外源酶對六堡茶渥堆過程中色素轉(zhuǎn)化規(guī)律影響

張芬，溫立香，黃欣欣，彭靖茹，何梅珍，林家威，黃壽輝，檀業(yè)維，黃俊達(dá)

（1．廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧530001；2．廣西壯族自治區(qū)梧州茶廠，廣西 梧州543002）

外源酶對六堡茶渥堆過程中色素轉(zhuǎn)化規(guī)律影響

張芬1，溫立香1，黃欣欣1，彭靖茹1，何梅珍2，林家威2，黃壽輝1，檀業(yè)維1，黃俊達(dá)2

（1．廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧530001；2．廣西壯族自治區(qū)梧州茶廠，廣西 梧州543002）

通過在六堡茶渥堆過程添加纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶及過氧化物酶，研究外源酶對干茶色澤變化和茶葉中茶黃素、茶紅素及茶褐素轉(zhuǎn)化規(guī)律的影響及其與茶多酚含量的相關(guān)性，旨在為縮短六堡茶的渥堆時間和提高六堡茶的品質(zhì)提供理論依據(jù)。結(jié)果表明：果膠酶在六堡茶渥堆的前期可以顯著提高茶黃素含量及促進(jìn)茶湯色澤的加深，而渥堆的后期能夠提高茶紅素和茶褐素的含量，第10天時，茶黃素含量是空白樣的2.23倍，第20天時茶紅素含量是空白樣的4.32倍，渥堆結(jié)束時茶褐素含量比空白樣提高29.66%；木瓜蛋白酶在渥堆15天后能迅速增加茶褐素的含量及促進(jìn)干茶色澤的加深；過氧化物酶在渥堆前期可以顯著提高茶褐素的含量，在渥堆的中期提高茶黃素含量的效果較明顯，第15天時，茶黃素含量提高64.29%；纖維素酶能夠降低茶紅素轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)的速度。此外，茶紅素含量與茶多酚含量呈正相關(guān)的線性關(guān)系，而茶褐素含量與茶多酚含量呈指數(shù)函數(shù)關(guān)系。因此，果膠酶、過氧化物酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶對六堡茶渥堆過程中色素的轉(zhuǎn)化影響明顯。

六堡茶；渥堆；外源酶；茶葉色素

Abstract：The paper studied on the effect of exogenous enzymes on the change of color of dry tea，tea pigments and their relevance to the content of tea polyhenol by adding cellulase，pectinase，papain and peroxidase during pile-fermentation processing of Liu Pao tea，providing a theoretical basis for reducing time of pile-fermentation and improving the quality of Liu Pao tea.The result indicated that pectinase could increase the content of theaflavins（TF）and deepen the color of tea soup in pre-pile-fermentation，and it could increase the contents of thearubigins（TR）and theabrownin（TB）in post-pile-fermentation.At the 10th d of pile-fermentation，the content of theaflavins（TF）was 2.23 times than blank sample，the content of thearubigins（TR）increased was 4.32 times than blank sample in post-pile-fermentation，the content of theabrownin（TB）increased by 29.66%at end of pile-fermentation.Papain could rapidly increase the content of theabrownin（TB）after the 15th d of pile-fermentation and deepen the color of dry tea.Peroxidase could obviously increase the content of theabrownin（TB）in pre-pile-fermentation and the content of theaflavins（TF）in the medium pile-fermentation，at 15th d of pile-fermentation，the content of theaflavins （TF）increased by 64.29%.Cellulase could reduce the speed of thearubigins（TR）converted into other substances.Besides，the contents of thearubigins（TR）and tea polyphenol had a linear function，the contents of theabrownin （TB）and tea polyphenol had a exponential relationship.So the effects of pectinase，papain，peroxidase and cellulase on change of tea pigments were significantly during pile-fermentation processing of Liu Pao tea.

Key words：Liu Pao tea；pile-fermentation；exogenous enzymes；tea pigments

六堡茶因產(chǎn)自于梧州蒼梧縣六堡鎮(zhèn)而得名，以其獨特的檳郎香而位列全國二十四名茶[1]，其采用廣西地方性的群體種茶樹鮮葉，經(jīng)獨特的傳統(tǒng)工藝加工而成，其中渥堆工序是制作六堡茶的關(guān)鍵工藝[2]。黑茶渥堆是利）用微生物活動產(chǎn)熱而形成的濕熱作用及其分泌胞外酶的催化作用，形成黑茶特有的色香味[3-7]。其中多酚類物質(zhì)通過酶促氧化及自動氧化形成水溶性色素和部分脂溶性色素，水溶性色素包括茶黃素（TF）、茶紅素（TR）和茶褐素（TB），而這 3種色素是形成黑茶湯色的主要成分[8]。

外源酶指不屬于制品本身所固有的外加酶類，主要從茶鮮葉、茶幼果及其他植物或其愈傷組織中提取得到，也有些是從培養(yǎng)的微生物中獲得[9]，20世紀(jì)70年代酶工程技術(shù)開始應(yīng)用于茶葉領(lǐng)域。目前，多酚氧化酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等多種外源酶已經(jīng)應(yīng)用于各類茶葉的加工過程中[10-14]，以達(dá)到增加茶葉香氣、改善茶葉品質(zhì)及縮短加工時間的目的。而六堡茶作為廣西的歷史名茶，其渥堆工藝仍然采用傳統(tǒng)的加工方式，存在耗時長、勞動強(qiáng)度大、衛(wèi)生條件差等亟需解決的問題[15]。目前，尚未有關(guān)于外源酶應(yīng)用于六堡茶渥堆工藝的研究報道。本文通過在六堡茶渥堆過程中添加不同類型的外源酶，研究不同的外源酶對干茶色澤和茶黃素、茶紅素、茶褐素在六堡茶渥堆過程中變化規(guī)律的影響以及這3種色素含量與茶多酚含量之間的關(guān)系，旨在為縮短六堡茶渥堆時間和改善六堡茶品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑毛茶采用云南大葉種鮮葉經(jīng)初制加工而成；渥堆試驗于2016年9月份在梧州茶廠進(jìn)行。

過氧化物酶（100 U/mg）：湖北佳諾信生物化工有限公司；木瓜蛋白酶（200 U/mg）、纖維素酶（20 U/mg）、果膠酶（30 U/mg）：南寧龐博生物化工有限公司；福林酚、草酸、碳酸氫鈉（均為分析純）：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；甲醇、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙腈（色譜純）：國藥試劑化學(xué)有限公司；沒食子酸（GA純度＞99%）：美國sigma公司。

1.2 儀器和設(shè)備

YF-6CHF-18茶葉發(fā)酵機(jī)：永鋒茶葉機(jī)械有限公司；UV/V-1800型紫外/可見光分光光度計：上海美譜達(dá)儀器有限公司；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋：河南省金壇市醫(yī)療儀器廠；FW-100高速萬能粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；SHZ-DШ循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CP-∏4電子天平（0.000 1 g）：上海奧豪斯儀器有限公司；Master-S15純水儀：上海和泰儀器有限公司；TDL-40B型離心機(jī)：北京壓力恩科學(xué)器材公司；CR-400色差儀：日本柯尼卡美能達(dá)公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗樣品的制備

利用去離子水把纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、過氧化物酶分別配制成濃度為500、250、250、20 U/mL的溶液。按照液葉比為1∶10（g/mL）的比例將4種配制的酶液和空白去離子水分別噴灑在15 kg的黑毛茶上，混勻，裝入竹簍中，每個試驗重復(fù)3次。將發(fā)酵機(jī)的溫度設(shè)置為35℃，濕度設(shè)置為80%，把竹簍放入發(fā)酵機(jī)內(nèi)，保持茶葉含水量為20%～25%，每隔4天翻堆一次。發(fā)酵之日起第 0、5、10、15、20、25 天取樣，自然晾干即為試驗樣品。

1.3.2 茶黃素、茶紅素、茶褐素及茶多酚含量測定方法

茶多酚含量測定：參照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》；茶黃素、茶紅素和茶褐素含量測定：采用系統(tǒng)分析法[16]。每個樣品測定3次。

1.3.3 干茶色度測定方法

把試驗樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過孔徑為800 μm的篩子，用CR-400色差儀進(jìn)行測定，每個試驗樣品測定3次。測定采用D65光源，在20℃的室溫下測定；試驗采用Hunter Lab色系統(tǒng)，此系統(tǒng)中，L是明度變量，a和b是色品坐標(biāo)，a表示從洋紅色至綠色的范圍，b表示從黃色至藍(lán)色的范圍。L的值域為0～100，L=50時，就相當(dāng)于50%的黑；a和b的值域都是+127至-128，其中+127a是紅色，漸漸過渡到-128a的時候變成綠色；同理+127b代表黃色，-128b代表藍(lán)色，所有的顏色都是由這3個值交互變化組成[17]。

1.4 統(tǒng)計分析

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。

2 結(jié)果和分析

2.1 外源酶對六堡茶在渥堆過程中茶葉色素轉(zhuǎn)化規(guī)律的影響

黑茶在渥堆過程中，在濕熱作用以及微生物分泌的胞外酶的催化作用下，茶葉中酚類物質(zhì)被氧化為極不穩(wěn)定的鄰醌，鄰醌又形成黃烷醇類和次級氧化產(chǎn)物茶黃素等，隨著渥堆的繼續(xù)進(jìn)行，這些物質(zhì)進(jìn)一步氧化生成茶紅素及茶褐素，使茶湯的色澤逐步加深[18]。外源酶對六堡茶在渥堆過程中茶葉色素含量的變化影響見表1。

表1 外源酶對六堡茶在渥堆過程中茶色素含量變化的影響Table 1 The effect of exogenous enzymes on change of content of three pigments during pile-fermentation of Liu Pao tea

如表1所示，六堡茶在渥堆過程中，茶黃素累積較少，其含量在0.031%～0.086%的范圍內(nèi)，并且變化的規(guī)律不明顯。整個渥堆過程中果膠酶提高茶黃素含量的效果優(yōu)于其他酶類，特別是在第10天，其茶黃素含量是空白樣2.23倍，過氧化物酶在渥堆第15天時，其茶黃素含量比空白樣提高64.29%。茶紅素的含量隨著渥堆時間的增加而大幅度降低，由初始的2.272%降低到渥堆結(jié)束時的0.130%～0.270%，在渥堆第15天時過氧化物酶降低茶紅素的效果最為明顯，其茶紅素含量比空白降低了60.78%；果膠酶和纖維素酶能夠降低茶紅素轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)的速度從而使其添加樣中茶紅素含量高于空白樣，渥堆第20天時，添加果膠的樣品中茶紅素含量是空白樣的4.32倍，添加纖維素的樣品中茶紅素含量是空白樣的2.18倍；木瓜蛋白酶對茶紅素含量變化規(guī)律的影響不明顯。茶褐素在渥堆過程中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，其含量由開始時的0.901%增加到結(jié)束時的2.316%～3.082%，過氧化物酶在渥堆第5天時提高茶褐素含量的效果較為顯著，其茶褐素的含量比空白樣提高27.82%，而果膠酶和木瓜蛋白酶在15 d后能迅速增加茶褐素的含量，渥堆結(jié)束時茶褐素的含量比空白樣分別提高29.66%和33.07%。

2.2 外源酶對茶湯色澤在六堡茶渥堆過程中變化的影響

研究表明水溶性色素茶黃素、茶紅素和茶褐素是影響黑茶湯色的主要物質(zhì)，茶黃素、茶紅素和茶褐素分別是構(gòu)成茶湯“亮”、“紅”、“褐”的主要成分[19]。茶黃素和茶紅素的含量的總和與茶褐素含量比值大小即（TF+TR）/TB值是影響茶湯色澤的主要因子，比值越小，湯色越深[20]。而茶湯色澤的深淺是判斷黑茶渥堆程度的重要依據(jù)[21]。

六堡茶渥堆過程中添加外源酶對茶湯色澤變化的影響如圖1所示。

圖1 外源酶對六堡茶渥堆過程中茶湯色澤變化的影響Fig.1 The effect of exogenous enzyme to change of color of tea soup during pile-fermentation of Liu Pao tea

由圖1可知，茶湯色澤隨著渥堆時間的增加而逐漸加深，（TF+TR）/TB比值由開始的2.58減少到渥堆結(jié)束時的0.07～0.12，渥堆0 d～10 d內(nèi)，茶湯色澤急劇加深，可見，六堡茶的渥堆過程中TB大量形成，對六堡茶的湯色紅褐品質(zhì)的形成有著至關(guān)重要的作用，隨著渥堆時間的增加，（TF+TR）/TB比值趨向于一致。渥堆5 d后，添加果膠酶可以使（TF+TR）/TB比值增大，即果膠酶可以促進(jìn)茶湯色澤的加深，特別是在第10天時，（TF+TR）/TB較空白樣增大76.11%，其它酶類的作用不明顯。

2.3 干茶色澤分析

利用色差儀對不同渥堆天數(shù)的干茶進(jìn)行色澤測定，測定結(jié)果見表2。

表2 六堡茶在渥堆過程中干茶色澤變化規(guī)律Table 2 The change of colors of dry tea during pile-fermentation of Liu Pao tea

如表2所示，六堡茶在渥堆過程，L值總體上呈現(xiàn)先減小后增大再減小的趨勢，即渥堆過程中干茶色澤上的明度變化方向并不是一成不變的，渥堆開始時L值最大，為56.04，結(jié)束時L值達(dá)到最小，為40.67～44.36，渥堆15 d～20 d，木瓜蛋白組比空白組的L值小，即添加木瓜蛋白酶可以促進(jìn)干茶色澤的加深；a值在渥堆過程中逐漸增大，由開始時的-0.56增加到渥堆結(jié)束時的3.62～4.60，即在渥堆過程中干茶色澤由綠色向紅色轉(zhuǎn)變，添加外源酶可以減小干茶色澤由綠色向紅色轉(zhuǎn)變的速度，特別是添加過氧化物酶；b值在渥堆過程中先減小后增加再減小的趨勢，渥堆10 d后，纖維素酶可以增大b值，而過氧化物酶、木瓜蛋白酶和果膠酶則可以減小b值。

2.4 茶紅素和茶褐素含量與茶多酚含量的相關(guān)性研究

茶多酚是在茶湯中呈苦澀味且有較強(qiáng)的刺激性的活性物質(zhì)，是影響茶湯滋味的重要物質(zhì)[22]。黑茶渥堆過程中通過微生物活動產(chǎn)生的濕熱作用及酶促作用下，茶多酚特別是呈現(xiàn)苦澀味的兒茶素經(jīng)過氧化、轉(zhuǎn)化、縮合等復(fù)雜的過程形成水溶性色素，而茶葉中水溶性色素主要指茶黃素、茶紅素、茶褐素，這三者是構(gòu)成茶湯色澤的主要成分，所以茶湯的色澤可以體現(xiàn)出多酚類物質(zhì)的氧化程度，因而一般制茶做色程度的深淺是以多酚類化合物為依據(jù)的[23-27]。茶黃素、茶紅素及茶褐素的含量應(yīng)與茶多酚含量有密切的聯(lián)系。

由于六堡茶渥堆過程中茶黃素含量比較穩(wěn)定，與茶多酚含量的相關(guān)性不明顯，本文暫不討論。為了研究六堡茶渥堆過程中茶紅素和茶褐素的含量與茶多酚含量的相關(guān)性，以茶多酚含量X為自變量，以茶葉色素含量Y為因變量進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 茶葉色素含量與茶多酚含量線性回歸分析Table 3 The analyze of linear regression of content of tea pigments and tea polyphenol

如表3所示，茶紅素的含量與茶多酚含量呈現(xiàn)線性關(guān)系，且正相關(guān)，即茶紅素在六堡茶在渥堆過程中隨著茶多酚含量的減少而減少?？瞻讟蛹疤砑永w維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和過氧化物酶試驗樣線性關(guān)系系數(shù) R2分別是 0.985、0.905、0.819、0.935、0.938。而茶褐素的含量在六堡茶渥堆過程中隨著茶多酚含量的減少而增加，且呈現(xiàn)指數(shù)函數(shù)關(guān)系，并不呈現(xiàn)簡單的線性關(guān)系，這可能因為茶褐素并不僅僅由茶多酚簡單氧化、聚合而成，而是茶多酚及其氧化產(chǎn)物與氨基酸、糖類、沒食子酸、咖啡因等物質(zhì)反應(yīng)生成[28]，空白樣及添加纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和過氧化物酶試驗樣指數(shù)函數(shù)關(guān)系系數(shù)R2分別是0.932、0.890、0.813、0.948、0.910。

3 結(jié)論

六堡茶在渥堆過程，茶黃素含量比較穩(wěn)定，茶紅素含量逐漸減少，而茶褐素含量逐漸增加，（TF+TR）/TB的比值也呈現(xiàn)減少的趨勢，即茶湯色澤逐漸加深。干茶的L和b值呈現(xiàn)先減小后增大再減小的趨勢，a值逐漸增大。茶紅素含量與茶多酚含量呈現(xiàn)正相關(guān)的線性關(guān)系，而茶褐素含量與茶多酚含量呈現(xiàn)指數(shù)函數(shù)的關(guān)系。在渥堆的某一階段，果膠酶不僅可以提高茶葉中茶黃素、茶紅素及茶褐素的含量，并且能促進(jìn)茶湯色澤加深，纖維素酶可以降低茶紅素轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)的速度從而提高茶紅素含量，而木瓜蛋白酶可以增加茶褐素的含量及促進(jìn)干茶色澤的加深，過氧化物酶在渥堆前期可以提高茶褐素的含量及促進(jìn)干茶色澤轉(zhuǎn)化。綜上所述果膠酶、木瓜蛋白酶、過氧化物酶和纖維素酶在一定程度上能夠提高茶湯中色素的含量或促進(jìn)干茶色澤的轉(zhuǎn)化，因此可以應(yīng)用于六堡茶的渥堆工序中，進(jìn)而達(dá)到縮短六堡茶渥堆時間和改善茶葉品質(zhì)的目的。

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Effect of Exogenous Enzymes on the Change of Tea Pigments during Pile-fermentation Process of Liu Pao Tea

ZHANG Fen1，WEN Li-xiang1，HUANG Xin-xin1，PENG Jing-ru1，HE Mei-zhen2，LIN Jia-wei2，HUANG Shou-hui1，TAN Ye-wei1，HUANG Jun-da2
（1.Guangxi Subtropical Crops Research Institute，Nanning 530001，Guangxi，China；2.Guangxi Wuzhou Tea Factory，Wuzhou 543002，Guangxi，China）

2017-03-18

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.014

廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所專項資金項目（桂熱研201601）；廣西壯族自治區(qū)科技專項（桂科AB 16380191）

張芬（1985—），女（漢），助理研究員，碩士研究生，研究方向：茶葉加工及茶樹栽培育種。