Eu3+熒光探針構(gòu)建及對(duì)牛奶中鹽酸四環(huán)素殘留的測(cè)定

高文慧, 王兆群, 張 勇， 泮俊青, 尹洪宗

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安 271018)

四環(huán)素是一類(lèi)常見(jiàn)抗生素，因?qū)Ω锾m氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、肺炎球菌、立克次體、病毒等多種菌類(lèi)都具有廣譜抗菌作用，在畜牧業(yè)廣受推廣。其中，鹽酸四環(huán)素是四環(huán)素族中應(yīng)用最廣的抗生素。近年來(lái)因其濫用導(dǎo)致動(dòng)物源食品抗生素殘留超標(biāo)，進(jìn)而引起食品安全問(wèn)題，危害人體健康。研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素可以引起非酒精性脂肪炎，肝臟毒素累積，影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育[1 - 3]。為此，國(guó)際衛(wèi)生組織和我國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定四環(huán)素在牛奶中的最大殘留限量為100 μg/L[4]。目前檢測(cè)鹽酸四環(huán)素的方法主要有：高效液相色譜法[5 - 6]、酶聯(lián)免疫法[7 - 8]、熒光法[9]、傳感器法[10]、表面等離子體共振法[11]等方法。

熒光探針技術(shù)自興起就被研究者廣泛關(guān)注[12]。其中稀土Eu3+的f-f躍遷能級(jí)間隔在可見(jiàn)光區(qū)且熒光強(qiáng)度大，單色性好，因此以其作為熒光中心的配合物受到了極大重視和廣泛應(yīng)用，如：苗延虹[13]以Eu3+為熒光探針測(cè)定痕量環(huán)丙沙星，線(xiàn)性范圍為2.5×10-7～9.8×10-5mol/L，檢測(cè)限為1.9×10-7mol/L；李普明等[14]以Eu3+土霉素作為熒光探針測(cè)定膽紅素，線(xiàn)性范圍為5.0×10-7～3.0×10-5mol/L，檢測(cè)限為7.7×10-8mol/L；謝冬冬等[15]以Eu3+-鄰苯二甲酸二丙烯酯為熒光探針測(cè)定水中痕量甲萘威，線(xiàn)性范圍為6.3×10-8～2.5×10-6mol/L，檢測(cè)限為9.6×10-9mol/L。

本文構(gòu)建了Eu3+-苯甲酸(BA)-鄰菲啰啉(Phen)熒光探針，并建立了檢測(cè)牛奶中鹽酸四環(huán)素殘留的新方法。建立的方法具有成本低，檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)單，回收率高，選擇性好，靈敏度較好等優(yōu)點(diǎn)。成功將該熒光探針應(yīng)用于鹽酸四環(huán)素的檢測(cè)，為牛奶中的四環(huán)素類(lèi)抗生素的殘留檢測(cè)建立了新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC型熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司)；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī))；HJ-3數(shù)碼恒溫磁力攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

Eu2O3(分析純，上海晶純?cè)噭┯邢薰?；苯甲酸(BA)(分析純，南京中山集團(tuán)公司化工廠)；鄰菲啰啉(Phen)(分析純，上海前進(jìn)試劑廠)；鹽酸四環(huán)素(TC，阿拉丁化學(xué)公司)；土霉素、紅霉素(上海晶純?cè)噭┯邢薰?；三氯乙酸(分析純，上海山浦化工有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)所用水為二次蒸餾水。

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1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1溶液配制Eu3+標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0×10-2mol/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3519 g Eu2O3于小燒杯中，加入少量HCl，在通風(fēng)櫥中用電熱套加熱使其溶解，并揮發(fā)至近干，然后用無(wú)水乙醇定容至100 mL，作為儲(chǔ)備液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋。BA、Phen、十二烷基磺酸鈉(SDS)、曲拉通X-100(TX-100)、十六烷基三甲基溴化胺(CTMAB)，均用無(wú)水乙醇配制成1.0×10-2mol/L儲(chǔ)備液。300 g/L三氯乙酸溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取15.0000 g三氯乙酸于小燒杯中，加入無(wú)水乙醇溶解，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用無(wú)水乙醇定容。鹽酸四環(huán)素(TC)用無(wú)水乙醇配制成1.0×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)?～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2Eu3+熒光探針構(gòu)建取4個(gè)50 mL的容量瓶，分別依次加入Eu3+、BA、Phen、TC溶液各5 mL，并用無(wú)水乙醇定容。靜置20 min后，分別測(cè)定各溶液的熒光光譜(熒光池規(guī)格為1 cm，狹縫為5 nm)。根據(jù)以上步驟分別測(cè)定Eu3+-BA、Eu3+-Phen、Eu3+-TC、Eu3+-BA-Phen-TC、Eu3+-Phen-TC、Eu3+-BA-TC、BA-Phen-TC、Phen-TC 8個(gè)體系的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖1中的曲線(xiàn)1為Eu3+-BA體系的熒光發(fā)射光譜。由圖可以看出Eu3+在615 nm左右熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，為Eu3+的特征發(fā)射波長(zhǎng)，歸屬于Eu3+的5D0→7F2能級(jí)間的躍遷，屬于電偶極躍遷。以243 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，分別測(cè)定Eu3+、BA、TC、Eu3+-TC、TC-BA、Phen、Eu3+-Phen和BA-Phen等體系的熒光光譜。在615 nm處均沒(méi)有發(fā)射峰。單純的Eu3+發(fā)射峰也很弱，幾乎可以忽略。當(dāng)存在第一配體BA時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增加，這說(shuō)明Eu3+與BA可以發(fā)生配位，兩者形成二元配合物。鑭系離子具有較多的配位數(shù)，乙醇分子能夠進(jìn)入離子的配位空間中，大大降低了發(fā)光強(qiáng)度。加入配體后形成二元配合物，可將乙醇分子從配位環(huán)境中置換出來(lái)，降低了乙醇分子中O-H鍵振動(dòng)引起的非輻射能量損失，從而提高溶液中鑭系有機(jī)配合物的發(fā)光效率。由曲線(xiàn)3可以看出，加入第二配體Phen后，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，這是由于Phen的加入使其形成三元配合物。同時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)由243 nm變?yōu)?97 nm,這都是由于具有較大共軛平面結(jié)構(gòu)的第二配體Phen參與配位的結(jié)果。一般的講，三元配合物的熒光強(qiáng)度大于二元配合物的熒光強(qiáng)度，這種效應(yīng)稱(chēng)之為第二配體的協(xié)同效應(yīng)。由曲線(xiàn)2可以看出，TC使Eu3+位于615 nm處的特征峰減弱，表明TC對(duì)Eu3+-BA-Phen熒光探針具有猝滅作用。因此可以用Eu3+-BA-Phen熒光探針檢測(cè)TC。

2.2 對(duì)Eu3+-BA-Phen熒光探針體系實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1第一配體的影響Eu3+和BA的配比對(duì)Eu3+-BA體系的熒光強(qiáng)度有很大的影響。如圖2所示。固定Eu3+的濃度為1.0×10-4mol/L，隨著B(niǎo)A濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)BA的濃度達(dá)到2.0×10-4mol/L時(shí)，即Eu3+∶BA=1∶2時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大。

圖1 不同體系的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of different systems 1:Eu3+-BA；2:Eu3+-BA-Phen-TC；3:Eu3+-BA-Phen.

圖2 Eu3+-BA體系的熒光強(qiáng)度與Eu3+-BA不同配比的關(guān)系Fig.2 The relationship of fluorescence intensity of Eu3+-BA system and different ratio of Eu3+-BA [Eu3+]=1.0×10-4 mol/L;λex/λem=243/615 nm.

2.2.2第二配體的影響按BA的不同濃度1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4mol/L分為三組，確定Eu3+-BA-Phen體系的最佳濃度配比。如圖3所示，當(dāng)BA的濃度為1.5×10-4mol/L時(shí)，體系熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。當(dāng)Eu3+和BA的濃度一定時(shí)，隨著Phen濃度的增加，體系的熒光強(qiáng)度先增大后減小，當(dāng)Phen濃度達(dá)到2.0×10-4mol/L時(shí)熒光強(qiáng)度最大。故本實(shí)驗(yàn)選擇Eu3+-BA-Phen體系的最佳濃度配比為1∶1.5∶2。

2.2.3表面活性劑的影響本實(shí)驗(yàn)探究了CTMAB、SDS、TX-100三種表面活性劑對(duì)Eu3+-BA-Phen體系熒光強(qiáng)度的影響。由實(shí)驗(yàn)得出隨著表面活性劑濃度的增大，Eu3+-BA-Phen體系的熒光強(qiáng)度沒(méi)有增大的趨勢(shì)，故本實(shí)驗(yàn)不需要添加表面活性劑。

2.2.4試劑加入順序的影響實(shí)驗(yàn)顯示，不同的試劑加入順序?qū)u3+-BA-Phen體系的熒光強(qiáng)度值影響不大，這是因?yàn)樽罱K發(fā)光體系是由Eu3+-BA-Phen形成的配合物所發(fā)出的熒光。所以本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，可以不考慮加入試劑順序?qū)w系的影響。

2.2.5檢測(cè)時(shí)間的影響由圖4可以看出，檢測(cè)時(shí)間對(duì)Eu3+-BA-Phen體系的熒光強(qiáng)度幾乎沒(méi)有影響，同時(shí)表明探針體系在室溫條件下具有較好的穩(wěn)定性。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇在配好溶液20 min后開(kāi)始檢測(cè)。

圖3 Eu3+-BA-Phen體系的熒光強(qiáng)度與Phen的濃度的關(guān)系Fig.3 The relationship of fluorescence intensity of Eu3+-BA-Phen system and concentration of Phen [Eu3+]=1.0×10-4 mol/L;λex/λem=297/615 nm.

圖4 檢測(cè)時(shí)間對(duì)Eu3+-BA-Phen體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of the detection time on fluorescence intensity of Eu3+-BA-Phen system [Eu3+]=1.0×10-4 mol/L;[BA]=1.5×10-4 mol/L;[Phen]=2.0×10-4 mol/L;λex/λem=297/615 nm.

圖5 鹽酸四環(huán)素的濃度對(duì)Eu3+-BA-Phen體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of concentration of TC on fluorescence intensity of Eu3+-BA-Phen system [Eu3+]=1.0×10-4 mol/L;[BA]=1.5×10-4 mol/L;[Phen]=2.0×10-4 mol/L;λex/λem=297/615 nm. Curve 1 - 7 represented concentration of TC:1.0×10-6，3.0×10-6，5.0×10-6，1.0×10-5，3.0×10-5，5.0×10-5，1.0×10-4 mol/L,respectively.

2.3 Eu3+-BA-Phen探針的選擇性

在Eu3+-BA-Phen體系的最優(yōu)化條件下分別測(cè)試土霉素、紅霉素對(duì)體系的干擾。固定TC的濃度為1.0×10-6mol/L。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)土霉素的濃度低于1.0×10-7mol/L，紅霉素濃度低于1.0×10-6mol/L時(shí)，可以忽略對(duì)TC的干擾。干擾強(qiáng)度為土霉素>紅霉素。由此可以斷定，探針在一定的濃度范圍內(nèi)可以將目標(biāo)分子從與它相似結(jié)構(gòu)的分子中區(qū)分出來(lái)。此外還考察了牛奶中可能的共存物質(zhì)對(duì)該探針體系測(cè)定結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)加入濃度為1.0×10-3mol/L的Ca2+、Mg2+、K2+、葡萄糖、維生素A、甘油均不能使該探針體系的熒光發(fā)生猝滅。

2.4 Eu3+-BA-Phen探針的精密度

分別取1.0×10-4mol/L Eu3+、1.5×10-4mol/L BA、2.0×10-4mol/L Phen、1.0×10-5mol/L TC各2 mL 混合均勻，測(cè)定該體系探針的熒光強(qiáng)度，在相同的條件下，平行測(cè)定5次。其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.18%，說(shuō)明該探針具有良好的精密度。

2.5 TC濃度與Eu3+-BA-Phen體系熒光強(qiáng)度的關(guān)系

優(yōu)化條件下考察了TC濃度與Eu3+-BA-Phen體系熒光強(qiáng)度的關(guān)系。從圖5可見(jiàn)體系的熒光強(qiáng)度隨著TC濃度的增大而減小，當(dāng)TC的濃度大于5.0×10-5mol/L時(shí)，該探針體系在615 nm處的特征峰消失。

2.6 測(cè)定TC的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

將Eu3+-BA-Phen探針對(duì)TC檢測(cè)后擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，TC濃度范圍為1.0×10-6～5.0×10-5mol/L時(shí)，Eu3+-BA-Phen探針與TC共發(fā)光的熒光強(qiáng)度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。通過(guò)線(xiàn)性擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=190.6244-0.2837x，R2=0.9974。檢測(cè)限為1.80×10-7mol/L。

2.7 牛奶樣品中鹽酸四環(huán)素的檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)方法[16]對(duì)牛奶樣品進(jìn)行預(yù)處理。由于牛奶樣品中未檢測(cè)出TC，我們用Eu3+-BA-Phen探針對(duì)處理后的牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。在10 mL的刻度試管中，依次加入1 mL 1.0×10-4mol/L Eu3+，1 mL 1.5×10-4mol/L BA，1 mL 2.0×10-4mol/L Phen溶液，及一定濃度的TC溶液，然后取稀釋20倍后的牛奶上清液0.5 mL，搖勻。放置20 min后，在λex/λem=615 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度。檢測(cè)結(jié)果如表1所示，回收率在99.5%～108%之間，平均回收率為103.8%。

表1 牛奶樣品中鹽酸四環(huán)素的回收實(shí)驗(yàn)Table 1 The recovery experiment of TC in milk sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了Eu3+-BA-Phen三元配合物體系的熒光探針，探究了它的熒光光譜特性以及實(shí)驗(yàn)條件對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。檢測(cè)限為1.8×10-7mol/L。通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)和加樣回收實(shí)驗(yàn)可知，Eu3+-BA-Phen熒光探針對(duì)鹽酸四環(huán)素具有較好的選擇性和較高的回收率。因此Eu3+-BA-Phen熒光探針作為一種快速靈敏檢測(cè)牛奶中鹽酸四環(huán)素殘留的的新方法具有廣闊的發(fā)展前景。