豬旋毛蟲病診斷方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，姚春陽，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

豬旋毛蟲病診斷方法研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，姚春陽，李 峰

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

欄目協(xié)辦

豬旋毛蟲病是嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。豬旋毛蟲對于肉品衛(wèi)生影響嚴(yán)重，是我國肉品首檢和必檢項目。文章從病原學(xué)、血清學(xué)和分子生物學(xué)方面概述了豬旋毛蟲病最新診斷方法，以期為肉品檢疫人員、廣大養(yǎng)殖業(yè)主及獸醫(yī)科研工作者更好地診斷和防治該病提供參考。

旋毛蟲；豬旋毛蟲??；診斷；檢測；研究進(jìn)展

豬旋毛蟲?。═richinellosis）是由毛首目毛形科（Trichinenidae）的旋毛形線蟲（Trichinella spiralis）成蟲寄生于豬的小腸，幼蟲寄生于橫紋肌而引起的嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。豬是人感染旋毛蟲病的重要來源之一，人主要因食用生的或未煮熟含有活的旋毛蟲幼蟲的肉品而感染。本病分布于世界各地，對人類健康造成很大威脅，同時對養(yǎng)豬業(yè)、肉食品加工業(yè)、外貿(mào)出口業(yè)也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是我國肉品首檢和必檢項目，歐盟也規(guī)定在其成員國內(nèi)飼養(yǎng)的生豬必須進(jìn)行旋毛蟲檢查。旋毛蟲感染豬后幾乎不表現(xiàn)任何臨床癥狀，對于本病的臨床診斷較為困難，且易與其他相似傳染性疾病相混淆。國際貿(mào)易全球化也增加了豬旋毛蟲病的傳播機會。為更好地防控本病的發(fā)生，尋求早期、快速、高效和準(zhǔn)確的旋毛蟲病診斷方法已成為人們研究的熱點。本文綜述了豬旋毛蟲病的診斷方法研究進(jìn)展，以期為肉品檢疫人員、廣大養(yǎng)殖業(yè)主及獸醫(yī)科研工作者更好地診斷和防治該病提供參考。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 壓片鏡檢法

壓片鏡檢法（TSM）是將屠宰后的生豬，取膈肌進(jìn)行壓片鏡檢，該方法是最簡單的直觀檢查法。壓片鏡檢法包括兩種方法，一種是將一小塊肌肉（0.5 g）置于兩張載玻片之間擠壓后（或兩端用線扎緊），在普通光學(xué)顯微鏡的低倍鏡下按順序檢查，也稱為肌肉壓片鏡檢法或顯微鏡檢查法（簡稱鏡檢法），國內(nèi)常用此種方法；另一種是通過專用的旋毛蟲鏡進(jìn)行檢查，其基本操作步驟是先將肉樣置于兩塊特制的玻璃板之間，擠壓后用螺絲固定，然后用旋毛蟲鏡進(jìn)行檢查，由于旋毛蟲鏡是將觀察視野投放到屏幕上觀察，一次可同時觀察24個肉樣，此方法在歐美國家常用。壓片鏡檢法有存在漏檢的可能，尤其對肌肉不成囊的偽旋毛蟲檢出率較低，并且可能由于人員操作不當(dāng)和待檢樣品處理不善造成二次污染而感染人類和其他動物。壓片鏡檢法也不能對活體動物或人類取用旋毛蟲肌幼蟲好發(fā)部位如膈肌進(jìn)行檢驗。

1.2 集樣消化法

集樣消化法（BDM）又稱人工消化法，是除去脂肪及結(jié)締組織后利用胃蛋白酶將肌肉組織消化，從而使活的旋毛蟲幼蟲從囊包中釋放出來，收集到的旋毛蟲放在50～70倍顯微鏡下檢查。集樣消化法中的磁力攪拌法是目前公認(rèn)的旋毛蟲檢驗的金標(biāo)準(zhǔn)。于連富等[1]提出了適用于冷凍豬肉中旋毛蟲體檢測的改進(jìn)消化法。盡管集樣消化法經(jīng)過不斷改進(jìn)其靈敏性較鏡檢法稍高，但在消化過程中受到很多因素的影響，而且集樣消化法也大多用于對豬肉或人尸體的旋毛蟲檢查。

2 血清學(xué)診斷方法

2.1 凝集試驗

目前可用于豬旋毛蟲病檢測的凝集試驗有：皂土絮狀凝集試驗（BFT），膠乳凝集試驗（LAT）和間接血凝試驗（IHA）等。竇蘭清等[2]應(yīng)用微量IHA診斷70頭人工感染豬旋毛蟲病的病豬，取得了較為滿意的結(jié)果。楊書軍等[3]應(yīng)用玻板IHA法快速現(xiàn)地診斷2 116頭商品豬旋毛蟲病。王紹基等[4]也采用IHA檢測感染旋毛蟲病豚鼠血清。殷禮等[5]以羧化聚苯乙烯膠乳作免疫載體，建立了LAT方法取得了比較滿意的結(jié)果。鄭星道等[6]用LAT法、TSM法和BDM法3種方法檢測豬旋毛蟲病，發(fā)現(xiàn)LAT法比后2種方法檢出率高。郭成留等[7]以旋毛蟲可溶性抗原作診斷抗原，聚苯乙烯微球為抗原載體，通過碳化二亞胺反應(yīng)把旋毛蟲抗原共價偶聯(lián)到聚苯乙烯載體微球上，制備了用于檢測豬旋毛蟲病血清抗體的免疫微球診斷試劑。在檢測的敏感性上，免疫微球凝集試驗比人工消化檢查法高9.17%，比壓片鏡檢法高25.26%。Eissa等[8]應(yīng)用協(xié)同凝集試驗（CoA），對旋毛蟲感染實驗小鼠尿樣和血樣進(jìn)行檢測，均檢到旋毛蟲抗原。凝集試驗適用于肉食品部門宰前檢驗和豬旋毛蟲病流行病學(xué)調(diào)查。

2.2 間接熒光抗體試驗

朱興全等[9]在建立間接熒光抗體試驗（IFAT）方法的基礎(chǔ)上，對采自甘肅及河南的1 199份屠宰豬血清進(jìn)行了豬旋毛蟲病的血清流行病學(xué)調(diào)查。200份非疫區(qū)豬血清，IFAT有7份陽性，陽性率3.5%。999份疫區(qū)屠宰豬血清，IFAT檢出陽性血清203份，陽性率20.32%，用人工胃液消化法檢出有蟲者185份，陽性率18.52%。2種方法陽性檢出率無顯著性差異。IFAT方法比較敏感，并有很高的特異性，但需配備熒光顯微鏡，因此應(yīng)用受到限制。

2.3 沉淀試驗

用于檢測旋毛蟲病的沉淀試驗，包括環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙擴散、免疫電泳等方法。Lilkova等[10]用雙向電泳檢測旋毛蟲病豬血清中的抗原成分，結(jié)果在感染后30～120 d檢測結(jié)果均呈陽性。Smith等[11]用雙向?qū)α髅庖唠娪緳z測旋毛蟲感染小鼠血清中循環(huán)抗原和抗體，在感染后12 d就有抗原檢出。沉淀試驗敏感性有限，特異性也不是很強，并且對試驗條件也有較高的要求，故現(xiàn)在已經(jīng)很少應(yīng)用此方法來檢測豬旋毛蟲病。

2.4 免疫酶染色試驗

王彥平等[12]用人工感染旋毛蟲的鼠和豬肌肉石蠟切片作抗原，用免疫酶染色試驗（IEST）診斷人和豬的旋毛蟲病均取得了很好的效果。朱名勝等[13]用IEST和斑點酶聯(lián)（Dot-ELISA）方法檢測感染旋毛蟲的豚鼠血清的特異性抗體，結(jié)果二者呈現(xiàn)較好的一致性。IEST法具有較高的靈敏度和特異性，操作方便，不需要特殊儀器，且抗原片可長期保存研究，為一種實用性強、有發(fā)展前景的方法。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗

旋毛蟲病是第一個應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法進(jìn)行診斷的蠕蟲病。ELISA法是目前檢測豬旋毛蟲病最敏感、最常用的方法，已被廣泛應(yīng)用于豬血清和肉汁樣品檢測。Ruitenberg等[14]最先將ELISA用于豬旋毛蟲病的檢測。Gamble等[15]首次用旋毛蟲肌幼蟲新陳代謝釋放的排泄分泌物抗原（ES）建立ELISA方法來診斷旋毛蟲病。我國張建安等[16]率先用ELISA方法檢測豬旋毛蟲。牛炳亨等[17]應(yīng)用建立的ELISA方法對豬旋毛蟲病人工感染及流行區(qū)現(xiàn)地豬血清IgG抗體進(jìn)行檢測，取得了較為滿意的結(jié)果。邵華斌等[18]應(yīng)用IHA與Dot-ELISA方法診斷豬旋毛蟲病。宗粵琦等[19]分別以旋毛蟲幼蟲粗抗原、表面抗原、S3抗原作包被抗原建立ELISA方法，在家兔感染后第7天均檢出了特異性抗體。張月清等[20]使用改良ELISA法（SPAELISA），將檢測時間縮短為20 min。喬壽齊等[21]采用建立的快速ELISA法對從內(nèi)蒙、河北、遼寧、吉林、山東、河南、北京、天津8省市屠宰的豬只隨意抽樣進(jìn)行了豬旋毛蟲抗體檢測，陽性率在0.35%～1.08%之間。宋明忻等[22]應(yīng)用單克隆抗體（McAb）快速ELISA診斷盒對感染了旋毛蟲的豬定期檢測其血清中抗體出現(xiàn)情況。結(jié)果在感染24 d后可在豬血清中檢出抗體。許應(yīng)天等[23]用Dot-ELISA法檢測旋毛蟲病犬血清中的特異性抗體，并與TSM和瓊脂擴散試驗（AGP）進(jìn)行了比較。該法的檢出率比AGP高15.92%，比TSM高18.37%。黃愛民等[24]采用鏡檢、集樣消化和ELISA法3種方法對2001—2003年共采集的9 196份肉樣和9 003份血清樣品進(jìn)行檢測，3種檢測方法檢測結(jié)果有較大的差異。陳曉英等[25]采用ELISA法調(diào)查了拉薩市、墨竹工卡、工布江達(dá)及林芝縣等地12個鄉(xiāng)鎮(zhèn)藏豬的前腔靜脈血樣1 440份，旋毛蟲的平均感染率為1.18%。吳秀萍等[26]采用ELISA檢測試驗豬感染旋毛蟲2個月內(nèi)不同天數(shù)的血清抗旋毛蟲IgM和IgG抗體水平，表明腸道期肌幼蟲、成蟲和肌幼蟲的ES抗原可用于檢測旋毛蟲的早期感染，成蟲和肌幼蟲的ES抗原可用于檢測出欄豬的旋毛蟲感染。蔡海松等[27]、陳春花等[28]、何光志等[29]先后以純化的融合蛋白p49/GST、重組抗原（TSRA）和Ts88為包被抗原，建立了檢測豬旋毛蟲抗體的間接ELISA方法，顯示出較好的優(yōu)勢。

2.6 膠體金免疫層析試紙條法

用試紙條診斷豬旋毛蟲病，特異性高，敏感性強，方法簡便，快速實用。溫艷等[30]用建立的膠體金一步法快診試紙條檢測感染旋毛蟲豬的血清及正常血清。楊俊興[31]用15 nm膠體金顆粒標(biāo)記抗旋毛蟲ES抗原單克隆抗體及旋毛蟲人工ES抗原，分別制成了檢測ES抗原和檢測抗體的豬旋毛蟲病快速診斷試紙條。鄧瑞廣等[32]分別采用快速試紙條法、快速ELISA法、常規(guī)鏡檢法和人工胃液消化法4種方法檢測1 566頭屠宰豬的豬旋毛蟲病。結(jié)果旋毛蟲檢出率分別為1.66%、1.66%、1.21%和1.60%，結(jié)果與ELISA方法相一致。李雁萍[33]制備的免疫層析試紙條更適合檢測肉汁中的旋毛蟲抗體。于海波[34]應(yīng)用膠體金標(biāo)記單克隆抗體A11和B13，將其制成試紙條并進(jìn)行大量檢測，達(dá)到了預(yù)期效果。

3 分子生物學(xué)診斷方法

血清學(xué)方法可以用來對豬旋毛蟲病監(jiān)測和流行病學(xué)進(jìn)行研究，但這些方法大多是用已知抗原來檢測待測抗體。然而，有時抗體的存在并不總與肌幼蟲出現(xiàn)的步調(diào)相一致。為了克服傳統(tǒng)的血清學(xué)方法的局限性，一些分子生物學(xué)技術(shù)，如常規(guī)PCR、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、PCR構(gòu)象多態(tài)性分析、PCR限制性片段長度多態(tài)性、多重PCR及實時熒光定量PCR等相繼已被開發(fā)用于檢測和診斷旋毛蟲感染。Caballero-Garcia等[35]用PCR方法對實驗感染小鼠進(jìn)行旋毛蟲病早期診斷，結(jié)果最早在感染后第3天檢測到旋毛蟲DNA。Tighe等[36]用RAPD技術(shù)對旋毛蟲基因組DNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同的旋毛蟲蟲株可得到不同的DNA擴增區(qū)帶。楊鵬欣等[37]以旋毛蟲的18sRNA基因為靶序列，建立了雙重PCR的液相基因芯片檢測方法。張子群等[38]用旋毛蟲隔離體線粒體LS-rRNA基因作為靶序列，設(shè)計合成引物和Taq man MGB探針應(yīng)用于對旋毛蟲的通用檢測。由于旋毛蟲本身及其在宿主體內(nèi)寄生部位的特殊性，使得難以在生前從被感染動物的血液及其他組織或排泄物中擴增到旋毛蟲DNA，因而用PCR等基因檢測技術(shù)對旋毛蟲病的生前檢測受到了限制。

4 小結(jié)

我國是世界上受旋毛蟲病危害最為嚴(yán)重的少數(shù)幾個國家之一。我國養(yǎng)豬業(yè)正迅猛發(fā)展，人們對豬肉及肉制品的質(zhì)量要求也越來越高。旋毛蟲病對于肉品衛(wèi)生影響嚴(yán)重，因此，控制和消滅豬旋毛蟲病顯得非常重要。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及在寄生蟲研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，豬旋毛蟲的診斷取得了較大進(jìn)展，這對當(dāng)前控制豬旋毛蟲病的感染提供了有效手段，但這些方法在操作程序上和適應(yīng)性方面還存在一定的不足。隨著人們對旋毛蟲抗原研究的深入及現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相信不久的將來具有較高的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，又簡便經(jīng)濟(jì)、適用性廣的診斷方法將會建立起來，對有效控制旋毛蟲病流行和進(jìn)行肉類和肉制品衛(wèi)生監(jiān)督，保障食品安全將發(fā)揮重要作用。

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2017-04-10)

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（SDAIT-08-17）

莊金秋（1978-），女，山東濰坊人，獸醫(yī)碩士，副研究員，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制。