新型糖尿病治療藥物西他列汀制備技術(shù)研究進(jìn)展

章鵬鵬，孟凡婷，牛婷婷，王 普

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

新型糖尿病治療藥物西他列汀制備技術(shù)研究進(jìn)展

章鵬鵬，孟凡婷，牛婷婷，王 普*

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

西他列汀是首個(gè)二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑的II型糖尿病治療藥，該藥物的制備技術(shù)主要經(jīng)歷了三代工藝路線的發(fā)展。本文主要綜述了西他列汀的制備技術(shù)，以及生物催化法應(yīng)用于西他列汀的合成工藝路線，并對(duì)今后西他列汀制備技術(shù)的發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

西他列??；II型糖尿??；生物催化法

0 引言

近年來(lái)，糖尿病發(fā)病率逐年提高。糖尿病已成為繼心血管類疾病、惡性腫瘤后又一嚴(yán)重威脅人類健康的非傳染性疾病。而糖尿病的II型發(fā)病率占90%。II型糖尿病的發(fā)病機(jī)制主要是因?yàn)槿藱C(jī)體對(duì)胰島素的抗性和胰島素β細(xì)胞的功能缺陷所引發(fā)的[1]。臨床上用于II型糖尿病治療藥主要有胰島素分泌促進(jìn)劑 （磺酰脲類、氯茴苯酸類）、胰島素增敏劑（雙胍類、噻唑烷二酮類）、胰島素及胰島素受體激動(dòng)劑和二肽基肽酶-4 （DPP-4）抑制劑。

西他列汀 （Sitagliptin，JanuviaR），化學(xué)名稱為：（3R）-3-氨基-1-[3-（三氟甲基）-5，6，7，8-四氫-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪-7-基]-4-（2，4，5-三氟苯基）丁-1-酮，英文名稱為（3R）-3-Amino-1-[3-（trifluoromethyl） -5，6，7，8-tetrahydro-1，2，4-triazolo[4，3-a]pyrazin-7-yl]-4-（2，4，5-trifluorophenyl）butan-1-one， 它是由 Merck Sharp&Dohme Ltd公司開(kāi)發(fā)的首個(gè)二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑，是II型糖尿病口服治療藥捷諾維（鹽酸西他列汀片，JANUVIA）的活性成分，該藥在2006年10月于美國(guó)上市。西他列汀是一種二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制劑，通過(guò)酰胺部分與DPP-4活性部分結(jié)合（結(jié)合模式圖見(jiàn)圖1），抑制其活性延長(zhǎng)降血糖素（Incretin）[2]的半衰期，使得血漿中GLP-1和GIP活性提高的同時(shí)只是輕度增加其含量，卻不會(huì)引起因GLP-1含量過(guò)高而產(chǎn)生的副作用，具有較好的安全性和耐受性[3-5]。在聯(lián)合用藥方面，與二甲雙胍[6]或吡格列酮[7]聯(lián)合用藥時(shí)均優(yōu)于其各自單獨(dú)用藥。臨床上對(duì)于西他列汀的應(yīng)用相比于同類藥物其用藥優(yōu)勢(shì)突出，基于其良好的市場(chǎng)前景，西他列汀具有較好的研究?jī)r(jià)值。近年來(lái)，對(duì)于西他列汀用藥的需求增加，西他列汀的制備技術(shù)受到廣泛關(guān)注。本文主要綜述了西他列汀的三代制備工藝路線的發(fā)展，并介紹了生物催化法應(yīng)用于合成西他列汀的制備工藝。

1 西他列汀的三代制備工藝路線

西他列汀在工業(yè)化生產(chǎn)前在實(shí)驗(yàn)室研究階段的合成路線，以及工業(yè)化生產(chǎn)的第一代和第二代的合成工藝路線合成過(guò)程每一步都經(jīng)過(guò)化學(xué)合成而成。第三代工藝路線中將生物催化法應(yīng)用于合成路線，使得西他列汀的產(chǎn)率和e.e.值都有明顯的提高。

圖1 西他列汀與DPP-IV活性部位結(jié)合Figure 1 Mechanism of Sitagliptin involving the active site of DPP-IV

1.1 西他列汀處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的制備工藝由Kim等[5]發(fā)表的處于實(shí)驗(yàn)室研究階段的合成路線較為繁瑣，所需的反應(yīng)條件苛刻，需要低溫及較長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)路線中部分使用的試劑也較昂貴，因此該反應(yīng)路線并沒(méi)有用于實(shí)際的工業(yè)化的生產(chǎn)。

1.2 西他列汀第一代制備工藝的合成路線

用于西他列汀工業(yè)化生產(chǎn)的第一代合成路線是由Hansen等人[8]采用手性磷根釕催化劑催化合成的化學(xué)合成路線。其路線圖如圖2所示，該反應(yīng)路線是由 4-（2，4，5-三氟苯基）-3-氧代丁酸甲酯（1）經(jīng)手性金屬催化劑（S）-聯(lián)萘二苯膦-氯化釕[（S）-binap-RuCl2]催化不對(duì)稱加氫后，于氫氧化鈉的甲醇溶液中水解，得水解產(chǎn)物（2），（2）在N-乙基-N-二甲胺基丙胺碳二亞胺鹽酸鹽（EDC-HCl）作用下，與O-芐基羥胺經(jīng)縮合后，在三苯基膦和偶氮二甲酸二異丙酯（DIAD）的作用下環(huán)合得到 β-內(nèi)酰胺類化合物（3），（3）經(jīng)氫氧化鋰水溶液水解開(kāi)環(huán)得（4），（4）與 3-（三氟甲基）-l，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪（5）縮合后、脫去保護(hù)基團(tuán)，即得西他列汀。

圖2 第一代合成路線Fig 2 1st Generation process

1.3 西他列汀第二代制備工藝的合成路線

西他列汀的第二代合成路線[9]是由美國(guó)默沙東公司開(kāi)發(fā)的采用手性銠作催化劑構(gòu)建手性中心的化學(xué)合成路線，該路線較之前降低了生產(chǎn)成本； 以 2，4，5-三氟苯乙酸 （7） 與 2，2-二甲基-1，3-二噁烷-4，6-二酮 （8）縮合后生成化合物（9），（9）與 3-（三氟甲基）-1，2，4-三唑并[4，3-a]吡嗪（5）縮合后得到（2Z）-4-氧代-4-[3-（三氟甲基）-5，6-二氫-[1，2，4] 三唑并 [4，3-a] 吡嗪-7-（8H）-基]-1-（2， 4，5-三氟苯基） 丁-2-酮（10），（10）與乙酸銨作用得烯胺，烯胺在二聚氯代（l，5-環(huán)辛二烯）銠[{Rh（cod）Cl}2]和（R）-（-）-[（S）-2-[二（4-三氟甲基苯基）膦]二茂鐵基乙基-2-叔丁基膦（R，S-t-bujosiphos）的作用下發(fā)生不對(duì)稱加氫反應(yīng)，得到西他列汀。

1.4 第三代合成路線

西他列汀的第三代合成路線[10]是在第二代化學(xué)合成法的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了工藝，利用了突變轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建手性中心的方法開(kāi)發(fā)了綠色環(huán)保的新型生物催化合成路線。將西他列汀中間體（2Z）-4-氧代-4-[3-（三氟甲基）-5，6-二氫-[1，2，4]三唑并[4，3-a]吡嗪-7-（8H）-基]-1-（2，4，5-三氟苯基）丁-2-酮（10），通過(guò)突變轉(zhuǎn)氨酶ATA117的轉(zhuǎn)氨基作用，直接將（10）合成為西他列汀。將轉(zhuǎn)氨酶法運(yùn)用于第三代合成路線，其產(chǎn)率較第二代的合成路線提高了53%，e.e.值也提高至99.95%，同時(shí)廢物的排放也減少了19%。

圖3 第二代和第三代合成工藝路線Fig 3 2nd Generation process and 3rd generation process

2 生物催化法在西他列汀制備工藝中的應(yīng)用

2.1 轉(zhuǎn)氨酶法

轉(zhuǎn)氨酶（aminotransferases，EC 2.6.1.X），屬于轉(zhuǎn)移酶類，是以輔因子磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate，PLP）為氨基轉(zhuǎn)移媒介，通過(guò)可立體選擇性催化氨基供體（氨基酸或簡(jiǎn)單胺類）的氨基轉(zhuǎn)移到潛手性受體酮來(lái)獲得目的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)氨酶主要用于手性胺、手性氨基酸、手性氨基醇的制備及重氫手性標(biāo)記。

在三代的合成路線中，Savile等[10]利用生物催化法通過(guò)突變轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建手性中心，從而使得合成工藝得到大幅度的優(yōu)化。其過(guò)程是采用計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)研究底物與酶的分子識(shí)別機(jī)理，發(fā)現(xiàn)西他列汀前體酮對(duì)應(yīng)的兩個(gè)大口袋酶結(jié)合位點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)立體識(shí)別并完成反應(yīng)的關(guān)鍵。利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)，在野生型ω-轉(zhuǎn)氨酶的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行定向改造，經(jīng)由底物結(jié)構(gòu)的理性化設(shè)計(jì)和同源酶模型ATA-117的迭代突變重組，先后對(duì)酶的兩個(gè)大口袋位點(diǎn)進(jìn)行組合突變定向改造，經(jīng)11輪定向進(jìn)化后篩選獲得27位點(diǎn)突變的新酶氨基酸序列。重組酶易于表達(dá)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性均良好，能以廉價(jià)的異丙胺為氨基供體，耐受高濃度的DMSO（底物助溶劑），催化效率高。當(dāng)酶添加量為6 g/L，24 h可實(shí)現(xiàn)200 g/L底物完全轉(zhuǎn)化，e.e.值＞99.5%。但是該轉(zhuǎn)氨酶生物催化劑開(kāi)發(fā)改造過(guò)程難度大，突變篩選通量大，改造風(fēng)險(xiǎn)和投入成本高。

2.2 間接合成，羰基還原酶法合成關(guān)鍵手性中間體

Cardila Healthcare Limited公司設(shè)計(jì)了手性胺的間接合成路線（見(jiàn)圖4），同樣以西他列汀前體酮化合物OTPP為底物，利用重組羰基還原酶催化不對(duì)稱還原合成中間體（S）-HTPP而獲得手性中心，再分別與甲磺酰氯、疊氮化鈉反應(yīng)替換該手性中心的羥基后，與Pd/c和硼氫化鈉反應(yīng)即可獲得西他列汀[11]。

圖4 手性胺的間接合成路線Fig 4 Indirect synthesis of chiral amines

以全細(xì)胞為催化劑不對(duì)稱還原前體酮制備手性醇研究已經(jīng)十分成熟，且將羰基還原酶法運(yùn)用于該合成路線具備工藝的可行性，相關(guān)工藝也易于開(kāi)發(fā)。故通過(guò)生物法不對(duì)稱還原前體酮化合物OTPP制備該手性醇中間體（S）-HTPP（如圖5）的研究便有著重要的意義。目前所報(bào)道的有Biocon Limited公司[12]利用真菌微生物短密青霉（Penicillium brevicompactum）MTCC 5962催化OTPP進(jìn)行生物催化還原。

圖5 全細(xì)胞催化OTPP制備手性醇中間體（S）-HTPPFig 5 Preparation of chiral alcohol intermediates（S） -HTPP by whole cell catalysis

針對(duì)相同的還原底物，筆者所在課題組[13]自行篩選得到了具有高立體選擇性制備西他列汀關(guān)鍵手性中間體（S）-HTPP的菌種——小孢根霉須狀變種 （Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis）ZJPH1308。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?1~10 mmol/L時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)95%以上，提高底物濃度至15 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率最高為85%；至20 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率最高達(dá)到72%。而其e.e.值都保持＞99%。另外，本課題組還從土壤中篩選得到一株惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）YHB3-10也可用于催化相同的反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mmol/L時(shí)，反應(yīng)24 h后產(chǎn)率為91.49%。當(dāng)?shù)孜餄舛忍岣咧?2.5mmol/L，并且在反應(yīng)介質(zhì)體系中加入5%（v/v）的鄰苯二甲酸二丁酯，產(chǎn)率可達(dá)75.61%，較未添加的對(duì)照提高了 31.7%，e.e.值＞99%[14]。

Xia等[15]利用篩選得到的假單胞菌（Pseudomonas Pseudoalcaligenes）靜息細(xì)胞在DMSO溶劑中不對(duì)稱還原OTPP合成（S）-HTPP，并且菌體細(xì)胞可實(shí)現(xiàn)重復(fù)批次利用。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5 mmol/L時(shí)，產(chǎn)率達(dá)90%以上，e.e.值＞99%。

3 結(jié)論與展望

近年來(lái)，人們?cè)谖镔|(zhì)生活水平快速提升的同時(shí)，II糖尿病的發(fā)病率也逐年提高，對(duì)人類的健康問(wèn)題的威脅也在逐漸增大。西他列汀是目前II糖尿病的首選治療藥，有著較好的市場(chǎng)前景，其開(kāi)發(fā)上市和制備技術(shù)的發(fā)展受到廣泛的關(guān)注。目前對(duì)于西他列汀的制備技術(shù)雖然已較為成熟但仍存在不足，所以對(duì)于西他列汀的制備技術(shù)的開(kāi)發(fā)仍值得研究。生物催化法在化合物合成上因其能避免一些化學(xué)法所必須的苛刻條件等優(yōu)勢(shì)，因此得到了廣泛的應(yīng)用。如何更好地將生物法運(yùn)用于西他列汀制備的工藝路線中是未來(lái)研究的方向。

[1] 孫志，馬麗，邱玉芹，等.2型糖尿病發(fā)病機(jī)制及胰島β細(xì)胞功能障礙的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2008，14（9）:1371-1373.

[2] Idris I，Donnelly R.Dipeptidyl peptidase-IV inhibitors:a major new class of oral antidiabetic drug[J].Diabetes，Obesity and Metabolism， 2007， 9（2）:153-165.

[3] Mu J， Woods J， Zhou Y P， et al.Chronic inhibition of dipeptidyl peptidase-4 with a sitagliptin analog preserves pancreaticβ-cellmass and function in a rodentmodel of type 2 diabetes[J].Muppidi Daniel JMD in Northborough，2006，5:1695-1704.

[4]Barnett A.DPP-4 inhibitors and their potential role in the management of type 2 diabetes[J].International Journal of Clinical Practice， 2006， 60（11）:1454-1470.

[5]Kim D，Wang L P，BeconiM，et al.（2R）-4-Oxo-4-[3-（trifluoromethyl） -5，6-dihydro[1，2，4]triazolo[4，3-a]pyrazin-7 （8H）-yl]-1-（2，4，5-trifluorophenyl）butan-2-amine:a potent，orally active dipeptidyl peptidase IV inhibitor for the treatment of type 2 diabetes[J].Journal of Medicinal Chemistry， 2005， 48:141-151.

[6] Charbonnel B，Karasik A，Liu J，et al.Efficacy and safety of the dipeptidyl peptidase-4 inhibitor sitagliptin added to ongoing metformin therapy in patients with type 2 diabetes inadequately controlled with metformin alone[J].Diabetes Care， 2006， 29（12）:2638-2643.

[7]Rosenstock J， Brazg R， Andryuk P J， et al.Efficacy and safety of the dipeptidyl peptidase-4 inhibitor sitagliptin added to ongoing pioglitazone therapy in patients with type 2 diabetes:a 24-week， multicenter， randomized， doubleblind， placebo-controlled， parallel-group study[J].Clinical Therapeutics， 2006， 28（10）:1556-1568.

[8] Hansen K B， Balsells J， Dreher S， et al.First generation process for the preparation of the DPP-IV inhibitor Sitagliptin[J].Organic ProcessResearch&Development，2005， 9（5）:634-639.

[9]Dreher SD，Ikemoto N，Gresham V，etal.Highly selective synthesis of 2-substituted-5-hydroxy-6-oxo-1，6-dihydropyrimidine-4-carboxylic acid derivatives using a novel protected dihydroxyfumarate[J].Tetrahedron Letters， 2004，45（31）:6023-6025.

[10]Savile C K，Janey JM，Mundorff E C，et al.Biocatalytic asymmetric synthesis of chiral amines from ketones applied to sitagliptin manufacture[J].Science， 2010， 329（5989）:305-309.

[11]Mendirata S K，Pandey B，Joshi R，et al.Process for preparing an intermediate of sitagliptin via enzymatic conversion:WO，2012/046254A2[P].2012-04-12.

[12]Singh S， Saravanan J， Despande S， et al.Fungal stereoselective reduction of keto intermediates of pharmaceutically active compounds to their corresponding hydroxy compounds:WO，2015/071861A2[P].2015-05-21.

[13]Sun J， Huang J， Ding X Z， et al.Efficient enantioselective biocatalytic production of a chiral intermediate of sitagliptin by a newly filamentous fungus isolate[J].Applied Biochemistry and Biotechnology， 2016， 18（4）:695-706.

[14]孫佳.生物催化不對(duì)稱合成西他列汀關(guān)鍵手性中間體[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2016.

[15]Wei Y C，Xia SW，He C L，et al.Highly enantioselective production of a chiral intermediate of sitagliptin by a novel isolate of Pseudomonas pseudoalcaligenes[J].Biotechnology Letters， 2016， 38（5）:841-846.

Abstract：Sitagliptin is the firstdipeptidylpeptidase-4 （DPP-4） inhibitor type IIdiabetesdrug.The developmentof this drug after themarkethas gone through three generations of the development process line.In this paper,the preparation technology of sitagliptin and the biocatalytic method applied in the synthesis of sitagliptin weremainly introduced.The future development of sitagliptin preparation technology was also discussed.

Keywords：Sitagliptin；type 2 diabetes；biocatalysis

Research Progress in Preparation Technique of Type 2 Diabetes Drug Sitagliptin

ZHANG Peng-peng，MENG Fan-ting，NIU Ting-ting，WANG Pu*
（College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou，Zhejiang 310014，China）

1006-4184（2017）9-0015-05

2017-02-22

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY16B060010）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21676250)資助。

章鵬鵬(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：生物催化與手性合成。

*通訊作者：王普，女，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:wangpu@zjut.edu.cn