光譜法結(jié)合原子力顯微鏡研究呋喃唑酮與 牛血清白蛋白的作用機(jī)理

張秋蘭, 逯 露, 李 璋, 倪永年*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047; 2.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院,江西南昌 330031)

圖1 呋喃唑酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of furazolidone

硝基呋喃類藥物是人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物,它對大多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌、某些真菌和原蟲均有作用,在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。目前此類藥物的副作用已引起人們的關(guān)注[1 - 2]，我國出口的魚、蝦、禽肉等時(shí)有被檢出含有硝基呋喃類藥物,特別是出口鰻魚多次被檢出硝基呋喃類藥物殘留,嚴(yán)重影響我國動(dòng)物源性食品出口的信譽(yù)。在養(yǎng)殖業(yè)中常使用的硝基呋喃類藥物包括呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮[3 - 5]。其中，呋喃唑酮(圖1)主要用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病預(yù)防和治療，而通過食物鏈殘留在動(dòng)物臟器中的硝基呋喃類藥物能進(jìn)入人體而危害健康,故呋喃唑酮與蛋白質(zhì)的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)是血漿中最為豐富的蛋白質(zhì),它能與進(jìn)入血液中的大多數(shù)內(nèi)源和外源性物質(zhì)，如與藥物進(jìn)行可逆的結(jié)合從而起到在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用[6]。藥物與BSA親和力的大小也影響到藥物在動(dòng)物體內(nèi)的分布、清除及通過改變血液組織或其中游離藥物濃度來影響藥效。因此,研究藥物與血清白蛋白的結(jié)合作用對理解藥物的作用機(jī)制具有重要意義[7 - 8]。本文在人體生理(pH=7.4)條件下，應(yīng)用光譜法并結(jié)合原子力量微鏡研究了呋喃唑酮與牛血清白蛋白相互作用的機(jī)理，確定了該藥物對BSA的熒光猝滅機(jī)制以及對BSA構(gòu)象的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS-55型熒光分光光度計(jì)(美國，PE公司);8453型紫外-可見分光光度計(jì)(美國，Agilent公司);ZC-10型智能型超級恒溫水槽(寧波天恒儀器廠);TENSOR 27型傅里葉紅外光譜儀(德國，布魯克公司);圓二色譜儀(法國,Bio-Logic公司);AJ-Ⅲ型原子力顯微鏡(上海愛建納米公司)。

呋喃唑酮(FZD)(純度98%，Sigma-Aldrich Chemical Co)儲備液:用二次水配成3.35×10-3mol·L-1的溶液;牛血清白蛋白(BSA)(純度99%，合肥博美生物科技有限公司)溶液:配成1.76×10-3mol·L-1和2.0×10-5mol·L-1兩種儲備液,置于冰箱中保存(1～4 ℃);Tris-HCl緩沖溶液：0.05 mol·L-1,pH=7.4。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

在比色皿中加入3.0 mL pH=7.4的Tris-HCl 緩沖溶液,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要分別加入適量的呋喃唑酮和BSA溶液。由于加入試劑的體積遠(yuǎn)小于初始體積,因此可以忽略濃度稀釋效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)1:固定BSA的濃度(6.67×10-8mol·L-1),然后加入不同量的呋喃唑酮，使最終濃度為0至21.33×10-8mol·L-1,間隔為2.67×10-8mol·L-1,放置5 min使平衡,分別在溫度298、302和306 K下測其熒光光譜。實(shí)驗(yàn)2:固定BSA的濃度(6.67×10-6mol·L-1),逐步加入呋喃唑酮溶液,使[FZD]∶[BSA]為0至9,分別測定不同濃度比例時(shí)的紫外吸收光譜(298 K)。實(shí)驗(yàn)3:分辨率為4 cm-1,取樣次數(shù)為60,在800～2 000 cm-1范圍內(nèi),以緩沖溶液做參比,分別掃描BSA和復(fù)合物FZD-BSA的紅外光譜。實(shí)驗(yàn)4:在190～250 nm波長范圍內(nèi),分別測定BSA和復(fù)合物FZD-BSA的圓二色譜。實(shí)驗(yàn)5:分別取6 μL前一天配制的實(shí)驗(yàn)所需濃度的BSA和FZD-BSA樣品滴在云母片上,室溫放置24 h后，進(jìn)行原子力顯微鏡測試。

2 結(jié)果與討論

圖2 由實(shí)驗(yàn)1所得的呋喃唑酮與BSA作用的熒光光譜圖Fig.2 Emission spectra of BSA in the presence of FZD with various concentration (Experiments 1) cBSA=6.67×10-8 mol·L-1;cFZD=0,2.67,5.33,…,21.33×10-8 mol·L-1 (curves 1-9);Tris-HCl buffer,pH=7.4;excitation and emission slits were 10 nm;scanning rate was 1 000 nm·min-1.

2.1 FZD對BSA內(nèi)源性熒光猝滅機(jī)理的研究

BSA有兩個(gè)具有內(nèi)源熒光的色氨酸殘基[9]:Trp212在疏水性空腔的內(nèi)部,而Trp134在分子的表面。BSA在紫外區(qū)的熒光主要來源于色氨酸殘基。當(dāng)其他配體與BSA作用時(shí),由于復(fù)合物的生成,使色氨酸的熒光發(fā)生變化[10];熒光的改變實(shí)際上是與發(fā)光過程相互競爭從而縮短發(fā)光分子激發(fā)態(tài)壽命的過程。固定BSA的濃度,并逐漸增大FZD的濃度(實(shí)驗(yàn)1),BSA在350 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨藥物的增加而有規(guī)律地下降(圖2),說明FZD與BSA發(fā)生了相互作用。

導(dǎo)致熒光猝滅有多種機(jī)制,主要有動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅,一般可遵循Stern-Volmer方程予以區(qū)分[11]:

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

式中,F0和F分別是不存在和存在猝滅劑時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度,[Q]是猝滅劑的濃度,KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù),Kq為雙分子猝滅速率常數(shù),τ0為生物大分子熒光壽命(約為10-8s-1)。

分別作溫度298、302和306 K下,FZD對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer擬合曲線(圖略),均具有良好線性關(guān)系,且隨著溫度的升高,藥物與BSA作用的KSV減小(表1),FZD對BSA猝滅速率常數(shù)分別為1.64、1.50和1.37×106L·mol-1。一般認(rèn)為,各類猝滅劑與生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)為2×1010L·mol-1·s-1[11],顯然FZD對BSA猝滅過程的速率常數(shù)(1014L·mol-1·s-1)大于擴(kuò)散控制的猝滅速率常數(shù)Kq,表明猝滅過程為生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅[12]。

表1 FZD與BSA反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和熱力學(xué)參數(shù)Table 1 The binding constants and relative thermodynamic parameters of the FZD-BSA system

2.2 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的測定

對于靜態(tài)猝滅過程,熒光強(qiáng)度與猝滅劑之間的關(guān)系可由熒光分子與猝滅劑的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式-雙對數(shù)方程得到。由計(jì)算得到的Ka和n見表1,結(jié)合常數(shù)Ka的變化趨勢與KSV相同,都隨著溫度的升高而減小(由6.50×106L·mol-1減小到5.07×106L·mol-1),表明溫度的升高使生成的配合物的穩(wěn)定性下降。結(jié)合常數(shù)大于106L·mol-1,說明FZD與BSA有比較強(qiáng)的作用力;結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近1,說明FZD在BSA上有一獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)[13]。

2.3 作用力類型的確定

有機(jī)小分子與生物大分子借助于疏水作用力、氫鍵、范德華力和靜電引力等作用形成復(fù)合物[14],不同分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合力類型是不同的。Ross等[15]總結(jié)了判斷生物大分子和小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變和熵變的相對大小,可判斷小分子與大分子之間的主要作用力類型。熵變和焓變可根據(jù)van’t Hoff方程計(jì)算[15]。而在不同溫度下的吉布斯自由能(ΔG)可由下式得到:

ΔG=ΔH-TΔS

(2)

不同溫度下的結(jié)合常數(shù)計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)列于表1中。焓變(ΔH)小于零說明FZD與BSA形成復(fù)合物的反應(yīng)為放熱反應(yīng),吉布斯自由能(ΔG)小于零表明結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。焓變ΔH(-16.22 kJ·mol-1)<0,熵變ΔS(-26.01 J·mol-1·K-1)<0,說明呋喃唑酮與BSA之間的作用力主要為氫鍵和范德華力。

2.4 紫外光譜研究呋喃唑酮與BSA的相互作用

圖3 Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)中BSA與不同濃度FZD的紫外吸收光譜圖Fig.3 The UV-Vis spectra of BSA and FZD with different concentration in Tris-HCl buffer(pH=7.4) cBSA=6.67×10-7 mol·L-1;curves(1-10):[FZD]∶[BSA]=0,1,2,3,…,10.

BSA在278 nm處的吸收峰是其肽鏈上的色氨酸和酪氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷引起的。從圖3可知，隨著FZD濃度的增加，在278 nm處峰位置藍(lán)移且吸收強(qiáng)度逐漸增加,說明FZD與BSA發(fā)生了作用,誘導(dǎo)BSA分子鏈發(fā)生了類似降低pH值所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)肽鏈伸展現(xiàn)象[16],被包含在BSA內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來,使吸收強(qiáng)度增加,同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用減弱;由于BSA與加入的FZD分子生成了新的共軛體系,形成新的π-π*躍遷,使吸收峰發(fā)生了位移。動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光生色團(tuán)的激發(fā)態(tài),不會(huì)改變紫外光譜峰。因此,通過BSA紫外吸收光譜的變化可確定基態(tài)復(fù)合物的形成，并證明熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅[17]。

圖4 FZD與BSA相互作用的紅外(IR)光譜圖Fig.4 IR spectra of BSA before and after binding with FZD(A);Curve-fitted amide Ⅰ region (1 700-1 600 nm) of free BSA (B) and its complex (C) cBSA=6.67×10-6 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,IR spectra were recorded with a resolution of 4 cm-1 and 60 scans (range:800～2 000 cm-1).The IR spectra of sample solutions collected were corrected by subtracting the spectrum of buffer.

2.5 呋喃唑酮對BSA構(gòu)象的影響

2.5.1紅外光譜法研究FZD對BSA構(gòu)象的影響為進(jìn)一步確定藥物結(jié)合蛋白后對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響,利用紅外光譜研究了FZD與BSA的相互作用[18]。由圖4A可以看出,FZD與BSA的作用使得酰胺Ⅰ帶由1 655 nm移至1 652 nm,酰胺Ⅱ帶由1 541 nm移至1 536 nm,表明FZD分子與蛋白質(zhì)結(jié)合,改變了BSA的二級結(jié)構(gòu)。應(yīng)用去卷積和曲線擬合法對譜圖進(jìn)行處理(圖4B和4C),計(jì)算出BSA酰胺Ⅰ帶的二級結(jié)構(gòu)含量。當(dāng)FZD與BSA的摩爾比為4時(shí),BSA的α-螺旋和β-折疊含量由46.97%、11.74%分別減少至42.15%和9.87%;而β-折疊由15.91%增加至18.41%；β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲也有不同程度的增加。由此說明FZD可改變BSA的結(jié)構(gòu)。

圖5 呋喃唑酮與BSA相互作用的圓二色譜圖Fig.5 The CD spectra of BSA before and after binding with FZD [BSA]=6.67×10-8 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,wavelength range:190-280 nm,scanning speed:1 nm·s-1.

2.5.2圓二色譜法研究FZD對BSA構(gòu)象的影響不同二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的圓二色譜譜帶位置、吸收強(qiáng)弱不同,α-螺旋在208 nm和222 nm處有兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶,β-折疊在216 nm處有一負(fù)譜帶,β-轉(zhuǎn)角在206 nm附近處有一正譜帶,而無規(guī)則卷曲200 nm附近的負(fù)峰是其特征曲線[19]。由圖5可知,隨著呋喃唑酮的加入,負(fù)峰的強(qiáng)度明顯降低,說明BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低。根據(jù)公式[20]可計(jì)算得到α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量從55.6%降低到51.2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與紅外研究基本一致,表明FZD與BSA結(jié)合后使蛋白部分伸展,降低了BSA的穩(wěn)定性。但是,BSA的圓二圖譜中的峰形和峰位并未明顯改變,表明BSA中的α-螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導(dǎo)地位。

2.5.3原子力顯微鏡(AFM)研究FZD對BSA構(gòu)象的影響AFM具有比較好的信噪比、空間分辨率和靈活的探測環(huán)境,使其在單分子成像,和蛋白單分子結(jié)構(gòu)與功能研究中得到廣泛應(yīng)用。AFM可觀測到蛋白質(zhì)分子的表面形貌,也能夠連續(xù)監(jiān)測生化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)過程[21]。與FZD結(jié)合后對比發(fā)現(xiàn),BSA分子直徑和厚度都增大,BSA的表面粗糙度(RMS)由1.65±0.21 nm增至14.23±0.32 nm(圖6),可能是BSA所處微環(huán)境和構(gòu)象發(fā)生變化所致[22]。

圖6 BSA與呋喃唑酮相互作用前(A)和作用后(B)的原子力顯微鏡(AFM)圖Fig.6 AFM spectra of BSA before (A) and after (B) binding with FZD [BSA]=6.67×10-8 mol·L-1,[FZD]∶[BSA]=4,samples were prepared by depositing 6.0 μL on freshly cleaved mica plates (1.2×1.2 cm),dried 24 h and used for AFM with tapping mode.

3 結(jié)論

本文利用熒光、紫外、紅外光譜和圓二色譜法研究呋喃唑酮與牛血清白蛋白的相互作用。可知呋喃唑酮與BSA的相互作用過程屬于形成基態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)猝滅;由熱力學(xué)公式計(jì)算得到焓變ΔH<0，熵變ΔS<0,說明呋喃唑酮與BSA之間的作用力主要為范德華力和氫鍵;而由雙對數(shù)方程得到結(jié)合常數(shù)大于106L·mol-1,說明呋喃唑酮在血液中的存在時(shí)間久,難以代謝,毒副作用強(qiáng);各種光譜和AFM實(shí)驗(yàn)說明呋喃唑酮的存在,不僅改變了BSA所處的微環(huán)境并使BSA的構(gòu)象發(fā)生變化。