兩種DNA分子同時檢測的邏輯門及半加器的構建

晉曉勇, 張 笛， 蒙麗君， 許凱歌， 雷 杰， 彭 娟

(寧夏大學化學化工學院，省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，寧夏銀川 750021)

1959年，美國物理學家Feynman首次提出了分子計算的思想，預示著信息處理將從芯片時代向分子時代發(fā)展[1]。1994年，Adleman首次通過試驗證明了計算過程可在DNA水平進行[2]，隨后的幾十年里許多關于分子邏輯門方面的研究工作不斷被報道出來[3 - 4]。分子邏輯門的輸入對象是在分子或超分子水平上實施的兩個或兩個以上的復雜操作，輸出信號為相應操作所得到的邏輯信號，使這個信號適用于“1”和“0”二進制布爾邏輯運算，從而實現數字運算[5]。計算機的構建以邏輯運算為基礎，要建立和發(fā)展DNA計算機，DNA分子邏輯門技術是一個不可逾越的必經之路[6]。

圖1 雙標記探針DNA生物傳感的組裝用于“半加器”的構建原理圖Fig.1 Schematic illustration of the dual-signaling DNA biosensor for the "half adder" construction

氧化石墨烯(GO)是在表面修飾有羥基、羧基、環(huán)氧官能團的石墨烯[7 - 8]，由于它的親水性和良好的分散性而被廣泛應用于傳感器中。Willner課題組[9]利用GO作為有效基底材料，實現對DNAs的放大檢測并應用于邏輯門操作。本實驗介紹了應用電化學檢測技術對大腸桿菌(E.coli)DNA和沙門氏菌(Sal)DNA的同時智能檢測，原理如圖1所示。在玻碳電極表面修飾GO，然后電沉積金納米粒子(AuNPs)，基于堿基互補配對原則和GO對DNA單鏈有強的吸附作用實現對兩個目標物的同時檢測。將實驗結果應用于布爾邏輯運算，以兩種DNA序列作為輸入，其存在時定義為“1”，反之為“0”。檢測各種狀態(tài)的電化學信號，設置恰當的閾值，構建“AND”型和“XOR”型DNA分子邏輯門，在此基礎上提出了一種新型的具有邏輯運算功能的半加器(Half adder)模型。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI760E電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)；Exceed-E-UV超純水儀(成都唐氏康寧科技公司)；JSM7500F場發(fā)射掃描電鏡(日本，電子公司)。

HAuCl4·3H2O(Au≥48%)、Tris-HCl(超純，阿拉丁生化科技股份有限公司)；K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6](天津大茂試劑廠)，所有試劑除特殊說明外均為分析純。寡核苷酸序列購于生工生物工程(上海)股份有限公司，具體序列見表1。溶解在10 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(pH=7.4，含有100 mmol·L-1NaCl)中，配成10 μmol·L-1的DNA溶液，充分搖勻后于4 ℃下儲存?zhèn)溆谩嶒炗盟疄槌兯?18.2 MΩ·cm)。

表1 實驗所用寡核苷酸序列Table 1 Sequence of oligonucleotides used in this study

1.2 電極處理與修飾

將玻碳電極(GCE，直徑2.0 mm)用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末在麂皮上連續(xù)拋光至光滑鏡面，超純水沖洗，在HNO3(1+1)、無水乙醇和超純水中分別超聲3 min，吹干、備用。

GO按照文獻方法[10]制備。使用前將0.10 mg的GO在1.00 mL超純水中超聲分散20 min，制得0.10 mg·mL-1的淺黑色GO懸浮液，移取5.0 μL的GO懸浮液滴在處理干凈的GCE表面，紅外燈烤干，得到GO修飾的GCE，記作GO/GCE。將GO/GCE放入6.0 mmol·L-1HAuCl4(含0.10 mol·L-1KCl)溶液中，在-0.2 V的電位下用恒電位法電沉積2 min，取出用超純水沖洗，吹干，得到GO/AuNPs/GCE。吸取1 μmol·L-1的P1/C1、P2/C2 DNA混合液，退火處理后，滴在GO/AuNPs/GCE表面，避光保存2 h，用20 mmol·L-1pH=7.4的Tris-HCl緩沖液沖洗電極表面，除去未吸附的DNA分子，制得DNA生物傳感器。

圖2 不同電極在電化學阻抗譜在10 mmol·L-1 PBS(含有 0.10 mol·L-1 KCl，5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-)Fig.2 Nyquist diagrams of the different electrodes in 10 mmol·L-1 PBS (containing 0.10 mol·L-1 KCl,5.0 mmol·L-1[Fe(CN)6]3-/4-)(a) Bare GCE:(b) GO/GCE;(c) GO/AuNPs/GCE;(d)(0,0) input;(e)(1,0) input;(f)(0,1) input;(g)(1,1) input.

1.3 電化學檢測

電化學實驗均采用三電極系統：修飾GCE為工作電極，鉑電極(直徑2 mm)為對電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。采用循環(huán)伏安法(CV)、方波伏安法(SWV)在10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7.4，含有140 mmol·L-1NaCl、5 mmol·L-1MgCl2)中進行檢測。在-0.6～0.4 V電位窗口下進行CV掃描，掃描速度0.1 V·s-1。在-0.6～0.4 V電位窗口下進行SWV掃描，脈沖電位為0.04 V，脈沖幅度為0.025 V，頻率10 Hz。電化學阻抗(EIS)測量在pH=7.4的10 mmol·L-1PBS(含有0.10 mol·L-1KCl溶液、5.0 mmol·L-1K3[Fe(CN)6]溶液、5.0 mmol·L-1K4[Fe(CN)6]溶液)中進行，電位為0.187 V，振幅為0.05 V，頻率范圍為1 Hz～100 kHz。

2 結果與分析

2.1 不同修飾電極的表征

圖2是傳感器在不同組裝階段和不同邏輯輸入狀態(tài)下的交流阻抗圖。曲線a為裸GCE，阻抗很小，電子傳遞效率很高；曲線b為GO/GCE，阻抗增大，因為GO修飾導致電子傳遞效率降低；曲線c為GCE/GO/AuNPs，阻抗明顯小于GO/GCE的阻抗，由于AuNPs的引入，大大提高了電子傳遞效率，以上結果說明電極的成功組裝；曲線d為(0，0)輸入，P1/C1，P2/C2形成部分互補的雙鏈“站立”在電極表面，由于電極表面的負電荷密度增加，降低了[Fe(CN)6]3-/4-與電極表面的電子傳遞效率，導致阻抗增大；曲線e和f分別為(1，0)輸入和(0，1)輸入狀態(tài)，E.coli DNA與C1，Sal DNA與C2分別完全互補雜交形成雙鏈從電極表面解離，使游離的P1、P2單鏈分別吸附在電極表面，由于DNA單鏈自由伸展且?guī)в胸撾姾?，與帶負電的[Fe(CN)6]3-/4-靜電排斥，導致電子傳遞受阻，故阻抗相比(0，0)輸入有所增加；曲線g為(1，1)輸入，同時加入E.coli DNA和Sal DNA時，由于雜交反應的發(fā)生使得游離的P1和P2單鏈都被吸附在電極表面，進一步阻礙電極表面的電子傳遞，阻抗增加。

圖3所示為不同修飾電極的掃描電鏡(SEM)圖：(A)為裸GCE，由圖可知GCE表面光滑，表明電極處理干凈；(B)為GO/GCE，可以觀察到GO典型的褶皺結構；(C)為/GO/AuNPs/GCE，可以觀察到在GO褶皺表面存在納米金，粒徑約為100 nm；(D)為固定標記探針后的電極，可以觀察到DNA分子的存在使AuNPs發(fā)生團簇。

圖3 不同電極的掃描電鏡(SEM)圖Fig.3 SEM images of different electrodes(A) Bare GCE;(B) GO/GCE;(C) GO/AuNPs/GCE;(D) GO/AuNPs/GCE with probes immobilized.

2.2 實驗條件的優(yōu)化

考察了修飾電極以及目標物雜交時間對電化學信號的影響。圖4(A)為不同修飾電極的電化學響應情況，曲線a為GO/GCE;曲線b為GO/AuNPs/GCE，探針修飾2 h，(1，1)輸入情況下，目標物雜交時間相同，曲線b的信號明顯強于曲線a，說明AuNPs的存在增大了電極的比表面積使得結合探針的量增加，且自身良好的電子傳遞功能有助于增強MB和Fc在體系中的電化學信號。因此選擇GO/AuNPs/GCE修飾電極。圖4(B)為目標物雜交時間的優(yōu)化，在生物傳感器上滴加10 μL 1.0 μmol·L-1的E.coli DNA和Sal DNA混合液，每隔1 h測定一次，Fc的信號先緩慢增大，3 h時幾乎達到平穩(wěn)，但4 h后又急劇下降；MB的信號也是先增大，4 h時幾乎達到平穩(wěn)，之后無明顯變化(插圖所示)，因此選擇雜交時間為4 h。

圖4 實驗條件的優(yōu)化Fig.4 Optimization of detection conditions(A) Choice of different modified electrodes,(a) GO/GCE and (b) GO/AuNPs/GCE;(B) Effect of target hybridization time on the response of biosensor.

2.3 不同輸入狀態(tài)的循環(huán)伏安法和方波伏安法的檢測

在最優(yōu)條件下對不同輸入狀態(tài)進行CV和SWV的表征，結果如圖5所示。(0，0)輸入時，P1/C1，P2/C2分別形成部分雜交的雙鏈“站立”在電極表面，Fc和MB距離電極表面較遠，電子傳遞較慢，檢測到很弱的Fc和MB的信號(曲線a)；(1，0)輸入時，E.coli DNA與C1形成DNA雙鏈從電極表面解離，置換出的P1單鏈吸附在電極表面，MB與電極表面的距離減小，MB的信號增強，Fc信號基本保持不變；(0，1)輸入時，C2與Sal DNA形成雙鏈而從電極表面解離，置換出的P2單鏈完全吸附在電極表面，Fc與電極表面的距離減小，Fc的信號增強，MB信號基本保持不變；(1，1)輸入時，E.coli DNA與C1，Sal DNA與C2完全互補都形成雙鏈從GO表面解離，置換出游離的P1和P2單鏈吸附在電極表面，MB和Fc與電極表面的距離接近，因此MB和Fc的信號都會增大(曲線d)。

圖5 邏輯門不同輸入狀態(tài)的循環(huán)伏安(CV)曲線(A)和方波伏安(SWV)曲線(B) Fig.5 CV curves(A) and SWV curves (B) of the logic gates under different inputs state (a)(0,0) input;(b)(1,0) input;(c)(0,1) input;(d)(1,1) input.

2.4 “AND”型和“XOR”型分子邏輯門的構建

以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，以Σ|ΔI|(Σ|ΔI|=|ΔIFc|+|ΔIMB|，ΔI=I-I0，I為加入目標物后的電流信號，I0為加入目標物前的電流信號)作為輸出，設定15 μA為閾值，當X>15 μA時，輸出為1；當X<15 μA時，輸出為0，構建“AND”型DNA分子邏輯門。真值表如圖6(B)所示。

(B)

InputsE.coliSalOutputX000100010111

圖6“AND”邏輯門的構建結果。(A)SWN檢測Σ[Δ]的柱狀圖；(B)邏輯門的真值表

Fig.6Theresultof"AND"logicgate.(A)ThebardiagramsΣ|ΔI|detectionbySWV,

thedottedlineindicatesthethreshold(15μA)；(B)Thetruth
Tableof"AND"logicgate

以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，以“Y=|ΔIMB/ΔIFc|”作為輸出，設定閾區(qū)間為0.5～1.5，而當Y>1.5或Y<0.5時，輸出為1；當Y∈(0.5，1.5)時，輸出為0，構建“XOR”型DNA分子邏輯門。真值表如圖7(B)所示。

(B)

InputsE.coliSalOutputX000101011110

圖7“XOR”型邏輯門的構建結果。(A)SWN檢測|ΔIMB/ΔIFC|柱狀圖；(B)“XOR”邏輯門的真值表

Fig.7Theresultof"XOR"logicgate.(A)Thebardiagrams|ΔIMB/ΔIFc|detectionbySWV,

thedottedlineindicatesthethresholdrange(0.5-1.5)；(B)Thetruth
Tableof"XOR"logicgate

2.5 半加器的構建

將所構建的“AND”邏輯門和“XOR”邏輯門整合起來構建成具有邏輯功能的半加器(Half adder)。半加器分析兩種分子信號并根據以下的規(guī)則輸出兩種不同的分子信號：(1)沒有輸入信號時，系統沒有變化，也沒有輸出；(2)當有一個輸入分子信號時，只激活和位輸出(sum bit output)；(3)當有兩種輸入信號時，只激活進位輸出(carry bit output)。和位輸出的功能是由“XOR”邏輯門執(zhí)行，而進位輸出是由“AND”邏輯門執(zhí)行。半加器只考慮兩個一位二進制數的相加，而不考慮來自低位進位數的運算電路。真值表見表2。

表2 半加器的真值表Table 2 The truthTable for half adder

2.6 DNA生物傳感器的檢測范圍及檢出限

在最優(yōu)的實驗條件下，分別對兩種目標DNA進行測定，結果如圖8所示，E.coli DNA和Sal DNA的濃度均在1.0×10-13～1.0×10-8mol·L-1范圍內，目標物濃度的對數和Σ|ΔI|(Fc和MB信號變化之和)呈良好的線性關系，其線性方程分別為：Σ|ΔI|=32.03+2.17logcE.coli(c:mol·L-1,R=0.9931)，Σ|ΔI|=34.14+2.49logcSal(c:mol·L-1,R=0.9967)，檢出限(S/N=3)分別為 3.2×10-14mol·L-1和1.7×10-14mol·L-1。

圖8 (a)不同濃度的E.coli DNA的方波伏安(SWV)圖；(B)不同濃度的Sal DNA的方波伏安(SWV)圖 Fig.8 (a) SWV responses with different concentration of E.coli DNA;(B) SWV responses with different concentration of Sal DNA From a to f:the concentration was 1.0×10-13,1.0×10-12,1.0×10-11,1.0×10-10,1.0×10-9 and 1.0×10-8 mol·L-1.

2.7 傳感器選擇性、穩(wěn)定性及重現性的考察

為考察該生物傳感器的選擇性，分別檢測了加入目標序列(Target)、一個堿基錯配(OM)、完全錯配(NCM)的DNA序列的響應。當加入錯配堿基序列時，信號明顯比加入目標序列時的信號弱很多，這是由于錯配的DNA無法與相應的互補序列發(fā)生特異性雜交，不僅無法打開P1/C1，P2/C2鏈，而且還占據了GO表面更多的位點，結果表明該傳感器具有較好的選擇性。

按照1.2所述制備生物傳感器，兩目標物同時檢測，且將此電極儲存在4 ℃的冰箱中一周后，再用SWV法檢測，其響應信號沒有發(fā)生很大變化，表明該DNA傳感器穩(wěn)定性良好。采用同樣的修飾方法制備了三支相同的生物傳感器，在同樣的實驗條件下，SWV方法檢測(1，1)輸入狀態(tài)的電化學響應，計算的相對標準偏差(RSD)為3.8%，表明該DNA傳感器重現性良好。

3 結論

本研究采用滴涂法和電沉積法制備了氧化石墨烯/金納米粒子復合膜修飾玻碳電極作為工作電極，Fc和MB作為電化學指示劑，以E.coli DNA和Sal DNA作為目標分子，構建了標記型DNA生物傳感器，實現對E.coli DNA和Sal DNA的同時智能分析，檢測范圍均在1.0×10-13～1.0×10-8mol·L-1，檢出限(S/N=3)分別為3.2×10-14mol·L-1和1.7×10-14mol·L-1。研究結果表明此電化學傳感器具有穩(wěn)定性好、易制備、成本低和重現性好等優(yōu)點，所建立的分析方法具有高的靈敏度和較寬的線性范圍。根據實驗結果，以E.coli DNA和Sal DNA作為輸入，探針信號變化之和Σ|ΔI|作為輸出構建了“AND”型DNA分子邏輯門，以探針信號變化之比|ΔIMB/ΔIFc|作為輸出構建了“XOR”型DNA分子邏輯門，提出了一種新型的半加器模型，可實現兩個二進制數字相加運算。