酪氨酸酶催化氧化對(duì)絲素蛋白結(jié)構(gòu)與性能的影響

唐耿鐵， 王 平， 洪言情， 辛淑麗， 王 強(qiáng)， 范雪榮

(江南大學(xué) 生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

絲素蛋白具有良好的物理機(jī)械性能、生物相容性及可降解性，以絲素蛋白為原料可制備生物醫(yī)學(xué)和食品等領(lǐng)域中需要的凝膠、絲素膜及微膠囊材料[1-3]。為提高絲素蛋白材料的應(yīng)用性能，不同的絲素蛋白改性方法得到應(yīng)用：包括對(duì)側(cè)鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，與其他高分子共混，或通過(guò)分子工程改性加工等[4-6]。而生物酶法具有高效、專一和生態(tài)環(huán)保的優(yōu)勢(shì)，并在高分子材料加工中得到廣泛應(yīng)用。絲素蛋白中含有約10%的酪氨酸殘基[7]，可被多酚氧化酶(如酪氨酸酶)催化氧化，形成多巴及反應(yīng)性強(qiáng)的多巴醌結(jié)構(gòu)衍生物[8]，繼而可與含氨基的化合物發(fā)生親核反應(yīng)，這為基于酶法的絲素蛋白改性提供了可能。本文以酪氨酸酶進(jìn)行了絲素蛋白催化氧化，考察了酶促反應(yīng)過(guò)程中絲素氧化產(chǎn)物(多巴及醌類衍生物)濃度的變化，對(duì)酶促氧化反應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了探究，為絲素蛋白材料生物酶法功能改性奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

桑蠶絲織物，90 g/m2；酪氨酸酶(845 U/mg，美國(guó)Worthington Biochemical Corporation)；無(wú)水氯化鈣，無(wú)水乙醇，乙二胺，N-N二甲基甲酰胺(DMF)等(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙二胺鹽酸鹽，3-甲基-2苯并噻唑酮腙鹽酸鹽(MBTH)，阿拉丁試劑(上海)有限公司。

UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(SHIMADZU，日本)，F(xiàn)-4600熒光光度計(jì)(HITACHI，日本)，KDⅡ-0.05微機(jī)控制萬(wàn)能強(qiáng)力試驗(yàn)機(jī)(深圳市凱強(qiáng)利試驗(yàn)儀器有限公司)，D8 Advance型X-射線衍射儀(Bruker AXS，德國(guó))，SU1510掃描電子顯微鏡(HITACHI，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 絲素蛋白溶液制備

將脫膠的桑蠶絲織物以氯化鈣-乙醇體系(摩爾比CaCl2∶CH3CH2OH∶H2O =1∶2∶8)溶解，經(jīng)100℃處理2 h后冷卻至室溫，以去離子水透析3 d，經(jīng)離心去除雜質(zhì)后得到絲素蛋白溶液，以稱重法標(biāo)定其濃度。

1.2.2 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白反應(yīng)

在開(kāi)放體系中用酪氨酸酶催化氧化1%(w/v)絲素蛋白溶液，處理?xiàng)l件：酪氨酸酶17 U/mL、30℃、pH值7.0，處理時(shí)間8 h，空白樣中添加經(jīng)失活處理的酪氨酸值酶。

1.2.3 絲素蛋白膜制備

在1.2.2條件下用酪氨酸酶處理絲素蛋白溶液(4% ，w/v)，空白樣為同濃度的純絲素蛋白溶液。將2種溶液在聚四氟乙烯模具中流延成膜，在室溫下風(fēng)干成膜，或先經(jīng)-20℃冷凍5 h，再在-50℃下真空干燥24 h后得到冷凍干燥膜。

1.3 測(cè)試與表征

1.3.1 絲素溶液紫外分光分析

用UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定經(jīng)酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液及空白溶液在300 nm～500 nm范圍吸光度的變化。

1.3.2 絲素中多巴及多巴醌類氧化產(chǎn)物分析

多巴能與乙二胺鹽酸鹽反應(yīng)生成具有熒光性質(zhì)的縮合物，通過(guò)測(cè)定縮合物的熒光強(qiáng)度變化間接表征多巴的濃度變化。取20 μL的酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液，向其中加入70 μL乙二胺、50 μL乙二胺鹽酸鹽溶液(2 M，pH值11)和980 μL去離子水，50℃避光反應(yīng)2 h，自然冷卻后用F-4600熒光光度計(jì)掃描熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為420 nm和543 nm[9]。

多巴醌類物質(zhì)能與MBTH反應(yīng)形成粉色染料，實(shí)驗(yàn)中取480 μL酪氨酸酶催化的絲素蛋白溶液，980 μL DMF水溶液(4.3%，v/v)，580 μL MBTH溶液(20.7 mM)，混合均勻后在25℃反應(yīng)10 min，測(cè)定混合液在505 nm的吸光度[9]。

1.3.3 絲素蛋白游離氨基濃度

將1 mL酪氨酸酶處理后的絲素溶液加入含2 mL的0.5%(w/v)的茚三酮溶液比色管中，沸水煮20 min后冷卻15 min，再加入5 mL含0.2%(w/v) KIO3的乙醇稀釋液，混勻后用UV-1800測(cè)定569 nm處吸光度[5]。參照以不同濃度甘氨酸與茚三酮溶液制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.7698x-0.0013，其中y為569 nm吸光度；x為甘氨酸濃度，單位為μmol/mL)，計(jì)算出酶促反應(yīng)前后絲素蛋白溶液中的氨基濃度變化。

1.3.4 強(qiáng)力測(cè)試

將絲素蛋白風(fēng)干膜剪成70 mm×5 mm的長(zhǎng)條，使用萬(wàn)能強(qiáng)力試驗(yàn)機(jī)測(cè)定絲素膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線，計(jì)算斷裂強(qiáng)度、斷裂伸長(zhǎng)率，實(shí)驗(yàn)中拉伸速度20 mm/min，有效夾持長(zhǎng)度40 mm。

1.3.5 XRD

用D8 Advance型X-射線衍射儀對(duì)絲素蛋白冷凍干燥膜進(jìn)行X射線掃描，記錄2θ=4°～40°間的衍射強(qiáng)度曲線。測(cè)試條件：銅靶CuKα(λ=0.15406 nm)、管電壓40 kV、管電流40 mA、掃描速度為4°/min。

1.3.6 SEM

對(duì)冷凍干燥的絲素膜進(jìn)行噴金處理，應(yīng)用SU1510掃描電子顯微鏡觀察絲素膜的多孔形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素蛋白中酪氨酸殘基酶催化氧化產(chǎn)物分析

圖1 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白紫外可見(jiàn)光譜

以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白溶液，考察300～500 nm范圍內(nèi)溶液吸光度的變化，結(jié)果見(jiàn)圖1。與酪氨酸酶溶液、絲素溶液及含失活酶的絲素溶液相比，圖1中酶促氧化后絲素蛋白溶液在350 nm附近有明顯的吸收峰，其原因可能與酪氨酸酶催化氧化絲素中酪氨酸殘基形成醌類物質(zhì)相關(guān)[10]。酪氨酸酶能將絲素蛋白中的酪氨酸殘基(a)氧化成多巴(b)，然后多巴在酶催化下繼續(xù)轉(zhuǎn)化為多巴醌(c)，并與蛋白分子中氨基發(fā)生非酶參與的反應(yīng)，生成不同產(chǎn)物(d、e或f)，見(jiàn)圖2[8-9]。為研究酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白的反應(yīng)機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中考察了酶催化反應(yīng)時(shí)間與絲素溶液體系中多巴、多巴醌衍生物氧化產(chǎn)物含量的變化。

圖2 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白機(jī)理[8-9]

(a)酪氨酸酶催化絲素

(b) L-酪氨酸

如圖3(a)所示，絲素溶液中多巴含量總體上呈先增加，后下降的趨勢(shì)。酶催化氧化絲素中的酪氨酸殘基成多巴，使體系中多巴含量增加，同時(shí)多巴轉(zhuǎn)化成醌類衍生物又使體系中多巴濃度下降。當(dāng)酶處理時(shí)間超過(guò)120 min后，體系中多巴產(chǎn)物的新增速率下降，更多多巴轉(zhuǎn)化成醌類衍生物；隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，圖2中第3步非酶反應(yīng)產(chǎn)物的濃度增加，其中具有醌類結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物d使得多巴醌衍生物表觀含量增大，具有類多巴結(jié)構(gòu)的還原產(chǎn)物二酚化合物f使體系中測(cè)得的多巴表觀濃度略有增加。圖3(b)采用L-酪氨酸為模型物，對(duì)上述酶促絲素蛋白氧化及交聯(lián)機(jī)制進(jìn)行了對(duì)照分析，多巴濃度亦呈先增加后減小再增加的趨勢(shì)，多巴醌衍生物濃度達(dá)到峰值后持續(xù)下降，其原因可能是多巴醌在系列非酶反應(yīng)中被還原成類多巴二酚結(jié)構(gòu)(如5,6-二羥基吲哚)[11]。

2.2 酪氨酸酶催化氧化對(duì)絲素蛋白中游離氨基數(shù)的影響

絲素蛋白在酪氨酸酶催化氧化過(guò)程中生成的多巴醌能與氨基、巰基等親核性基團(tuán)發(fā)生非酶促反應(yīng)，促進(jìn)絲素蛋白分子自交聯(lián)[7]。絲素蛋白含一定量的氨基，通過(guò)測(cè)定酶催化體系中剩余氨基含量變化，可從一定程度上評(píng)價(jià)酶催化反應(yīng)中絲素蛋白分子自交聯(lián)情況。圖4考察了不同酶處理時(shí)間對(duì)體系中游離氨基含量的影響，結(jié)果表明隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，絲素蛋白溶液中游離氨基數(shù)逐漸減少，并且在480 min后漸趨緩和，表明在非酶反應(yīng)中生成的多巴醌與絲素上伯胺基發(fā)生反應(yīng)，促進(jìn)了絲素蛋白分子間的交聯(lián)。

圖4 酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白體系中氨基含量變化

圖5 酪氨酸酶處理對(duì)絲素風(fēng)干膜斷裂強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng)率影響

2.3 酪氨酸酶催化氧化對(duì)絲素蛋白膜強(qiáng)力的影響

將酶催化的絲素蛋白溶液鑄膜并室溫風(fēng)干，通過(guò)強(qiáng)力測(cè)試分析酪氨酸酶催化對(duì)絲素蛋白室溫風(fēng)干膜機(jī)械性能的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。與未經(jīng)酪氨酸酶處理的空白樣相比，經(jīng)酪氨酸酶處理后絲素膜斷裂強(qiáng)度增加，斷裂伸長(zhǎng)率下降較明顯，表明酪氨酸酶處理促進(jìn)了絲素蛋白分子間的交聯(lián)，提高了膜材料的力學(xué)性能。

2.4 XRD

為考察酪氨酸酶催化氧化對(duì)絲素蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，實(shí)驗(yàn)中以酶處理后的絲素溶液制備冷凍干燥膜，并進(jìn)行膜材料XRD測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖6。絲素蛋白在11.8°，22.0°處的衍射峰由ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)引起，在16.5°，20.2°，24.9°，30.90°，34.59°，40.97°和44.12°處的衍射峰由β-折疊結(jié)構(gòu)(SilkⅡ)引起[12]。從圖中可知，純絲素蛋白膜(1)在2θ=10°～12°有較弱的衍射峰，在2θ=20°～27°有較寬而強(qiáng)的衍射峰，說(shuō)明純絲素蛋白的冷凍干燥膜中ɑ-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)(SilkⅠ)、β-折疊結(jié)構(gòu)(SilkⅡ)并存，SilkⅡ的產(chǎn)生可能是由于冷凍過(guò)程中冰晶的剪切力引起的[13-14]。經(jīng)酪氨酸酶處理后制得的絲素蛋白膜在2θ=22°～24°有相對(duì)較窄的衍射峰，其二級(jí)結(jié)構(gòu)更趨于SilkⅠ結(jié)構(gòu)，說(shuō)明酪氨酸酶的對(duì)絲素蛋白的催化氧化引起了絲素蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。

圖6 冷凍干燥絲素膜的XRD曲線

圖7 冷凍干燥絲素膜的SEM圖

2.5 SEM

圖7顯示了經(jīng)過(guò)不同處理絲素溶液制成的冷凍干燥膜的SEM圖。純絲素蛋白膜和經(jīng)酶促氧化反應(yīng)制得的絲素膜都呈現(xiàn)了多孔的結(jié)構(gòu)，但純絲素蛋白的冷凍干燥膜的孔徑大而不規(guī)則，而經(jīng)酪氨酸酶處理的絲素蛋白冷凍干燥膜孔徑較為規(guī)則，表明酪氨酸酶對(duì)絲素蛋白催化氧化可能影響其在冷凍干燥過(guò)程中的孔隙結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

酪氨酸酶能將絲素蛋白中酪氨酸殘基先后氧化成多巴及多巴醌，反應(yīng)中多巴含量總體呈先增大后減小的趨勢(shì)，非酶反應(yīng)中多巴醌能與絲素蛋白中伯胺基反應(yīng)，使體系中醌類衍生物表觀含量明顯增加，類多巴二酚結(jié)構(gòu)產(chǎn)物略有增多。

絲素蛋白上的氨基與多巴醌的反應(yīng)促進(jìn)了絲素蛋白的自交聯(lián)，表現(xiàn)為絲素蛋白經(jīng)酪氨酸酶處理后，溶液中游離氨基數(shù)下降，制得的絲素室溫風(fēng)干膜的斷裂強(qiáng)度增加，斷裂伸長(zhǎng)率下降。

以酪氨酸酶催化氧化絲素蛋白，制得的冷凍干燥膜中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以SilkⅠ為主，膜多孔形態(tài)結(jié)構(gòu)可能受酶催化氧化影響。

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