一種三苯甲烷類的堿性染料，而檸檬酸是一種較強(qiáng)的有機(jī)酸，它的分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)可離解的H+，離解后變成陰離子，于是維多利亞藍(lán)B與CTA以靜電引力結(jié)合生成離子締合物。

2.2 溶液pH值的影響

室溫下，考察了不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，檸檬酸與維多利亞藍(lán)B反應(yīng)的適宜酸度范圍是pH=8.5～9.5，此范圍內(nèi)體系在最大正吸收和最大負(fù)吸收波長(zhǎng)處的吸光度絕對(duì)值(|A|)較大，靈敏度相對(duì)較高。實(shí)驗(yàn)用pH=9.02的Tris-HCl緩沖溶液，適宜用量為1.0 mL。

2.3 顯色劑濃度的影響

室溫下，考察了不同濃度的維多利亞藍(lán)B溶液對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，檸檬酸與維多利亞藍(lán)B反應(yīng)，適宜的維多利亞藍(lán)B溶液的濃度范圍是(1.8～2.5)×10-4mol/L，在此范圍內(nèi)，體系在最大正、負(fù)吸收波長(zhǎng)處的|A|可達(dá)最大且穩(wěn)定。當(dāng)維多利亞藍(lán)B濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，都將導(dǎo)致體系在最大正、負(fù)吸收波長(zhǎng)處的|A|降低，從而使體系靈敏度降低。降低原因：當(dāng)顯色劑濃度過(guò)低時(shí)，檸檬酸與維多利亞藍(lán)B的結(jié)合反應(yīng)不完全，導(dǎo)致體系|A|降低；當(dāng)顯色劑濃度過(guò)大時(shí)，由于自身的聚集作用會(huì)影響到締合物的生成，從而使體系的|A|降低。實(shí)驗(yàn)用1.0×10-3mol/L維多利亞藍(lán)B溶液，適宜用量為2.0 mL。

2.4 試劑加入順序

室溫下，考察了檸檬酸、維多利亞藍(lán)B及Tris-HCl溶液在不同加入順序時(shí)對(duì)締合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，按任意順序加入各試劑，體系的吸光度值基本不變，對(duì)體系的靈敏度基本無(wú)影響。故實(shí)驗(yàn)時(shí)，按任意順序加入各試劑溶液均可。

2.5 反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

室溫下，考察了不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)締合反應(yīng)及締合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：檸檬酸與維多利亞藍(lán)B的結(jié)合反應(yīng)在35 min內(nèi)才能反應(yīng)完全，其穩(wěn)定時(shí)間至少1.5 h。實(shí)驗(yàn)選在35 min后測(cè)定。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Calibration curve

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按實(shí)驗(yàn)方法配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液并掃描吸收光譜，作A-c標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。該方法的一元線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及表觀摩爾吸光系數(shù)見(jiàn)表1。

2.7 方法的選擇性

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 1 Related parameters of calibrations curves

3 分析應(yīng)用

3.1 樣品溶液的制備

分別取1#～3#新鮮檸檬(重慶區(qū)域內(nèi)不同地點(diǎn)的3種新鮮檸檬)多個(gè)，去皮，去核，將果肉榨汁后攪勻。準(zhǔn)確稱取1#檸檬汁10.5672 g，2#檸檬汁10.6634 g，3#檸檬汁10.3129 g，過(guò)濾，將濾液分別置于1000 mL容量瓶中，用水定容。取上述各定容液10 mL分別置于100 mL容量瓶中，用水定容，搖勻，即為各待測(cè)液。

3.2 樣品溶液的測(cè)定

取上述各待測(cè)樣液1.0 mL，分別按1.2節(jié)實(shí)驗(yàn)方法配制溶液，以正吸收法為代表，在632 nm處測(cè)定各待樣液中檸檬酸的含量，各平行測(cè)定6份，推出原始樣液中檸檬酸的含量。通過(guò)加標(biāo)回收試驗(yàn)(n=6)，從回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差判斷該方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品分析結(jié)果及回收試驗(yàn)Table 2 Analytical results and recovery tests of samples(n=6)

4 結(jié)論

在堿性溶液中，用維多利亞藍(lán)B作探針的正吸收、負(fù)吸收及雙波長(zhǎng)疊加分光光度法均可用于新鮮檸檬中檸檬酸的快速測(cè)定。方法簡(jiǎn)便易行，試劑價(jià)廉易得，樣品處理簡(jiǎn)單、安全，有較高的準(zhǔn)確度和精密度，較寬的線性范圍，選擇性良好，靈敏度能滿足分析要求。