錦鯉致病性維氏氣單胞菌的分離、鑒定及藥敏研究

楊昆明，黨 瑞，謝志勝，馬江霞，段成任，郭愛民，岳 城

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

錦鯉致病性維氏氣單胞菌的分離、鑒定及藥敏研究

楊昆明，黨 瑞，謝志勝，馬江霞，段成任，郭愛民，岳 城

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

新疆烏魯木齊本地某養(yǎng)殖場錦鯉(Cyprinuscarpio)突然大批死亡，在排除寄生蟲感染后，懷疑是由細(xì)菌引起。為明確引起錦鯉大批死亡的致病菌，本實驗對病魚肝臟、腸道、腎臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離純化。通過革蘭氏染色、微量生理生化反應(yīng)及分子生物學(xué)鑒定，成功分離出兩株菌，命名為CK5和CK9。兩株菌都為革蘭氏陰性短桿菌，在30 ℃正常生長，能利用葡萄糖、乳糖、纖維二糖，并且V-P、明膠、水楊苷實驗陽性；PCR擴增其gyrB基因并測序，BLAST比對后，兩株菌與維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)的同源性最高，分別為99.6%和99.0%，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與維氏氣單胞菌聚為一枝。病理組織切片顯示肝臟脂肪空泡變性，腎小管變性壞死。藥敏實驗結(jié)果表明CK5、CK9對慶大霉素、氧氟沙星、頭孢噻肟、氨曲南、諾氟沙星等藥物敏感，對萬古霉素、克林霉素、苯唑西林耐藥。

錦鯉(Cyprinuscarpio)；維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)；分離；鑒定

Abstract：Recently,the large number ofC.carpiobreakout death was suspected to be caused by bacteria after eliminated the parasitic infection.In order to find the pathogenic bacteria which caused the death ofC.carpio,the liver,intestine,kidney and other tissues of sick fish were investigated by isolation and purification of bacteria.After gram staining micro physiological,biochemical reaction and molecular biological identification.Two bacteria CK5 and CK9 were separated successfully.Both bacterias were Gram negative bacillus as well as normal growth at 30 ℃.The experiment of lactose,glucose,cellobiose,glutin,ortho-hydroxybenzoic acid were positive.By amplified and sequenced gyrB,aligned sequences with GenBank that results showed the sequence at high homology (99.6% and 99.0%) withAeromonasveronii,phylogenetic tree also indicated with high degree confidenc.The histopathologic slide display liver axunge vacuolar degeneration and kidney tubules degenerative necrosis.CK5 and CK9 were sensitive to genta，icin，ofloxacin， cefotaxime，aztreonam，norfloxacin，whlie exhibited resistance vancomycin,clindamycin and oxacillin.

Keywords：Cyprinuscarpio;Aeromonasveronii;isolation;identification

錦鯉(Cyprinuscarpio)隸屬于輻鰭魚亞綱(Actinopterygii)鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉魚屬(Cypriuus)[1]。由于養(yǎng)殖環(huán)境變化引起體色突變，通過長期的人工選育培養(yǎng)的雜交變異品種。因其在水中姿態(tài)優(yōu)雅，體色絢麗，作為風(fēng)水魚被廣大民眾喜愛。隨著新絲綢之路的發(fā)展，新疆觀賞魚產(chǎn)業(yè)蒸蒸日上，尤其是錦鯉產(chǎn)業(yè)，新疆繁殖的錦鯉不僅被本地民眾所喜愛，而且遠(yuǎn)銷國外。隨著錦鯉養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖密度也隨之加大，因養(yǎng)殖管理制度混亂，相關(guān)細(xì)菌病知識匱乏，導(dǎo)致錦鯉細(xì)菌病高發(fā)，大批魚死亡，給魚戶造成巨大損失[2]。

近期烏魯木齊某觀賞魚養(yǎng)殖場錦鯉大批死亡，為找到其原因，在排除寄生蟲感染的情況下，懷疑是細(xì)菌病感染。通過細(xì)菌分離、純化，從中得到兩株優(yōu)勢菌。對優(yōu)勢菌進(jìn)行了鏡檢、生理生化特性實驗及藥物敏感性實驗，并進(jìn)行了gyrB序列分析，構(gòu)建進(jìn)化樹[3]。旨在豐富我國錦鯉細(xì)菌病病原研究資料，并為錦鯉細(xì)菌病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病錦鯉采集于新疆烏魯木齊市某觀賞魚養(yǎng)殖場。健康1齡錦鯉(體長10～15 cm，體重120～140 g)同樣選自該養(yǎng)殖場，在實驗室飼養(yǎng)21 d確定健康后用于回歸感染實驗。

LB肉湯(LB Broth)、LB瓊脂(LB Nutrient Agar)、Mueeller-Hinton(M-H)液體培養(yǎng)基購自青島日水生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化試驗管、革蘭氏染液、藥敏紙片購自杭州天河微生物試劑有限公司；細(xì)菌gyrB通用引物、序列測定由上海生工生物工程服務(wù)有限責(zé)任公司提供；膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自全式金生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌的分離純化

無菌條件下從魚體表(潰瘍處或鱗片基部)、腹腔液、肝臟、腸、腎等病灶處取樣，在LB瓊脂培養(yǎng)基上劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)14～16 h。挑取形態(tài)一致的單個優(yōu)勢菌落進(jìn)行革蘭氏染色并進(jìn)行進(jìn)一步的分離傳代純化培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌鑒定

接菌環(huán)滅菌挑取瓊脂平板上單個菌落，經(jīng)稀釋、涂片、固定、染色后，顯微鏡油鏡下觀察菌體形態(tài)和顏色，鏡檢菌體單一后挑取單個菌落接種于Mueeller-Hinton(M-H)液體培養(yǎng)基，用培養(yǎng)的純化細(xì)菌進(jìn)行VP、硫化氫、明膠、葡萄糖、纖維二糖、乳糖、酒石酸鹽、水楊苷等生理生化實驗，實驗結(jié)果參照相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析[4]。

分離純化的細(xì)菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床30 ℃培養(yǎng)14 h，以菌液為底物，進(jìn)行菌液PCR。選用細(xì)菌的通用引物擴增gyrB，(正向BF:5′-ACAACTCCTACAAGGTCTCCG-3′；反向BR:5′-TCAGCAGCAGGGTACGGATGT-3′)。引物由上海生工有限責(zé)任公司合成。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：Super mix 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，底物2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，連接轉(zhuǎn)化并提取質(zhì)粒，送往上海生工生物公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果通過Blast比對，用MEGA6.0軟件做多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 致病菌藥敏試驗

吸取50 μL菌液均勻涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基表面，用無菌鑷子夾取藥敏片以適當(dāng)間隔距離粘貼于瓊脂培養(yǎng)基表面，輕壓藥敏片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，倒置在恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)16-24h后觀察并測量抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片說明書，判斷該菌對相應(yīng)藥物的敏感程度[5，6]。

1.5 病理組織切片

將健康魚和患病魚的肝臟、腸體完整切下并保存在4%福爾馬林中，參照李鈺等[7]的病理組織切片法，采用型號為LEICA RM2235手搖連續(xù)切片機進(jìn)行切片，并對切片進(jìn)行染色，對比病變內(nèi)臟切片與健康內(nèi)臟切片間組織的變化。

1.6 回感實驗

挑取純化后LB瓊脂平板上的優(yōu)勢菌落，用無菌生理鹽水稀釋成密度為1×109、1×108、1×107、1×106、1×105cfu /mL的細(xì)菌懸濁液，腹部肌肉注射每尾0.5 mL，對照組錦鯉肌肉注射等量的無菌生理鹽水，每組注射5尾，水溫30 ℃，持續(xù)供氧，連續(xù)觀察5 d，每天定時投喂，觀察并記錄試驗魚的病癥及每天死亡數(shù)目，發(fā)現(xiàn)死魚及時撈出，檢查并記錄其體表及內(nèi)臟器官的病變情況，同時作細(xì)菌分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病菌形態(tài)特征

從患病錦鯉的肝臟和腸道(明顯病變)分離純化得到兩株優(yōu)勢菌，初步命名為CK5和CK9，經(jīng)染色兩株菌均為革蘭氏陰性短桿菌，接種于LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)14 h后，形成圓形、直徑1～1.2 mm(微隆起)左右、光滑、邊緣整齊、半透明、灰白色的菌落，與氣單胞菌菌落形態(tài)描述相符[8,9]。

2.2 生理生化反應(yīng)結(jié)果

CK5和CK9的生理生化反應(yīng)顯示能利用葡萄糖、乳糖、纖維二糖，并且V-P、明膠、水楊苷實驗陽性，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》鑒定[10]，均與維氏氣單胞菌相似(表1)。

表1 分離菌的生理生化特性Tab.1 Physiology and biochemistry reaction of bacteriaisolated

注：“+”表示陽性反應(yīng)，“-”表示陰性反應(yīng)。

2.3 PCR鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

凝膠電泳結(jié)果顯示，菌株CK5和CK9 gyrB電泳條帶長度為1 200 bp左右(圖1)。將菌株的CK5、CK9 gyrB基因序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示CK5株與江蘇株(KR070961)的同源性為99.0%，CK9株與安徽株(FJ589032)的的同源性為99.6%；運用Mega 6.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖2)，以Acinetobacterbrisouii為外類群，CK5株與KR070961聚為一支，CK9株與FJ589032聚為一支。本實驗兩株菌綜合以上結(jié)果，可鑒定為維氏氣單胞菌。

圖1 分離菌株gyrB基因擴增序列Fig.1 Isolated strain gyrB gene amplification

2.4 致病菌藥敏試驗

藥敏試驗結(jié)果顯示(表2)，CK5對慶大霉素、頭孢噻肟、氨曲南等藥物高度敏感；CK9對氧氟沙星、氨曲南高度敏感；兩者對阿米卡星、卡那霉素、四環(huán)素中度敏感；對鏈霉素、環(huán)丙沙星、哌拉西林、氨芐西林、克林霉素、萬古霉素耐藥。

2.5 病理組織切片

通過病理組織切片染色(圖3)，可觀察到正常肝臟細(xì)胞邊緣整齊，呈多邊形，細(xì)胞核在中間；而患病錦鯉病變肝臟炎性細(xì)胞浸潤(A)，脂肪空泡變性(B)。正常腎臟細(xì)胞排列緊密，邊界清晰，細(xì)胞核靠近基底，病變腎臟腎小管與基底膜脫離，腎間質(zhì)有大量淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞浸潤(C)；腎小管變性壞死(D)。

表2 病原菌的藥敏試驗結(jié)果Tab.2 A ntibiotic sensitivity test of pathogenic bacteria

注：(R)表示低度敏感或不敏感；(I)表示中度敏感；(S)表示高度敏感。

2.6 回感實驗

注射致病菌后，多數(shù)魚發(fā)病癥狀和自然發(fā)病癥狀相似，從死亡與瀕臨死亡的實驗魚肝臟、脾臟、腎臟及腹水處分離得到注射菌。對照組正常飲食，沒有死亡現(xiàn)象。

3 討論

3.1 新疆錦鯉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及維氏氣單胞菌對觀賞魚的危害

隨著一帶一路的建設(shè)，新疆經(jīng)濟發(fā)展穩(wěn)步提升，水產(chǎn)業(yè)發(fā)展也越來越好，觀賞魚養(yǎng)殖業(yè)潛力巨大。新疆本土觀賞魚以養(yǎng)殖錦鯉為主，但是養(yǎng)殖者對氣單胞菌[2,5]、熒光假單胞菌[11]、鮑曼不動桿菌[12]、遲鈍愛德華菌以及弗氏檸檬酸桿菌對錦鯉造成的病害關(guān)注度不高。目前學(xué)術(shù)方面對本地區(qū)養(yǎng)殖錦鯉的疾病報道少之又少，本實驗為新疆地區(qū)錦鯉養(yǎng)殖過程中細(xì)菌病的防治及病原研究提供了基礎(chǔ)資料，也為我國魚類細(xì)菌病研究提供了科學(xué)資料。

圖3 Ⅰ正常肝臟，Ⅱ病變肝臟，Ⅲ正常腎臟，Ⅳ病變腎臟
Fig. 3 Ⅰnormal liver,ⅡDiseased liver,ⅢNormal kidney,ⅣDiseased kidney
A肝臟炎性細(xì)胞浸潤，B脂肪變性；C腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞浸潤，D腎小管變性壞死

近幾年，國內(nèi)外對維氏氣單胞菌造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害的報道明顯增多，秦國民等[2]、毛海濤等[13]、姜娜等[14]均在錦鯉病變處分離出維氏氣單胞菌；有學(xué)者報道從金魚[15]、地圖魚[16]等諸多患病觀賞魚體內(nèi)分離出維氏氣單胞菌；國外學(xué)者等[17，18]也從患病魚體分離出維氏氣單胞菌。該菌是條件致病菌，當(dāng)魚體有損傷，自身抵抗力下降時菌體侵入魚體并大量增殖，產(chǎn)生氣溶素(aer)[19]、溶血素(hly)[20]、細(xì)胞興奮性腸毒素(alt)[21]等眾多毒力因子。從患病錦鯉體內(nèi)分離得到維氏氣單胞菌，這在新疆地區(qū)觀賞魚細(xì)菌性疾病研究中尚屬首次。

表3 人工回感實驗Tab.3 Artificial regression infection experiment

3.2 分離菌的結(jié)果鑒定

本研究從患病錦鯉肝臟、腸道分離得到CK5和CK9兩株致病菌，經(jīng)革蘭氏染色、生理生化實驗以及gyrB三種方法對兩種菌進(jìn)行鑒定。革蘭氏染色鑒定所需時間短，但是不能鑒定到種；微量生理生化實驗鑒定比較直接，但是此方法適用于種間的區(qū)分鑒定；gyrB通過PCR其高敏感性和高精確性可以將純化的細(xì)菌鑒定到種。本實驗結(jié)合以上三種方法對分離的兩株菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果兩株菌均為陰性短桿菌，生理生化反應(yīng)顯示能利用葡萄糖、乳糖、纖維二糖，并且V-P、明膠、水楊苷實驗陽性，上述結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》上維氏氣單胞菌的生理生化特性相符。gyrB基因序列分析顯示CK5與江蘇株(KR070961)的同源性為99.0%，CK9與安徽株(FJ589032)的同源性為99.6%，綜上鑒定結(jié)果可判斷CK5和CK9均為維氏氣單胞菌。

3.3 維氏氣單胞菌藥物敏感性分析

本實驗藥敏結(jié)果顯示致病菌對慶大霉素、頭孢三代和頭孢四代以及氧氟沙星等藥物敏感；而對鏈霉素、哌拉西林、氨芐西林、克林霉素、萬毒霉素呈現(xiàn)出耐藥的狀態(tài)，此結(jié)果與姜娜等[14]、黎炯等[22]報道的維氏氣單胞菌藥敏結(jié)果基本相符，與周光等[23]報道的維氏氣單胞菌的耐藥性結(jié)果有少許不同，原因可能是周光實驗菌體分離自不同生態(tài)位以及與本實驗菌分離地區(qū)不同。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中細(xì)菌病的預(yù)防是關(guān)鍵，但治療是個難題。據(jù)報道，細(xì)菌黏附接觸物表面時會分泌纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白、多糖基質(zhì)等物質(zhì)將自己包裹，形成一層生物被膜(Biofilm)，阻礙抗生素的滲透，從而形成耐藥屏障[24,25]。對于魚類細(xì)菌病我們秉持著無病先防，有病早治，防重于治的原則，對養(yǎng)殖水體進(jìn)行殺菌消毒，在魚餌料中添加適量的抗生素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中防控細(xì)菌病的主要措施之一?？咕幬锓N類復(fù)雜多樣，質(zhì)量也參差不齊，要有針對性的選用抗生素來預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病，避免單用、濫用一類抗生素而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。最重要的是要改善水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，提高錦鯉的抗病與應(yīng)激能力，從而保證錦鯉養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)的發(fā)展。

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Isolation,identificationandantibioticsensitivityofAeromonasveroniifromCyprinuscarpio

YANG Kun-ming,DANG Rui,XIE Zhi-sheng,MA Jiang-xia,DUAN Cheng-ren,GUO Ai-min,YUE Cheng

(CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi830052，China)

2017-04-25；

2017-07-23

國家自然科學(xué)基金項目(31360644)；自治區(qū)推廣項目(2016C03013)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目(XJAUGRI2016006)

楊昆明(1992- )男，碩士研究生，專業(yè)方向為水生動物保護學(xué)。E-mail：ykunming@aliyun.com

岳 城。E-mail：yuechengxnd@aliyun.com

S941.42

A

1000-6907-(2017)05-0047-06