新疆部分地區(qū)牛源空腸彎曲菌分離鑒定及耐藥性分析

代 婧，彭 斌，雷程紅，阿熱阿依·海依拉提

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

新疆部分地區(qū)牛源空腸彎曲菌分離鑒定及耐藥性分析

代 婧，彭 斌，雷程紅，阿熱阿依·海依拉提

(新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052)

目的研究新疆部分地區(qū)?？漳c彎曲菌污染及耐藥性。方法從烏魯木齊、昌吉、石河子3個地區(qū)共采集牛肛拭子171份。用布氏肉湯初步增菌后，用改良CCD瓊脂基礎和哥倫比亞血平板2種選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，用聚合酶鏈式反應(PCR)鑒定，最后參照2010年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴散法進行藥敏試驗。結(jié)果從烏魯木齊牛場肛拭子分離鑒定到1株空腸彎曲菌(編號為N22)，檢出率為1.11%(1/90)；昌吉牛場肛拭子分離鑒定到1株空腸彎曲菌(編號為C25)，檢出率為3.33%(1/30)。石河子牛場肛拭子沒有分離到空腸彎曲菌。2株空腸彎曲菌對單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素高度敏感；對喹諾酮類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥。結(jié)論新疆牛群存在空腸彎曲菌的感染，感染菌株可用單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素進行防治。研究結(jié)果可為評價新疆牛群空腸彎曲菌的流行狀況和制定防控措施提供科學依據(jù)。

空腸彎曲菌；PCR；分離鑒定；耐藥性檢測

0 引 言

【研究意義】空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是一種重要病原菌，是可以引起細菌性腹瀉的革蘭氏陰性菌，通常為弧形、螺旋形、海鷗展翅形或S形[1-2]，是世界范圍內(nèi)一種重要的人畜共患病性病原細菌[3]，該菌不僅可引起人畜腹瀉、還可引起發(fā)燒和腹部絞痛、急性腸炎[4]，嚴重時可引發(fā)肝炎等嚴重的并發(fā)癥。對新疆地區(qū)牛源空腸彎曲菌流行情況和耐藥性進行調(diào)研，為及時監(jiān)測和防治該病的爆發(fā)以及用藥方案提供依據(jù)。【前人研究進展】我國目前沒有將空腸彎曲菌列入監(jiān)測范圍，雖然將此病列為法定丙類傳染病之一，但是對空腸彎曲菌的研究也沒有發(fā)達國家深入[5]。雖然在牛、豬等家畜體內(nèi)可分離到此菌，但是該菌主要存在于家禽、野禽空腸內(nèi)，因此，雞源空腸彎曲菌的分離率最高可達100%[6]。該菌通過帶菌動物或患病者的糞便進入環(huán)境中，也可通過分娩或排泄物污染食物和飲水，在外環(huán)境中以一種“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”狀態(tài)(viable but non-culturable)生存，即VBNC 狀態(tài)。處于此狀態(tài)的空腸彎曲菌在一定的條件下可以復蘇并使人畜患病。人感染空腸彎曲菌的原因主要是食入被污染的肉制品、奶制品，或與寵物的接觸[7]。發(fā)展中國家的空腸彎曲菌流行情況與國外不同。在發(fā)展中國家，此前導致腹瀉的常見病原菌是沙門氏菌和志賀菌，但近年來空腸彎曲菌的感染率已超過這兩種病原菌，因此，空腸彎曲菌被認為是主要的食源性致病菌之一[8]。在發(fā)達國家中，空腸彎曲菌的感染率僅低于這兩種病原菌。空腸彎曲菌的培養(yǎng)條件苛刻，需在微需氧環(huán)境下(N2:85%，CO2:10%，O2:5%)，42℃培養(yǎng)48 h。其在25℃時不能生長。42℃生長良好[9]?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有文獻資料尚無新疆牛源空腸彎曲菌的分離鑒定。對新疆部分地區(qū)牛源肛拭子進行空腸彎曲菌的分離鑒定和耐藥性分析，研究其流行傳播規(guī)律及制定用藥方案?！緮M解決的關鍵問題】研究調(diào)查新疆部分地區(qū)牛源空腸彎曲菌流行情況，為相關部門對該病的監(jiān)測及用藥提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑

布氏肉湯，改良CCD瓊脂基礎(CCDA)、彎曲菌分離瓊脂添加劑(頭孢哌酮、兩性霉素B、利福平)、哥倫比亞血平板均購自青島日水生物技術有限公司網(wǎng)絡銷售分公司；P-49頭孢哌酮、Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術有限責任公司；MH(B)培養(yǎng)基、瓊脂粉購自北京奧博星生物技術有限責任公司。革蘭氏染色及PCR相關試劑(mix、滅菌dd H2O、2000Marker)均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司;空腸彎曲菌標準菌株(ATCC33291)購自上海復祥生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺；Mastercycler nexus X1 PCR儀(Eppendorf)；GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad伯樂公司)。DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集

從烏魯木齊市、昌吉市、石河子市共采集牛肛拭子171份，放入Cary-Blair氏運送培養(yǎng)基，24 h內(nèi)對其進行分離培養(yǎng)。其中烏魯木齊采集了90份(N1～N90)、昌吉市采集了30份(C1～C30)、石河子采集了51份(S1～S51)。

1.2.2 引物設計

根據(jù)參考文獻[10]選用16S rDNA片段，引物序列見表1。

表1 引物序列
Table 1 Primer sequences

基因Genes引物序列(5’→3’)Primersequences退火溫度(℃)Annealingtemperature片段長度(bp)Fragmentsize16SrDNAF：AATCACTGGGCGTAAAGGR：CGGTATTGCGTCTCATTGTAT59711

1.2.3 細菌培養(yǎng)

每個EP管分裝500 μL滅菌生理鹽水，將牛肛拭子從運送培養(yǎng)基中取出，放入EP管中。浸透20 min，每隔5 min震蕩一次，將浸液加至含 9.5 mL布氏肉湯的搖菌管中，置微需氧培養(yǎng)罐中，42℃培養(yǎng)4 h后每個搖菌管添加20 μL 30 mg/L頭孢哌酮溶液，置微需氧培養(yǎng)罐中，42℃培養(yǎng)48 h±4 h。

1.2.4 選擇性培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取布氏肉湯增菌液并用劃線法接種于改良CCD瓊脂基礎(每100 mL CCD瓊脂基礎添加一支彎曲菌分離瓊脂添加劑)，置微需氧培養(yǎng)罐中，42℃培養(yǎng)48 h。

挑取改良CCD瓊脂基礎上灰白色，扁平，濕潤，沿劃線生長的可疑單菌落接種于哥倫比亞血平板，微需氧環(huán)境下，42℃培養(yǎng)48 h。

1.2.5 PCR鑒定

模板的制備:每個搖菌管分裝10 mL布氏肉湯，挑取哥倫比亞血平板上可疑單菌落接種至搖菌管中，微需氧條件下42℃培養(yǎng)48 h，吸取500 μL布氏肉湯增菌液至1.5 mL EP管中，8 000 r/min 離心5 min，棄上清，加100 μL滅菌dd H2O震蕩重懸，隔水煮沸10 min后立即置于冰盒。10 min后8 000 r/min離心3 min，取上清PCR或者置-20℃保存。PCR反應體系為25 μL：11 μL Mix,10 μL滅菌ddH20,上下游引物各1 μL,模板2 μL) 。循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠，7 μL PCR產(chǎn)物加樣，130 V電壓電泳20 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。并將PCR產(chǎn)物送于生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.6 藥敏試驗

試驗對分離的2株牛源空腸彎曲菌進行了6大類17 種藥物進行耐藥性檢測。參照2010年美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦使用的瓊脂擴散法進行藥敏試驗[11]。青霉素類：氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PIP)；頭孢菌素類：頭孢呋辛(FRX)、頭孢噻吩(CEP)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢曲松(CTRX)、頭孢西叮(FOX)、頭孢唑啉(CZO)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)；單環(huán)β內(nèi)酰胺類：氨曲南(AZT)；氨基糖苷類：鏈霉素(STR)、妥布霉素(TOB)、卡那霉素(KAN)；喹諾酮類：氧氟沙星(OFLX)；大環(huán)內(nèi)酯類：麥迪霉素(MID)。配制MH培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌鍋高壓20 min(121℃，100 kPa)。放置60℃水浴鍋20 min，在超凈臺內(nèi)倒板，將100 μL在625 nm處吸光度值為0.08～0.10的彎曲菌培養(yǎng)液均勻涂布于MH瓊脂平板上,取藥敏片貼到培養(yǎng)基表面。將培養(yǎng)皿放入微需氧培養(yǎng)罐，42℃溫箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定結(jié)果

經(jīng)過改良CCD瓊脂基礎和哥倫比亞血瓊脂的鑒別培養(yǎng)，對得到的可疑菌進行16S rDNA的特異性PCR擴增，在711 bp得到兩條單一條帶，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)NCBI (National Center for Biotechnology Information)比對，表明2株分離菌與空腸彎曲菌YH002(ID: CP020776.1)同源性達到100%，確定2株分離菌為空腸彎曲菌。從烏魯木齊牛場肛拭子分離鑒定到1株空腸彎曲菌(編號為N22)檢出率為1.11%；從昌吉市牛場肛拭子中分離鑒定到1株空腸彎曲菌(編號為C25)，檢出率為3.33%，從石河子市牛源肛拭子中沒有分離到空腸彎曲菌。圖1～3

圖1 空腸彎曲菌在改良CCD瓊脂基礎菌落形態(tài)
Fig.1 Colonies of Campylobacter jejuni on improved CCD agar base

圖2 空腸彎曲菌在哥倫比亞血平菌落形態(tài)
Fig.2 Colonies of Campylobacter jejuni on Colombian blood plate

注：M，DL2000 DNA Marker；1，標準陽性菌株；2，N22；3，C25，4，陰性對照

Note: M，DL2000 DNA Marker；1，Positive control strain；2，N22；3，C25；4，Negative control

圖3 16S rDNA基因擴增部分結(jié)果
Fig.3 The part of PCR amplification results of 16S rDNA gene

2.2 藥敏試驗結(jié)果

分別測量各紙片抑菌環(huán)直徑(mm)(如圖4)，按照CLSI判定標準分別判為耐藥(R)、中敏(I)或高敏(S)。

從烏魯木齊牛場肛拭子分離到的1株空腸彎曲菌對氨基糖苷類的鏈霉素、妥布霉素及小部分頭孢哌酮抗生素較為敏感；對青霉素類、單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類的卡那霉素高度敏感；對喹諾酮類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥。從昌吉牛場肛拭子分離到的1株空腸彎曲菌對青霉素類、氨基糖苷類的妥布霉素和卡那霉素及小部分頭孢哌酮抗生素較為敏感；對單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類的鏈霉素高度敏感；對喹諾酮類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥。結(jié)果顯示，兩個地區(qū)分離到2株空腸彎曲菌對單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素高度敏感；對喹諾酮類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥。表2

圖4 藥敏試驗抑菌圈直徑
Fig.4 The diameter of inhibition zone in drug susceptibility test

表2 藥敏試驗結(jié)果
Table 2 The results ofdrug susceptibility test

類別Category抗生素及簡寫Antibiotics抑菌圈直徑判斷標準(mm)陽性菌抑菌圈直徑(mm)耐藥(R)中敏(I)高敏(S)C25N22青霉素類氨芐西林(AMP)≤1314-16≥1714 1I19 0S哌拉西林(PIP)≤1718-20≥2119 9I21 8S頭孢菌素類頭孢呋辛(FRX)≤1415-17≥1814 2R12 1R頭孢噻吩(CEP)≤1415-17≥1813 5R10 5R頭孢哌酮(CFP)≤1516-20≥219 0R8 7R頭孢他啶(CAZ)≤1415-17≥1816 0I14 5R頭孢曲松(CTRX)≤1314-20≥2113 2R14 3I頭孢西叮(FOX)≤1415-17≥189 9R15 2I頭孢唑啉(CZO)≤1415-17≥1814 3R13 6R頭孢吡肟(FEP)≤1415-17≥1814 3R9 6R頭孢噻肟(CTX)≤1415-22≥2316 7I21 9I單環(huán)β內(nèi)酰胺類氨曲南(AZT)≤1516-21≥2225 0S25 0S氨基糖苷類鏈霉素(STR)≤1112-14≥1516 0S14 9I妥布霉素(TOB)≤1213-14≥1514 0I14 5I卡那霉素(KAN)≤1314-17≥1816 1I18 0S喹諾酮類氧氟沙星(OFLX)≤1213-15≥1612 2R10 9R大環(huán)內(nèi)酯類麥迪霉素(MID)≤1314-17≥188 1R0R

3 討 論

牛肉是我國居民消費量比較大的肉類，在西方發(fā)達國家，常有因為食用未徹底滅菌的牛奶和牛肉而引起空腸彎曲菌感染的案例，美國威斯康辛州在2001年爆發(fā)空腸彎曲病，原因是人們認為生牛奶及未全熟的牛肉的口感和營養(yǎng)價值更高。我國居民飲用生牛奶及牛肉的很少，因此，空腸彎曲菌的發(fā)病率很低[12]。但是近年來，發(fā)展中國家的感染率呈上升趨勢,如尼日利亞,1984年到1994年10年間，腹瀉兒童中彎曲菌感染率為從5.2%增至16.5%[13]。國內(nèi)報道幼兒園健康兒童空腸彎曲菌帶菌率為2.92%～3.8%[14]。

實驗中，烏魯木齊牛源肛拭子的采集時間在10月，空腸彎曲菌的檢出率為1.11%；昌吉牛場肛拭子的采集時間在6～7月，空腸彎曲菌的檢出率為3.33%。石河子牛場肛拭子的采集時間在12月，沒有分離到空腸彎曲菌。黃金林等[15]檢測了不同地區(qū)30個雞群空腸彎曲桿菌流行情況，結(jié)果表明，雞群中普遍感染空腸彎曲菌，但不同地區(qū)的雞場感染率差別較大。該病流行的季節(jié)性不一，有研究表明溫暖季節(jié)陽性率較寒冷季節(jié)高，傾向于 7～9月最高。吳光先(1990)于不同季節(jié)宰殺雞時采取其盲腸內(nèi)容物分離該菌，其中春季檢出率最高達到63.9%，冬季為檢出率低至54.8%[16]。因此，烏魯木齊牛場與昌吉牛場不同的空腸彎曲菌檢出率可能是由于空腸彎曲菌感染率春夏季高、秋冬季低[14]與地區(qū)不同兩方面因素導致。

張弓等[17]對從鵝體內(nèi)分離到的54 株空腸彎曲菌及從鴨子體內(nèi)分離到的36 株空腸彎曲菌進行8大類20種抗生素藥敏試驗，結(jié)果表明，鵝源與鴨源空腸彎曲菌分離株對青霉素G、部分頭孢菌素類、喹諾酮類、磺胺類和四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生了較強的耐藥性。吳忠亮[18]對133 株不同來源的空腸彎曲菌藥敏實驗結(jié)果表明，空腸彎曲菌對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)脂類抗生素較為敏感，對喹諾酮類、磺胺類、四環(huán)素類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了耐藥性。謝永強等[19]對廣州地區(qū)2010～2014年4年間2 088例腹瀉患兒糞便標本中共檢出154株空腸彎曲菌，該地區(qū)兒童感染空腸彎曲菌對氨基糖苷類藥物敏感。侯鳳琴等[20]對200株空腸彎曲菌檢測30種抗生素敏感性，研究結(jié)果顯示該菌對氨基糖苷類、氯霉素尚沒有耐藥菌株。研究結(jié)果表明，兩個地區(qū)分離到的空腸彎曲菌對單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素高度敏感，對喹諾酮類抗菌藥物、大環(huán)內(nèi)酯類、大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了耐藥，與大量研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

從烏魯木齊牛源肛拭子中分離鑒定到1株陽性菌(編號為N22)，檢出率為1.11%；從昌吉牛場分離鑒定到1株陽性菌(編號為C25)，檢出率為3.33%，石河子牛場沒有分離到空腸彎曲菌。兩個地區(qū)分離到的空腸彎曲菌對單環(huán)β內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類抗生素高度敏感；對喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類和大部分頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生了不同程度的耐藥。需做好空腸彎曲菌污染情況的調(diào)查，并合理指導各地防治空腸彎曲菌病用藥方案，提高公共衛(wèi)生安全。

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Abstract：【Objective】 To study the prevalence of campylobacter jejuni from cattle in partial areas of Xinjiang and its drug resistance.【Method】In this experiment, 171 fecal samples were collected from cattle in Urumqi, Changji and Shihezi. After the initial enrichment of Brucella broth, the culture medium was cultured with two improved media, namely, the improved CCD agar base and the Columbia blood plate, and finally identified by polymerase chain reaction (PCR). Finally, the agar diffusion method recommended by the United States Clinical Laboratory Standardization Institute (CLSI) in 2010 was used for drug susceptibility test.【Result】A strain of Campylobacter jejuni (No. N22) was isolated from the Urumqi cattle farm and the detection rate was 1.11%(1/90). A strain of Campylobacter jejuni (No.C25) was identified from Changji cattle farmand the detection rate was 3.33%(1/30).There were no strains of Campylobacter jejuni isolated from Shihezi cattle farm. 2 strains of Campylobacter jejuni were highly sensitive to monocyclic beta lactam and aminoglycoside antibiotics,and showing different degrees ofresistenceto quinolones, macrolides and most of the cephalosporins antibiotics.【Conclusion】The infection of campylobacter jejuni was found from cattle in Xinjiang, and the infection strains could be used to prevent and cure with monobactam and aminoglycoside antibiotics. The results can provide a scientific basis for the evaluation of the prevalence of campylobacter jejuni and the prevention and control measures in Xinjiang cattle herds.

Keywords: campylobacter jejuni; PCR; isolation and identification; drug resistance test

Isolation，IdentificationandDrugResistanceDetectionofCampylobacterJejunifromCattleinPartialAreasofXinjiang

DAI Jing, PENG Bin, LEI Chen-hong, Aray Hayrat

(CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China)

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.09.020

S85

A

1001-4330(2017)09-1730-07

2017-04-25

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目“新疆牛源彎曲菌污染分布規(guī)律及分離株遺傳多樣性研究”(2015211A021)

代婧(1993-)，女，新疆石河子人，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，(E-mail)1730220547@qq.com

彭斌(1976-)，男，四川資中人，講師，碩士，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，(E-mail)pengbinwho@163.com 雷程紅(1967-)，女，安徽六安人，副教授，博士，研究方向為獸醫(yī)免疫學，(E-mail)leichxjnd@aliyun.com

Supported by: Natural Science Foundation of Xinjiang "Study of the Distribution Regularity and Genetic Diversity of Campylobacter from Cattle in Xinjiang"(2015211A021)

Corresponding author：PENG Bin (1976-), male, native place: Zizhong, Sichuan, lecturer, master's degree, research field: Quality and safety of animal products. (E-mail) pengbinwho@163.com LEI Chen-hong (1967-), female, native place: Liuan, Anhui, Associate Professor, Ph.D., research field: Veterinary immunology, (E-mail) leichxjnd@aliyun.com