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    TRPC1沉默對腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞遷移的影響

    2017-10-17 08:53:42張廣慧馮金洲郭振委何明利吳方榮
    關(guān)鍵詞:雙標陽性細胞腦缺血

    張廣慧, 馮金洲, 郭振委, 耿 閃, 何明利, 吳方榮

    TRPC1沉默對腦缺血大鼠神經(jīng)干細胞遷移的影響

    張廣慧1, 馮金洲2, 郭振委1, 耿 閃1, 何明利1, 吳方榮1

    目的探討瞬時受體電位通道1(TRPC1)沉默對腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、遷移和分化的影響。方法SD大鼠分為假手術(shù)組、腦缺血組、TRPC1沉默組(腦缺血+TRPC1沉默)和陰性對照組,以腦室內(nèi)注射siRNA沉默TRPC1,以線栓法制作大鼠大腦中動脈腦缺血(MCAO)模型,腦缺血模型制作成功后,腹腔內(nèi)注射Brdu標記內(nèi)源性神經(jīng)干細胞,分別于48 h、4 w后處死大鼠,行Brdu免疫組化染色、免疫熒光雙標染色(Brdu/GFAP、Brdu/Neun)觀察NSC的增殖、遷移和分化情況。結(jié)果腦缺血后48 h,腦缺血組和TRPC1沉默組SVZ區(qū)Brdu陽性表達均較假手術(shù)組明顯增多(P<0.01),但TRPC1沉默組Brdu陽性細胞數(shù)較缺血組低(P<0.01)。腦缺血4 w后,缺血組與假手術(shù)組相比,皮質(zhì)區(qū)具有更多的Brdu陽性細胞(P<0.01),同樣TRPC1沉默組Brdu陽性細胞數(shù)多于假手術(shù)組,但明顯低于腦缺血組(P<0.01);免疫熒光雙標染色發(fā)現(xiàn),腦缺血各組Brdu/GFAP、Brdu/Neun雙陽性細胞的數(shù)量均比假手術(shù)組明顯增高,但TRPC沉默組雙陽性細胞顯著少于腦缺血組和陰性對照組(P<0.01)。結(jié)論TRPC1沉默顯著影響腦缺血大鼠SVZ區(qū)NSC的增殖、向腦缺血區(qū)遷移及向成熟細胞的分化。

    腦缺血; 瞬時受體電位通道1; 神經(jīng)干細胞; 增殖; 遷移

    Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of transient receptor potential canonical 1(TRPC1) silencing on proliferation,migration and differentiation of endogenous neural stem cells(NSCs) after cerebral ischemia.MethodsSD rats were divided into sham group,cerebral ischemia group,TRPC1 silent group (cerebral ischemia + TRPC1 silence) and negative control group. siRNA was injected to intraventricular to silence TRPC1.Middle cerebral artery occlusion models were produced using the method of intraluminal monofilament. After cerebral ischemia models were made,endogenous neural stem cells were marked by intraperitoneal injection of Brdu. The rats were sacrificed after 48 hours and 4 weeks,then Brdu immunohistochemistry and immunofluorescence double staining (Brdu/GFAP,Brdu/Neun) were performed to observe the proliferation,migration and differentiation of NSCs.ResultsAt 48hours after cerebral ischemia,the Brdu expression in SVZ region of cerebral ischemia group and TRPC1 silent group increased significantly compared with the sham group (P<0.01),but the number of Brdu positive cells in TRPC1 silencing group were lower than the ischemic group (P<0.01 ). However,the number of Brdu positive cells were lower in TRPC1 blocking group than ischemia group (P<0.01). Four weeks after cerebral ischemia,there were more Brdu positive cells in the cortex in ischemia group and TRPC1 blocking group than sham group (P<0.01),but the number was significantly lower in TRPC1 blocking group than cerebral ischemia group (P<0.01). Double immunofluorescence staining found that,the numbers of Brdu/GFAP,Brdu/Neun double positive cells in all cerebral ischemia groups were significantly higher than the sham group. The numbers in TRPC1 silent group were significantly less than the cerebral ischemia group and negative control group (P<0.01).ConclusionTRPC1 silencing significantly affected the proliferation in SVZ,migration to cortex and differentiation into mature cells of NSCs after cerebral ischemia.

    Keywords: Cerebral ischemia; Neural stem cells; Proliferation; Migration

    研究表明,成年哺乳動物腦內(nèi)某些區(qū)域存在持續(xù)的神經(jīng)發(fā)生,在生理條件下,此處的神經(jīng)干細胞(neural stem cell,NSC)可分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞,承擔(dān)一定的生理功能[1]。腦缺血后腦室下(SVZ)區(qū)NSC增殖活躍,并向缺血區(qū)定向遷移,參與缺血后的神經(jīng)修復(fù)[2,3],這為腦缺血后缺損神經(jīng)元的修復(fù)帶來了新的曙光。然而,對于內(nèi)源性NSC的研究已持續(xù)了數(shù)十年,目前NSC對腦缺血后的修復(fù)作用研究仍未獲得突破,其中一個重要原因在于腦缺血后NSC向病灶區(qū)遷移的數(shù)量有限,難以填補大量神經(jīng)元缺血壞死所致的空缺,可見,提高NSC定向遷移的數(shù)量是內(nèi)源性NSC治療腦缺血的關(guān)鍵,而目前內(nèi)源性NSC定向遷移的機制尚不清楚,了解相關(guān)機制成為促進NSC定向遷移和神經(jīng)修復(fù)的首要解決的問題。

    最近發(fā)現(xiàn),瞬時受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1,TRPC1)在多種腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要的作用[4],但其誘導(dǎo)細胞遷移的機制及其在腦缺血后NSC的增殖和遷移過程中的作用未見報道;本研究擬通過沉默TRPC1的方法探討TRPC1在腦缺血后NSC增殖、定向遷移和分化中的作用,為探討內(nèi)源性NSC治療腦梗死提供理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 實驗動物 健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重250~280 g,購于徐州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。大鼠接受自然晝夜規(guī)律光照,飼養(yǎng)周圍環(huán)境溫度為25 ℃左右,大鼠自由飲水和攝食(所有大鼠于手術(shù)前12 h禁止進食,以防術(shù)中意外)。

    1.2 動物分組 取SD大鼠80只,隨機分為假手術(shù)組、腦缺血組、TRPC1沉默組和陰性對照組,以腦室內(nèi)注射siRNA沉默TRPC1,以線栓法制作大鼠大腦中動脈腦缺血(MCAO)模型,腦缺血模型制作成功后,腹腔內(nèi)注射Brdu標記內(nèi)源性神經(jīng)干細胞,其中40只大鼠48 h后處死,行Brdu免疫組化染色觀察NSC增殖情況;余下的40只大鼠4 w后處死行Brdu免疫組化染色、免疫熒光雙標染色(Brdu/GFAP、Brdu/Neun)觀察NSC的增殖、遷移和分化情況。

    1.3 siRNA沉默大鼠腦內(nèi)TRPC1基因 針對大鼠TRPC1 mRNA設(shè)計2條靶序列:5′GATCCCC GCATTCCAGG TTTCGTCTTGA TTCAAGAGA TCAAGA CGAAA CCTGGAATGCTTTTT3′,5′AGCTT AAAAA GCATTCC AGGTTT CGTCTTGA TCTCTTGAA TCAAGACGAAACCTGGAATGCGGG3′。siRNA模板由上海生工生物工程公司合成,根據(jù)Ambion公司體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(SilencerTM siRNA Construction Kit)說明書操作。大鼠在腦缺血前1 w,以水合氯醛麻醉,俯臥位固定大鼠頭部,局部消毒,于前囟后約10 mm,中線旁15 mm為中心,鉆磨鉆孔,以微量注射器自腦表面垂直進針35 mm,向腦室內(nèi)緩慢注射TRPC1 siRNA或陰性對照液20 μl。

    1.4 大鼠大腦中動脈模型的建立 參照Xu等的方法,以線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型[5]。操作步驟如下:以3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,取頸部正中切口,先后分離迷走神經(jīng)、右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,結(jié)扎頸外動脈遠端,并切斷之;在頸外動脈末端,插入4-0單股外科尼龍絲線,插入深度距離動脈分叉處約18 mm。用絲線扎緊線栓,縫合切口。假手術(shù)組僅分離出頸內(nèi)動脈,不插入栓子。

    1.5 BrdU標記及動物處理 (1)觀察內(nèi)源性NSC的增殖:大鼠于腦缺血后48 h處死,處死前1 d腹腔注射Brdu 50 mg/kg,共注射3次,每次間隔4 h。以4%的多聚甲醛灌注后取腦,然后放于4%多聚甲醛中進行后固定,石蠟包埋后制作石蠟切片,在前囟點正中前0.1~0.3 mm處收集10張10 μm厚切片。(2)觀察NSC遷移及分化情況:腦缺血后腹腔注射Brdu 50 mg/kg,2/d次,連續(xù)2 d。4 w后灌注取腦,放入4%多聚甲醛中固定,制作石蠟切片,在前囟點正中前0.1~0.3 mm處收集10張10 μm厚切片。

    1.6 BrdU免疫組化染色 切片分別以2 mol/L HCl 37 ℃孵育30 min,0.1 mol/L的硼酸緩沖液(pH 8.0)室溫10 min,0.1%的胰酶37 ℃孵育20 min,然后0.3% Triton X-100室溫20 min,3% H2O2室溫15 min,正常羊血清室溫下孵育20 min,甩干后鼠抗BrdU單克隆抗體(Chemicon,1∶100) 4 ℃過夜,再依次加入生物素化二抗工作液(北京中衫),室溫30 min;過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液,室溫30 min,DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片。

    1.7 免疫熒光雙標染色 切片經(jīng)HCl、胰酶等變性、抗原修復(fù)及血清封閉后,加入鼠抗BrdU 抗體(1∶100)和兔抗NeuN(博奧森公司,1∶50)或兔抗GFAP(博士德公司,1∶50)抗體,4 ℃過夜,加入TRITC標記的羊抗鼠IgG(博士德公司,1∶50)與FITC標記的羊抗兔IgG(博士德公司,1∶50)混合抗體,室溫孵育2 h,50%的緩沖甘油封片,熒光顯微鏡下觀察照相(Olympus)。

    1.8 免疫組化染色結(jié)果分析 免疫組化染色:以O(shè)lympus顯微鏡觀察并攝片,并在放大倍數(shù)(10×40)下,隨機選擇5個非重疊視野,以缺血側(cè)SVZ區(qū)、皮質(zhì)為觀察部位,每組10只動物,每只動物的每個部位隨機選取5張非連續(xù)切片,數(shù)出每個視野的陽性細胞數(shù)后計算每只大鼠所要分析部位的平均陽性細胞數(shù)。

    免疫熒光雙標染色:每只大鼠隨機抽取5張不同的腦片,在200倍熒光顯微鏡下,每張隨機選5個視野計數(shù)皮質(zhì)Brdu/NeuN、Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)。

    2 結(jié) 果

    2.1 TRPC1沉默對SVZ區(qū)NSC增殖的影響 BrdU陽性細胞為胞核染色,圓形、卵圓形,沿側(cè)腦室壁呈線樣排列(見圖1)。假手術(shù)組SVZ區(qū)可見少量的BrdU陽性細胞,排列較為稀疏,染色較淺;腦缺血組和陰性對照組SVZ區(qū)則見大量Brdu陽性細胞堆積,染色較深,與假手術(shù)組比較均有顯著性差異,(P<0.01)。TRPC1沉默組SVZ區(qū)Brdu陽性細胞數(shù)在腦缺血后也明顯升高(P<0.01),但顯著少于腦缺血組(P<0.01)(見表1,圖1)。

    2.2 TRPC1沉默對NSC遷移的影響 腦缺血后4 w,假手術(shù)組大鼠右側(cè)皮質(zhì)區(qū)只有少數(shù)Brdu陽性細胞,而腦缺血組、陰性對照組可見大量Brdu陽性細胞,與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(P<0.01),TRPC1沉默組右側(cè)皮質(zhì)區(qū)Brdu陽性細胞數(shù)較假手術(shù)組多(P<0.01),但明顯少于腦缺血組和陰性對照組(P<0.01)(見表1,圖2)。

    表1 各組大鼠SVZ和皮質(zhì)區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)

    與假手術(shù)組比較#P<0.01;與腦缺血組和陰性對照組比較*P<0.01

    A:假手術(shù)組;B:腦缺血組;C:TRPC1沉默組;D:陰性對照組

    圖1 大鼠SVZ區(qū)Brdu陽性細胞的表達(免疫組化×100)

    A:假手術(shù)組;B:腦缺血組;C:TRPC1沉默組;D:陰性對照組

    圖2 大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)Brdu陽性細胞的表達(免疫組化×100)

    2.3 TRPC1沉默對NSC分化的影響 免疫熒光雙標染色顯示,Brdu陽性細胞表現(xiàn)為紅色熒光,GFAP和Neun陽性細胞為綠色熒光;在假手術(shù)組,皮質(zhì)區(qū)只有少數(shù)的Brdu/Neun、Brdu/GFAP雙陽性細胞,腦缺血組和陰性對照組雙陽性細胞數(shù)明顯增多,與假手術(shù)組比較均有顯著性差異(P<0.01),TRPC1沉默組雙陽性細胞較腦缺血組和陰性對照組明顯減少,差異有顯著性意義(P<0.01)(見表2,圖3)。

    Brdu陽性細胞為紅色熒光,GFAP/Neun陽性細胞為綠色熒光。A、C:腦缺血組,分別為brdu/GFAP熒光雙標,brdu/Neun雙標;B、D:TRPC1沉默組,分別為brdu/GFAP熒光雙標,brdu/Neun雙標

    圖3 NSC在缺血皮質(zhì)內(nèi)的分化情況(免疫熒光雙標染色×200)

    組別Brdu/Neun陽性細胞Brdu/GFAP陽性細胞假手術(shù)組腦缺血組TRPC沉默組陰性對照組3.7±1.5616.6±4.01#9.7±3.30#*15.5±4.67#14.1±3.1851.6±9.96#37.8±7.33#*51.3±8.02#

    與假手術(shù)組比較#P<0.01;與腦缺血組和陰性對照組比較*P<0.01

    3 討 論

    瞬時受體電位通道1(transient receptor potential canonical 1,TRPC1)是非電壓依賴的介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流的跨膜蛋白,可被G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)的磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)信號通路激活。

    TRPC1在細胞的增殖及分化過程中起重要作用[6]。TRPC1基因敲除顯著降低血管內(nèi)皮祖細胞內(nèi)鈣庫操控的鈣離子的內(nèi)流,使內(nèi)皮祖細胞停滯在G1期,從而抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖[7]。siRNA介導(dǎo)的TRPC1沉默使非小細胞肺癌細胞停滯在G(0)/G(1)期,嚴重影響細胞的生長和增殖[8]。TRPC通道阻斷劑2-APB和SKF-96365可顯著抑制卵巢腫瘤細胞的增殖,而通過胰蛋白酶提高TRPC1通道的活性則明顯促進卵巢腫瘤細胞增殖,促進腫瘤細胞集落的生長[9]。由此可見,TRPC1對細胞增殖具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)沉默TRPC1后腦缺血大鼠SVZ區(qū)的NSC數(shù)量較單純腦缺血組明顯減少,提示TRPC1是腦缺血后NSC增殖活躍的一個重要因素。

    另外,TRPC1在細胞定向遷移中也發(fā)揮重要作用。Rao等將TRPC1基因轉(zhuǎn)染至腸上皮細胞,發(fā)現(xiàn)腸上皮細胞遷移能力顯著提高,反之,通過RNA干擾技術(shù)抑制TRPC1的表達則顯著削弱腸上皮細胞的遷移能力,嚴重阻礙受損的腸上皮的修復(fù);而且,TRPC1沉默可抑制受損的腸上皮細胞STIM1/TRPC1復(fù)合物的形成,減少鈣庫操控的鈣通道介導(dǎo)的鈣離子的內(nèi)流,從而抑制腸上皮細胞的遷移[10]。TRPC1還與多種腫瘤細胞的遷移和浸潤有關(guān);通過RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn),沉默鼻咽癌(25TNPC25T)25T細胞25T株25TCNE225T的TRPC1基因,能顯著降低細胞的粘附和侵襲能力,提示TRPC1可調(diào)控鼻咽癌細胞的轉(zhuǎn)移[11];Maroto等也發(fā)現(xiàn)TRPC1與前列腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān),抑制TRPC1的轉(zhuǎn)錄則使前列腺癌的轉(zhuǎn)移能力顯著減弱[12]。本研究發(fā)現(xiàn),腦缺血后4 w,腦缺血組缺血區(qū)Brdu陽性細胞明顯增多,這些細胞可能參與了損傷后的神經(jīng)修復(fù)作用;而TRPC1沉默組的腦缺血區(qū)Brdu陽性細胞較缺血組顯著減少,說明TRPC1沉默抑制了神經(jīng)干細胞向腦缺血區(qū)的遷移,從而阻止缺血后的神經(jīng)修復(fù)。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn),TRPC1沉默能夠顯著抑制腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖,并可能阻止新生的神經(jīng)干細胞向腦缺血區(qū)遷移,影響新生細胞的分化,從而阻礙了腦缺血大鼠的神經(jīng)恢復(fù)。

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    TheeffectsofTRPC1silencingonneurogenesisaftercerebralischemiaofrats

    ZHANGGuanghui,F(xiàn)ENGJinzhou,GUOZhenwei,etal.

    (DepartmentofNeurology,theFirstPeople’sHospitalofLianyungang,Lianyungang222002,China)

    1003-2754(2017)09-0782-04

    2017-07-15;

    2017-08-18

    中國博士后科學(xué)基金(No. 2016M601759);連云港市第一人民醫(yī)院博士科研啟動基金

    (1.連云港市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,江蘇 連云港 222002;2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,重慶 400016)

    吳方榮,E-mail:smart-123@163.com

    R743

    A

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