槲皮素對硼氮共摻雜碳點的熒光猝滅作用

楊海芬， 王 璇， 王亞坤， 于 青， 卞 偉*

(1.山西醫(yī)科大學藥學院，山西太原 030001； 2.山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，山西太原 030001；)

近年來，熒光碳點作為繼碳納米管和石墨烯之后出現(xiàn)的新型碳納米材料，受到科研工作者的青睞。碳點與傳統(tǒng)量子點相比，具有激發(fā)波長與發(fā)射波長可調(diào)、量子產(chǎn)率高、制備成本低、綠色環(huán)保、良好的水溶性和生物相容性等優(yōu)越特性，且在光催化、生物標記、藥物檢測、細胞成像、重金屬離子的檢測等諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1 - 4]。研究發(fā)現(xiàn)，用其他雜原子摻雜后得到的摻雜碳點具有穩(wěn)定的光學性質(zhì)、高的量子產(chǎn)率和顯著的催化性能[5 - 6]。如：Hou等[7]用檸檬酸和雙氰胺為原料合成了量子產(chǎn)率為73.2%的氮摻雜碳點，以它為 “on-off-on”開關(guān)型熒光探針來檢測Fe2+和去鐵蛋白； Zhang等[8]通過一步水熱法制備的熒光性能良好的水溶性氮摻雜碳點檢測痕量Hg2+；Jahan等[9]把合成的具有很強熒光的硼和氮摻雜碳點用于光敏劑和蘇丹紅的檢測。

槲皮素(Quercetin)是一種廣泛存在于植物界的多羥基黃酮類化合物，它具有多種生物學活性及很高的藥用價值，如抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏、預防心血管疾病、抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等[10 - 11]。近年來，槲皮素對于延緩衰老和抗癌防癌的作用成為一個非常熱門的課題，然而人體內(nèi)槲皮素過量時會引起頭痛和腎損傷等疾病。因此，探索槲皮素的含量測定方法十分重要。目前槲皮素的測定方法有高效液相色譜法[12]、毛細管電泳法[13]、薄層掃描法[14]、熒光光譜法[15]等。熒光光譜法與其他幾種方法相比，具有高靈敏度、高效率、操作簡單和成本低等的優(yōu)點，因而引起了研究人員的更多關(guān)注。

本文以硼酸、尿素和檸檬酸為原料，用微波法合成了硼氮共摻雜碳點(BNCDs)?；陂纹に貙υ摀诫s碳點的熒光猝滅作用，建立了一種檢測槲皮素的新方法。同時，初步探討了槲皮素與該摻雜碳點相互作用的反應(yīng)機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEM-1011型透射電子顯微鏡(日本，JEOL)；Paragon 1000型紅外光譜儀(美國，Perkin-Elmer公司)；TU-1900型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；F-4500型熒光分光光度計(日本，日立公司)；FB124型電子分析天平(北京普析通用儀器有限責任公司)；pHSJ-3F型酸度計(上海壘固儀器有限公司)。

檸檬酸(上海阿拉丁試劑有限公司)；H3BO3( 上海阿拉丁試劑有限公司)；尿素(上海阿拉丁試劑有限公司)；槲皮素(上海阿拉丁試劑有限公司)；NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、Na3PO4·12H2O(分析純，天津博迪化工廠)；無水乙醇(分析純，天津市天新精細化工開發(fā)中心)；其余試劑均為分析純。實驗用水為去離子水。

1.2 硼氮共摻雜碳點(BNCDs)的制備

取1.0 g H3BO4、1.093 g檸檬酸和1.0 g尿素，溶于20 mL去離子水中，過濾，濾液在微波(700 W)加熱4 min得到棕色固體。待固體冷卻到室溫，加20 mL去離子水溶解并過濾，收集濾液，室溫下放置3 d使其蒸干，得深綠色固體。向固體中加入適量乙醇洗滌三次，再加適量去離子水使其溶解。把所得溶液用透析膜(MWCO 500 Da)透析3 d，得到BNCDs溶液，于4 ℃條件貯存，備用。

1.3 檢測方法

在5 mL比色管中，依次加入BNCDs儲備液、磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=7.0)和不同體積的槲皮素標準溶液，搖勻。室溫下反應(yīng)幾分鐘后，以360 nm為激發(fā)波長，測定體系的熒光強度，F(xiàn)0和F分別表示加入槲皮素前后該BNCDs的熒光強度，計算相對熒光強度ΔF=F0/F。儀器激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 BNCDs的表征

BNCDs的結(jié)構(gòu)通過透射電子顯微鏡(TEM)、X-射線光電子能譜(XPS)、傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜進行表征。TEM圖表明合成的BNCDs形狀近似球形，分散均勻且無聚集現(xiàn)象，粒徑約在4.2 nm左右(圖1)。圖2為BNCDs的紅外光譜圖，在3 100～3 600 cm-1處的寬峰為N-H和O-H的伸縮振動峰；1 645 cm-1處為C=O的伸縮振動峰；B-O和B-C的伸縮振動峰分別在1 408 cm-1和1 156 cm-1；在1 342 和1 080 cm-1出現(xiàn)的是B-N的特征振動峰；在1 051 cm-1是B-O-C的彎曲振動峰； B-N-B的彎曲振動峰在758 cm-1處可以觀察到。

圖1 BNCDs的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM image of BNCDs

圖2 BNCDs的紅外(IR)光譜圖Fig.2 IR spectrum of BNCDs

圖3為BNCDs的XPS圖譜，可以觀察到合成的BNCDs主要由C、N、O和B元素組成，比例分別為40.84%、27.93%、27.46%和3.77%。說明成功的將B、N元素摻雜到碳點表面，且XPS結(jié)果與IR光譜測定結(jié)果相吻合。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1pH的選擇實驗考察了體系酸度對BNCDs以及BNCDs-槲皮素體系熒光強度的影響，結(jié)果如圖4所示。可以看出在不同pH值的PBS中，BNCDs的熒光強度的變化以及槲皮素對BNCDs的熒光強度猝滅作用不同。當pH在5.0～11.0的范圍，BNCDs的熒光強度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在pH=6.0時，BNCDs的熒光強度達到最大。在加入槲皮素后，ΔF(ΔF=F0-F)在pH=7.0時，槲皮素對BNCDs熒光強度的猝滅作用最強。因此，本實驗選擇在pH=7.0的PBS中進行。

2.2.2BNCDs濃度的影響在pH=7.0的實驗條件下，考察了BNCDs濃度對BNCDs-槲皮素體系熒光強度的影響。實驗中得出，當BNCDs的濃度逐漸增大時，BNCDs熒光探針對槲皮素的靈敏度呈升高的趨勢，且在BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L時對槲皮素測定的靈敏度達到最高，繼續(xù)增加BNCDs的濃度，對槲皮素測定的靈敏度反而降低。因此，本實驗選擇BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L。

圖3 BNCDs的X-射線光電子能譜(XPS)圖 Fig.3 XPS of BNCDs

圖4 pH對BNCDs以及BNCDs-槲皮素體系熒光強度的影響Fig.4 Effect of pH on fluorescence intensity ) 2.0 μmol/L BNCDs without quercetin；) BNCDs with 10.0 μmol/L quercetin.

圖5 槲皮素濃度對BNCDs熒光強度影響(插圖為BNCDs熒光強度變化與槲皮素濃度的線性關(guān)系)Fig.5 Effect of quercetin concentration on the fluorescence spectrum of BNCDs(Inset:displays the Lineweaver-Burk plot for the BNCDs and quercetin concentration) top to bottom: concentrations of quercetin:0.0,0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,12.0,14.0,18.0,20.0,24.0,28.0,30.0,32.0,34.0 μmol/L.

2.2.3反應(yīng)時間的影響本實驗研究了在pH=7.0，BNCDs濃度為2.0×10-6mg/L的條件下，探討了反應(yīng)時間對熒光強度的影響。我們發(fā)現(xiàn)BNCDs的熒光強度在加入槲皮素后的30 s急劇下降，4 min后摻雜碳點的熒光強度趨于穩(wěn)定，說明反應(yīng)基本完成，因此實驗中反應(yīng)時間選取為4 min。

2.3 槲皮素對摻雜碳點熒光光譜的影響

在pH=7.0，BNCDs的濃度為2.0×10-6mg/L的實驗條件下，不同濃度的槲皮素對BNCDs熒光強度的影響如圖5。由圖可見，隨著槲皮素濃度的逐漸增大，BNCDs的熒光強度逐漸降低。槲皮素濃度在0.0～34.0 μmol/L的范圍內(nèi)與BNCDs的熒光強度變化之間符合Stern-Volmer方程，呈良好的線性關(guān)系，圖5中的插入圖所示的線性方程為:F0/F=3.67×104c+0.965，相關(guān)系數(shù)(r)為0.994。該方法檢出限為47.5 nmol/L。重復測量11次的相對標準偏差為0.324%。

2.4 干擾實驗

在最優(yōu)條件下研究了常見金屬陽離子、葡萄糖以及氨基酸對槲皮素測定的干擾，結(jié)果見表1。由表中數(shù)據(jù)可知，常見金屬陽離子、葡萄糖以及氨基酸對測定的干擾較小，由此說明該檢測方法選擇性較好。

表1 共存物質(zhì)對BNCDs-槲皮素體系的影響Table 1 Effect of coexisting substance on BNCDs and quercetin

(續(xù)表1)

InterferentsConcentrationof interferent(μmol/L)Change of fluorescence intensity(%)InterferentsConcentrationof interferent(μmol/L)Change of fluorescence intensity(%)Al3+251.25Serine503.15Co2+25-1.37Histidine50-2.29Cd2+251.03Cysteine503.45Li+251.56Glucose501.43Mn2+251.63Methionine503.17

pH=7.0 PBS；[BNCDs]=2.0×10-6mg/L；[quercetin]=2 μmol/L.

2.5 機理探討

熒光猝滅過程通常分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅的效率受熒光物質(zhì)激發(fā)態(tài)壽命和猝滅劑濃度的影響，不會改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，并且動態(tài)猝滅的過程是碰撞過程，與擴散有關(guān)，因此溫度升高時分子運動加速，使分子的擴散系數(shù)增大，猝滅常數(shù)增大[16]。靜態(tài)猝滅是猝滅劑與熒光物質(zhì)的基態(tài)分子發(fā)生配合反應(yīng)，所以熒光物質(zhì)的吸收光譜會發(fā)生變化，且溫度升高，配合物的穩(wěn)定度會下降，猝滅常數(shù)減小[17]。因此可以通過吸收光譜和溫度對猝滅常數(shù)的影響來初步推斷熒光猝滅的類型。

實驗發(fā)現(xiàn)，BNCDs溶液中加入不同濃度的槲皮素(4.0、8.0、12.0、16.0 μmol/L)后，BNCDs的紫外吸收光譜隨著槲皮素濃度的增加而升高，初步判斷槲皮素與摻雜碳點的基態(tài)分子之間形成配合物。圖5表明，槲皮素的濃度與該摻雜碳點的熒光強度的變化之間符合Stern-Volmer方程，表2中數(shù)據(jù)顯示摻雜碳點的熒光猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減小。綜上所述，我們初步推斷槲皮素對摻雜碳點的熒光猝滅主要為靜態(tài)猝滅。

表2 不同溫度下Stern-Volmer方程的參數(shù)Table 2 Parameters of Stern-Volmer plots of BNCDs and quercetin

2.6 實際樣品分析

尿樣取自健康人群。檢測前將樣品離心分離，測定時取上清液用去離子水稀釋1 000倍即可。將所建立的分析方法用于健康人尿液中槲皮素的加標回收實驗，結(jié)果(表3)表明在人體尿液中槲皮素的回收率在98.7%～101.4%之間。因此該方法可用于實際樣品中槲皮素含量的測定。

表3 實際樣品中槲皮素的測定結(jié)果Table 3 Determination results of various real samples

3 結(jié)論

本實驗成功合成了水溶性的BNCDs，基于槲皮素對該摻雜碳點的熒光猝滅現(xiàn)象建立了一種測定槲皮素含量的熒光分析方法。優(yōu)化實驗條件下槲皮素濃度在0.0～34.0 μmol/L范圍與摻雜碳點的熒光強度變化呈良好的線性關(guān)系，檢出限為47.5 nmol/L。方法操作簡單、選擇性好，一些常見金屬陽離子、葡萄糖以及氨基酸對槲皮素含量測定的干擾很小，回收率實驗表明本方法可用于人體尿液中槲皮素含量的測定。