變溫對仿刺參（Apostichopus japonicus）免疫力及抗病力的影響

高楊

摘 要：水溫一直以來被認(rèn)為是影響仿刺參（Apostichopus japonicus）各項免疫指標(biāo)的重要環(huán)境因素。為了探討其對于仿刺參免疫力及抗病力的影響，首先對仿刺參進(jìn)行了兩組溫度突變試驗，分別為A組（11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃）和B組（18 ℃→11 ℃→4 ℃），取體壁、觸手、體腔液、內(nèi)臟四個不同組織，測定抗菌活力、超氧化物歧化酶（SOD） 、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）四個免疫指標(biāo)。隨后取B組溫度突變的條件，進(jìn)行攻毒感染試驗，計算發(fā)病率和死亡率。結(jié)果表明：（1）在A組溫度突變試驗中，各項免疫酶指標(biāo)一般在前兩輪的溫度突變中，差異不顯著（P<0.05），而到了第三輪的溫度突變時，體壁和觸手中免疫相關(guān)酶活性顯著上升（P<0.05）。（2）在B組溫度突變試驗中，刺參機(jī)體的免疫及其相關(guān)酶在最適生長溫度18 ℃下的活性較高，溫度突降至11 ℃其活性下降，再降至4 ℃后有所回升，但仍低于18 ℃下的免疫活性；觸手和體壁中免疫酶活性變化顯著（P<0.05），而體腔液和內(nèi)臟中免疫酶的活性變化不顯著（P<0.05）。（3）攻毒試驗結(jié)果顯示，溫度突變各組刺參發(fā)?。ㄍ履c及化皮率）及死亡率明顯高于正常組。由此表明，溫度突變作為一種環(huán)境脅迫，對于仿刺參的免疫力和抗病力產(chǎn)生重要的影響。體壁和觸手作為刺參免疫屏障的第一道防線，對于環(huán)境變化最為敏感。

關(guān)鍵詞：仿刺參（Apostichopus japonicus）；變溫；免疫力；抗病力

仿刺參（Apostichopus japonicus）屬于變溫動物，自身免疫力受環(huán)境影響大。溫度波動對刺參的生理活動及免疫反應(yīng)均具有重要影響[1]。目前有關(guān)溫度對仿刺參免疫力影響的研究，主要集中在降溫對仿刺參生長及生理現(xiàn)象的研究等方面[2-4]。如低溫使仿刺參耗氧量下降，出現(xiàn)負(fù)增長。不同群體仿刺參還出現(xiàn)排臟、皮膚潰爛（化皮）和死亡等現(xiàn)象。變溫對刺參免疫力及抗病力的影響還未見報道。

在本研究中，作者設(shè)計了兩組溫度突變實驗，并取體壁、觸手、體腔液、內(nèi)臟四個不同組織，進(jìn)行了抗菌活力、超氧化物歧化酶（SOD） 、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）四個免疫指標(biāo)的測定。隨后進(jìn)行攻毒試驗，統(tǒng)計發(fā)病率和死亡率。為深入并系統(tǒng)地研究環(huán)境因子對刺參免疫力及抗病力的影響提供了參考。目前認(rèn)為，機(jī)體抗病力的下降是導(dǎo)致發(fā)病死亡的主要原因之一。本研究有助于深入了解刺參免疫防御特性，為刺參苗種的健康養(yǎng)殖提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和條件

實驗所用幼參于2016年 3月6日取于大連黑石礁海域某海參養(yǎng)殖場，體長3～5 cm，平均體重2.60 g。取回后在60 cm×25 cm×40 cm玻璃水族箱內(nèi)暫養(yǎng)，養(yǎng)殖用水為鹽度29‰～32‰、pH 7.9～8.3、溫度17～19 ℃的大連黑石礁海域過濾海水。暫養(yǎng)期間進(jìn)行不間斷充氣、每日投飼、換水等日常管理，經(jīng)暫養(yǎng)一周無異?，F(xiàn)象，作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組

設(shè)計了兩組溫度突變組，每24 h溫度突變一次，每組6頭幼參，設(shè)置3個平行組。

A組： 11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃→11 ℃→4 ℃，由起始溫度11 ℃經(jīng)24 h后，將幼參直接轉(zhuǎn)到4 ℃下，共反復(fù)3次。

B組：18 ℃→11 ℃→4 ℃，由起始溫度18 ℃經(jīng)24 h后，將幼參直接轉(zhuǎn)到11 ℃，再經(jīng)24 h轉(zhuǎn)到4 ℃下。

控溫：將盛有2 L過濾海水的聚乙烯燒杯放入已調(diào)好溫度的可控溫生化培養(yǎng)箱中，24 h后，小心地把幼參移到下一個調(diào)節(jié)好溫度的燒杯中。

取樣：分別在每次溫度突變后的第1 h、12 h、24 h時每組隨機(jī)取幼參1頭，最后取3個樣品平均值。

1.2.2 樣品的制備

在冰盤上解剖取觸手、體壁、內(nèi)臟、體腔液，裝入樣品袋中，-80 ℃深冷冰箱中保存，備用。

觸手、體壁、內(nèi)臟分別稱重后，按1∶10（w/v）加入冷PBS緩沖液進(jìn)行勻漿，勻漿液移入1.5 mL離心管，離心。觸手、體壁在4 ℃、6 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃冷凍保存，備用；腸、體腔液在4 ℃、7 500 r/min 離心20 min，取上清，-80 ℃冷凍保存，備用。

1.2.3 免疫酶的測定

抗菌活力：采用Hultmaik等[5]方法在96孔酶標(biāo)儀中進(jìn)行。

超氧化物歧化酶（SOD）活力：采用南京建成生物醫(yī)藥公司的試劑盒測定。

堿性磷酸酶（AKP）：采用磷酸苯二鈉法[6-7]。以每100 μL樣品上清液在37 ℃與底物作用15 min，產(chǎn)生1 mg酚定義為一個酶活力單位。

酸性磷酸酶（ACP）：采用磷酸苯二鈉法[6-7]。以每100 μL樣品上清液在37 ℃與底物作用60 min，產(chǎn)生1 mg酚定義為一個酶活力單位。

蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮蘭試劑盒測定。

1.2.4 攻毒感染試驗

感染用實驗室分離獲得的3株對刺參有致病性的細(xì)菌（鑒定為弧菌屬細(xì)菌），分別編號為06021802（2#），050124201（8#），05040702（27#）。將三株菌在2216E斜面25 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后用無菌海水洗脫培養(yǎng)物并稀釋，制成菌懸液（濃度為7.5×107個/mL）。另取刺參分成4個試驗組，每組10頭，設(shè)置3個平行組。其中2組經(jīng)過B組溫度突變后，體腔注射0.1 mL菌懸液；取正常條件下暫養(yǎng)的幼參同時注射等量無菌海水。實驗水溫12～15 ℃。觀察并統(tǒng)計發(fā)病率和死亡率。

1.3 統(tǒng)計分析

所得試驗數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SE） 表示，以酶的比活力即每毫克蛋白中的酶活力進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用SPSS17.0進(jìn)行方差分析和Duncan多重檢驗。P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。endprint

2 結(jié)果

2.1 A組溫度突變對仿刺參免疫相關(guān)酶的影響

A組溫度突變對仿刺參免疫相關(guān)酶的影響如圖1所示。

注：同一次采樣組間標(biāo)有不同字母者表示差異顯著（ P<0.05 ） ，標(biāo)有相同字母者表示差異不顯著（ P>0.05）。a，b，c：同一溫度下的不同組織之間顯著差異（ P<0.05 ）；A，B，C：不同溫度下的同一組織之間的顯著差異（ P<0.05），下同。

2.2 B組溫度突變對仿刺參幼參免疫相關(guān)酶的影響

B組溫度突變對仿刺參免疫相關(guān)酶的影響如圖2所示。

2.3 溫度突變對仿刺參發(fā)病和死亡的影響

由表1可以看出，經(jīng)過溫度突變后的各組刺參發(fā)病率（吐腸及化皮率）及死亡率明顯高于正常組。其中，8#菌株的發(fā)病率和死亡率最高，死亡率為30%，可能與該菌株的毒力有關(guān)。27#和2#菌株感染組在感染15天后均無死亡，但從吐腸率和化皮率中的比較中發(fā)現(xiàn)，2#發(fā)病率大于27#菌株感染組。

3 討論

刺參作為外溫動物，溫度的變化會導(dǎo)致其內(nèi)環(huán)境溫度的改變，影響其機(jī)體代謝、細(xì)胞活動變化，免疫學(xué)上表現(xiàn)為抗菌活力、SOD、ACP、AKP活力的變化?？咕盍V泛存在于甲殼動物的血淋巴中，在免疫反應(yīng)中起重要作用。SOD是一種重要的抗氧化酶[8]，作為活性氧清除劑可清除體內(nèi)自由基，在防止衰老及防生物分子損傷等方面具有極為重要的作用。ACP是高等動物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝[9]。AKP是生物體內(nèi)的一種重要的代謝調(diào)控酶，直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移，參與鈣磷代謝，在脊椎動物的骨化作用中起重要作用。

環(huán)境因子變化是引起養(yǎng)殖生物應(yīng)激反應(yīng)使其免疫抗病能力下降的主要誘因[10]。其中溫度是重要的外界因素之一。本研究用抗菌活力、SOD、ACP和AKP的活性作為衡量刺參免疫力的指標(biāo)，分別做了三組實驗。

A組實驗結(jié)果顯示：在連續(xù)的水溫突變下，刺參幼參各組織的免疫指標(biāo)（除了抗菌活力外），在前兩輪11 ℃→4 ℃的溫度突變均顯示出較小幅度的波動變化，而到了第三輪11 ℃→4 ℃溫度突變時幼參機(jī)體中的免疫活性開始出現(xiàn)明顯波動。體壁、觸手中各項免疫酶指標(biāo)出現(xiàn)大幅度的升高并達(dá)到峰值，而內(nèi)臟和體腔液中各項免疫酶指標(biāo)變化不顯著?？咕盍t在第二輪的溫度突變時就出現(xiàn)大幅度的波動。由此分析，11 ℃與4 ℃之間持續(xù)突變對刺參幼參是一種環(huán)境脅迫，機(jī)體的免疫水平對此產(chǎn)生了相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)--上下波動，且在連續(xù)刺激一定時間以后波動幅度也有所上升。劉偉[11]等在研究溫度緩降和驟降對刺參非特異性免疫影響時，提出溫度刺激會對刺參機(jī)體產(chǎn)生損害，為了保護(hù)機(jī)體免受外界的損害，機(jī)體會產(chǎn)生較強的應(yīng)激反應(yīng)來對抗逆境。因此各項免疫酶指標(biāo)會產(chǎn)生變化。由此可以推測，若這種變溫刺激長時間持續(xù)下去，機(jī)體的免疫水平可能會受影響。

B組實驗結(jié)果顯示：幼參機(jī)體在最適生長溫度18 ℃下的免疫及其相關(guān)酶活性（抗菌活力、SOD、AKP、ACP）較高，隨溫度突降至11 ℃其活性下降，再降至4 ℃后有所回升，但仍低于18 ℃下的免疫活性。且觸手和體壁酶活力較高，波動較為明顯，內(nèi)臟和體腔液中免疫酶活力變化不大。分析其原因，可能是由于18 ℃是幼參最佳生理狀態(tài)和免疫活性的合適溫度，這一結(jié)果與董云偉等[12]的研究結(jié)果相一致，因此各項免疫酶活力較高。當(dāng)溫度突降至11 ℃，導(dǎo)致機(jī)體的生理功能和免疫防御能力下降，自由基代謝紊亂。再降至4 ℃，各項免疫酶活力略微上升，可能是免疫適應(yīng)的結(jié)果。Yang[13]等在研究水溫對刺參生長和攝食的影響時，發(fā)現(xiàn)低溫會導(dǎo)致刺參體重下降和攝食緩慢。Vondracek[14]等研究發(fā)現(xiàn)變溫會影響水生生物的代謝。因此降溫作為一種環(huán)境刺激，會引起刺參機(jī)體免疫力的下降。而且兩組試驗結(jié)果顯示，刺參在對溫度脅迫的響應(yīng)中，觸手和體壁的免疫酶活性較高且變幅大，這與李華[15]等在研究仿刺參不同組織中免疫相關(guān)酶的活性及其周年變化時，對于正常刺參成體的研究結(jié)果一致，而體腔液和內(nèi)臟樣品中的免疫相關(guān)酶的活性變幅小。究其原因，可能是由于體壁和觸手是抵御外來刺激的第一道防御屏障，對外界環(huán)境的變化比較敏感；但內(nèi)臟中免疫酶的變化，需要一定時間的響應(yīng)，因此變化不顯著。

弧菌是刺參腐皮綜合癥的致病菌，對刺參養(yǎng)殖危害嚴(yán)重[16]。本研究的攻毒實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過3天的溫度突變（18 ℃→11 ℃→4 ℃）后，再進(jìn)行菌株感染。發(fā)現(xiàn)溫度突變組，發(fā)病死亡率明顯升高；而正常溫度組，發(fā)病死亡率變化不大。說明溫度突變作為一種環(huán)境脅迫，對刺參幼體抗病力造成了一定的影響?？共×κ欠从硻C(jī)體免疫功能狀態(tài)的綜合性評價指標(biāo)。這樣的脅迫雖從刺參外表看不出異常，但對刺參幼體抗病力造成了一定的影響。

低溫會使仿刺參幼參出現(xiàn)活動減弱，停止攝食等現(xiàn)象。而且長時間的低溫變化會引起仿刺參幼體的皮膚潰爛、排臟或死亡[17]，但低溫對仿刺參生理影響還沒有相關(guān)報道。Winton Cheng[18]等在研究溫度變化對羅氏沼蝦抗病力的影響時，發(fā)現(xiàn)高溫會引起抗病力的下降。陳家長[19]等在研究溫度脅迫對羅非魚抗病力影響時，也得出高溫引起抗病力下降的結(jié)論。因此，變溫作為一種環(huán)境刺激，會導(dǎo)致抗病力的變化。

4 結(jié)論

綜上所述，在A組試驗中，免疫酶活力上升，體壁觸手變化較顯著；由此說明，快速而連續(xù)的溫度波動，作為一種環(huán)境刺激，會引起仿刺參機(jī)體的免疫反應(yīng)，增強仿刺參的非特異性免疫力。B組的試驗，免疫酶出現(xiàn)急劇下降后略微上升的趨勢，體壁觸手波動顯著；持續(xù)的降溫，會使仿刺參非特異性免疫力下降，攻毒試驗進(jìn)一步證明，與對照組相比，經(jīng)過溫度突變處理后，抗病力明顯下降。由此說明，溫度的刺激，作為一種環(huán)境脅迫，能夠引起仿刺參的非特異性免疫力下降，而且抗病力也下降。

因此在養(yǎng)殖和運輸過程中，應(yīng)盡量避免溫度大幅度變化和持續(xù)波動，室外養(yǎng)參池應(yīng)注意在變溫季節(jié)及時調(diào)節(jié)水深以控制水溫，防止因溫度變化幅度過大或波動，影響刺參的正常生理功能，進(jìn)而影響機(jī)體免疫力。endprint

參考文獻(xiàn)：

[1]

Dong Y，Dong S，Ji T.Effect of different thermal regimes on growth and physiological performance of the sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka[J].Aquaculture，2008，275（1）：329-334.

[2] 王曉燕，常亞青，丁君，等.降溫對刺參免疫酶，可溶性蛋白及可溶性糖影響的初步研究[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報，2012，2（4）：44-49.

[3] 董云偉，董雙林.刺參對溫度適應(yīng)的生理生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009 （5）：908-912.

[4] 趙斌，李成林，胡煒，等.低溫對不同規(guī)格刺參幼參生長與耗氧率的影響[J].海洋科學(xué)，2011（12）：88-91.

[5] Hultmark D，Steiner H，Rasmuson T，et al.Insect immunity.Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia[J].European Journal of Biochemistry，1980，106（1）：7-16.

[6] Coffaro K A，Hinegardner R T.Immune response in the sea urchin Lytechinus pictus[J].Science （New York，NY），1977，197（4311）：1389.

[7] Coffaro K A.Transplantation immunity in the sea urchin[D].University of California，Santa Cruz.，1979.

[8] 劉衡，李光友.免疫多糖對養(yǎng)殖南美白對蝦作用的研究[J].海洋與湖沼.1998，29（2）：113-118

[9] 王淑紅，王藝?yán)?，張朝霞，?弧菌和大腸桿菌感染對雜色鮑無細(xì)胞血淋巴中幾種酶活力的影響[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004（1）：37-40.

[10] Le Moullac G，Haffner P.Environmental factors affecting immune responses in Crustacea[J].Aquaculture，2000（191）：121-131.

[11] 劉偉，常亞青，丁君，等.溫度緩降和驟降對刺參“水院 1 號”和大連養(yǎng)殖群體非特異性免疫影響的初步研究[J].水產(chǎn)學(xué)報，2013，37（9）：1343-1348.

[12] 董云偉，董雙林，張美昭，等.變溫對刺參幼參生長、呼吸代謝及生化組成的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報，2005，29（5）：659 -665.

[13] Yang H，Yuan X，Zhou Y，et al.Effects of body size and water temperature on food consumption and growth in the sea cucumber Apostichopus japonicus （Selenka） with special reference to aestivation[J].Aquaculture Research，2005，36（11）：1085-1092.

[14] Vondracek B，Cech Jr J J，Buddington R K.Growth，growth efficiency，and assimilation efficiency of the Tahoe sucker in cyclic and constant temperature[J].Environmental Biology of Fishes，1989，24（2）：151-156.

[15] 李華， 陳靜， 陸佳， 等. 仿刺參體腔細(xì)胞和血細(xì)胞類型及體腔細(xì)胞數(shù)量研究[J]. 水生生物學(xué)報， 2009， 33（2）： 205-213.

[16] 張春云，王印庚，榮小軍.養(yǎng)殖刺參腐皮綜合征病原菌的分離與鑒定[J].水產(chǎn)學(xué)報，2006，30（1） ：118-123.

[17] 李寶泉，楊紅生，張濤，等.溫度和體重對刺參呼吸和排泄的影響[J].海洋與湖沼，2002，33（2）：182-187.

[18] Cheng W，Chen S M，Wang F I，et al.Effects of temperature，pH，salinity and ammonia on the phagocytic activity and clearance efficiency of giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii to Lactococcus garvieae[J].Aquaculture，2003，219（1）：111-121.

[19] 陳家長，臧學(xué)磊，瞿建宏，等.溫度脅迫下羅非魚 （GIFT Oreochromis niloticus） 機(jī)體免疫力的變化及其對海豚鏈球菌易感性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，30（9）：1896-1901.endprint